Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Ruben M. Sandoval; Bruce A. Molitoris

doi:10.3791/50052

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50052

⸱

17 kwietnia 2013

Ruben M. Sandoval¹ , Bruce A. Molitoris¹

¹Medicine/Nephrology, Indiana University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Technika wykorzystująca mikroskopię 2-fotonową intavital o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określenia filtracji gloemrarnej w kłębuszkach nerkowych na powierzchni. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie charakterystyk przepuszczalności makrocząsteczek zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

Streszczenie

Choroby nerek polegające na utracie w moczu dużych niezbędnych makrocząsteczek, takich jak albumina surowicy, od dawna uważane są za spowodowane zmianami w barierze przepuszczalności składającej się z podocytów, komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i błony podstawnej, które działają zgodnie. Dane z naszego laboratorium przy użyciu przyżyciowej mikroskopii 2-fotonowej ujawniły bardziej przepuszczalną barierę filtracyjną kłębuszków nerkowych (GFB) niż wcześniej sądzono w warunkach fizjologicznych, z odzyskiwaniem przefiltrowanej albuminy zachodzącej we wczesnej podgrupie komórek zwanej komórkami kanalików proksymalnych (PTC)^1,2,3.

Poprzednie techniki używane do badania filtracji nerkowej i ustalania charakterystyki bariery filtracyjnej obejmowały mikronakłuwanie światła tych wczesnych segmentów rurkowych z próbkowaniem zawartości płynu i analizą⁴. Badania te wykazały, że stężenie albuminy w płynie luminalnym praktycznie nie istnieje; odpowiadające ściśle temu, co jest zwykle wykrywane w moczu. Jednak charakterystyka polimerów dekstranu o określonych rozmiarach za pomocą tej techniki ujawniła, że te o wielkości podobnej do albuminy surowicy miały wyższe poziomy w świetle kanalików i moczu; Sugerowanie zwiększonej przepuszczalności⁵.

To szczegółowy zarys techniki używanej do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określania przepuszczalności albuminy fluorescencyjnej kłębuszków nerkowych in vivo. Metoda ta pozwala na wykrycie przefiltrowanej albuminy przez barierę filtracyjną do przestrzeni Bowmana (początkowa komora filtracji moczu); a także umożliwia ilościowe określenie reabsorpcji albuminy przez kanaliki proksymalne i wizualizację późniejszej transcytozy albuminowej⁶. Brak albuminy fluorescencyjnej wzdłuż późniejszych segmentów kanalików w drodze do pęcherza moczowego podkreśla skuteczność szlaku pobierania we wcześniejszych segmentach kanalików proksymalnych. Ponadto, gdy technika ta została zastosowana do określenia przepuszczalności dekstransu o wielkości podobnej do albuminy, podano praktycznie identyczne wartości przepuszczalności². Obserwacje te bezpośrednio potwierdzają potrzebę rozszerzenia zainteresowania wielu białkomoczowych chorób nerek na uwzględnione zmiany w regeneracji komórek kanalików proksymalnych.

Protokół

1. Koniugacja albuminy surowicy szczura z chlorkiem sulfonylu sulfo-rodaminy 101 (Texas Red)

Rozpuścić 100 mg albuminy surowicy szczurzej (RSA) w 6,667 ml 100 mM wodorowęglanu sodu o pH 9,0; końcowe stężenie 15 mg/ml w 50 ml probówce stożkowej.
Umieścić roztwór w bezku z lodem/wodą i schłodzić do temperatury od 0 do 4 °C.
Dodać 200 μl wysokiej jakości bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) do fiolki zawierającej 10 mg chlorku sulfonylowego Texas Red (TRSC); mieszać w wortexie z prędkością średnią przez 15 s.
Wymieszać roztwór RSA w wortexie z prędkością średnią i dodać rozpuszczony TRSC.
Owinąć probówkę stożkową 50 ml folią (można użyć Parafilmu, aby zapewnić szczelne zamknięcie), umieścić poziomo w wiaderku z samym lodem i ustawić na wytrząsarku w celu powolnego mieszania roztworu (należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza); kontynuować reakcję w temperaturze od 0 do 4 °C przez 1 h.
Przygotować 5 L 0,9% roztworu soli fizjologicznej i nawilżyć komorę dializacyjną o odcięciu masy cząsteczkowej (MWCO) 50 kDa, która może być: a) membraną dializacyjną z klipsami, b) rurką dializacyjną w urządzeniu typu float-a-lyzer lub c) kasetą slide-a-lyzer (wszystkie są odpowiednie do usuwania nieprzyłączonego TRSC).
Przenieść mieszaninę reakcyjną do komory dializacyjnej i umieścić w 5 L pojemniku z 0,9% roztworem soli fizjologicznej; dializować przez noc w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu za pomocą mieszadła magnetycznego.
Wymieniać 5 L roztworu dializacyjnego rano i późnym popołudniem, aż inkubacja nocna nie spowoduje już niemal żadnej zmiany barwy (zazwyczaj zajmuje to około 48 h przy co najmniej 4 wymianach). Dodatkowo, ponieważ MWCO 50 kDa jest bardzo zbliżone do masy cząsteczkowej RSA (66 kDa), możliwe jest, że roztwór nigdy nie stanie się całkowicie przejrzysty; zależy to od rozkładu wielkości porów membrany; 60 h i 5 wymian jest czasem w zupełności wystarczającym.
Zmierzyć objętość i podzielić początkową masę 100 mg przez objętość, aby uzyskać przybliżone stężenie TR-RSA; zazwyczaj stężenia mieszczą się w zakresie 10-13 mg/ml. Końcowy stosunek barwnika do albuminy powinien wynosić około 4:1, czyli 1 fluorofor na 15 000 Daltonów masy cząsteczkowej białka. Przechowywać w temperaturze 4 °C; NIGDY NIE ZAMRAŻAĆ roztworu TR-RSA, ponieważ powstała w wyniku mrożenia fragmentacja może zmienić wartości przepuszczalności.

2. Przygotowanie stolika mikroskopu odwróconego do obrazowania/ Ustawienia mikroskopu

Umieść ~ 4-7 kawałków taśmy autoklawowej (o długości około ¾") idealnie ułożonych jeden na drugim wewnątrz naczynia 50 mm z dnem z okładki szkiełka (coverslip bottom dish). Powinny one zostać umieszczone bliżej jednej z krawędzi, tak aby krawędź taśmy stykała się z krawędzią zakrzywienia nerki, ale nie blokowała drogi światła obiektywu (Ryciny 1A i 1B); w przypadku większych szczurów wymagana będzie większa odległość między taśmą a krawędzią naczynia.
Umieść 2 podkładki Repti-therm obok stolika, wzdłuż naczynia 50 mm (Rycina 1A). Na stoliku rozłóż ogrzewający koc z płaszczem wodnym.
Maksymalizuj wydajność podczas gromadzenia obrazów, upewniając się, że rewolwer obiektywów posiada obiektyw 10x powietrzny lub 20x (powietrzny lub imersyjny wodny) oraz obiektyw imersyjny wodny o większym powiększeniu do gromadzenia obrazów do analizy ilościowej.
Podczas obrazowania najwydajniejszym sposobem dodawania wody do obiektywów jest ich obrócenie na bok i dodanie wody za pomocą strzykawki 1 cc z długim odcinkiem rurki PE-200, która może sięgnąć góry obiektywów.
Ustaw intensywność wzbudzenia lasera 10W na ~15-20%, korzystając z filtrów neutralnych w oprogramowaniu. Detektory niedeskynowane fosforku galu i arsenu ustawiono na 750 w celu gromadzenia emisji zielonej oraz na 625 w celu gromadzenia emisji czerwonej. Emisje niebieskie (takie jak barwnik jądrowy Hoechst 33342) są gromadzone za pomocą standardowego niedeskynowanego detektora wieloalkalicznego z ustawieniem między 750-800.
Aby zapewnić właściwe gromadzenie słabych emisji w przestrzeni Bowmana, upewnij się, że dolne granice detektorów są ustawione tak, aby nie wykluczać tych wartości. Wizualne znaczniki ostrzegawcze wskażą, czy ustawienie czułości jest zbyt niskie i czy wartości te są przypisane do intensywności równej zero.
Napełnij strzykawkę 1 cc ilością ~ 5-8 mg fluorescencyjnego roztworu albuminy rozcieńczonego w 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, aby uzyskać całkowitą objętość 1 cc.

3. Odsłanianie nerki u szczura Munich Wistar do obrazowania dwufotonowego in vivo

Zacznij od szczura poddanego znieczuleniu z użyciem Pentobarbitalu (roztwór 50 mg/ml, 120 μl/100 g masy ciała), Inactinu (roztwór 130 mg/ml, 120 μl/100 g masy ciała) lub Izofluranu (indukcja 5%, utrzymanie od 1,5 do 2,5%), z wprowadzonym stałym dostępem żylnym (do żyły szyjnej lub udowej) oraz z ogolonym lewym bokiem od obszaru tuż poniżej klatki piersiowej do obszaru tuż nad lewym udem.
Umieść szczura płasko na prawym boku, tak aby lewa, ogolona strona była skierowana do góry; upewnij się, że zwierzę leży płasko na stole, z wyprostowanym ciałem, a nie w pozycji skulonej, z przednimi łapami dotykającymi się nawzajem i tylnymi łapami dotykającymi się nawzajem (Rysunek 2A).
Bardzo delikatnie przeprowadź palpację, aby zlokalizować nerkę i określić jej naturalne położenie w przestrzeni zaotzewnowej, a następnie narysuj markerem Sharpie linię prostą równoległą do ciała (od klatki piersiowej do uda) (Rysunek 2A).
Chwyć skórę pęsetą z ząbkami i zaciśnij skórę wzdłuż narysowanej linii za pomocą kleszczyków hemostatycznych, aby zmiażdżyć tkankę i zapobiec krwawieniu. Przetnij tkankę wzdłuż nacięcia, używając nożyczek chirurgicznych. Zmiażdżenie zewnętrznej warstwy skóry i warstw mięśni przed nacięciem znacznie ograniczy, a zazwyczaj całkowicie wyeliminuje krwawienie.
Powtórz tę procedurę dla zewnętrznej, cienkiej warstwy mięśni.
W przypadku nacięcia wewnętrznej warstwy mięśni, które odsłoni otrzewną, ponownie przeprowadź palpację nerki, aby oszacować jej rozmiar. Zaciśnij linię nacięcia mniejszą niż nerka, upewniając się, że nacięcie znajduje się dokładnie nad nerką. Najlepiej jest wykonać zbyt małe nacięcie i powiększyć je w razie potrzeby. Jeśli nacięcie będzie zbyt duże, konieczne będzie nałożenie szwów. To ostatnie nacięcie jest krytyczne; przesunięcie go w dowolnym kierunku wpłynie na stabilność na stole operacyjnym i wywoła albo artefakty ruchowe wynikające z oddychania (najlepszy scenariusz), albo doprowadzi do rozciągnięcia szypuły nerkowej i niekorzystnego zmniejszenia perfuzji nerkowej (najgorszy scenariusz).
Zlokalizuj nerkę (jak pokazano na Rysunku 2B) i chwyć otaczający ją tłuszcz pęsetą, przesuwając się w kierunku bieguna dolnego nerki metodą „ręka nad ręką”.
Po dotarciu do bieguna dolnego nerki, delikatnie wyciągnij nerkę przez nacięcie, bardzo lekko uciskając poniżej niej, aby ją zewnętrznić. Jeśli nacięcie jest zbyt małe, zmiażdż warstwę mięśniową i przetnij ją, aby poszerzyć otwór; powtórz procedurę zewnętrznienia nerki.

4. Umieszczanie szczura Munich Wistar na stole do obrazowania

Umieść nerkę w pobliżu krawędzi naczynia z szkiełkiem nakrywowym, lekko obracając ją w stronę grzbietową (plecy) szczura, tak aby strona brzuszna nerki stykała się z dnem naczynia (Rysunek 1A). Do naczynia dodaj podgrzany, sterylny 0,9% roztwór soli fizjologicznej.
Obserwując przez obiektyw 10x lub 20x, sprawdź, czy występuje ruch. Jeśli ruch zostanie wykryty, lekko obróć szczura, tak aby klatka piersiowa znajdowała się dalej od dna naczynia; upewnij się, że nerka znajduje się jak najbliżej krawędzi naczynia, nie naciągając przy tym szypuły nerkowej (Rysunek 1B).

5. Pozyskiwanie obrazów w celu ilościowego określenia przepuszczalności nerek dla albuminy

Obliczanie przepuszczalności kłębka (współczynnik przesiewania kłębkowego; GSC) dla dowolnej makrocząsteczki wymaga wykonania referencyjnych obrazów tła poszczególnych kłębków przed infuzją cząsteczki fluorescencyjnej. Jeśli mikroskop jest wyposażony w zmotoryzowany stół umożliwiający zaznaczanie lokalizacji, należy zlokalizować i wycentrować poszczególne kłębki za pomocą obiektywu o mniejszym powiększeniu, a następnie zaznaczyć każdą lokalizację. Do tej procedury idealny jest filtr epifluorescencyjny dual-pass dla fluoresceiny/rhodaminy, choć zadziała każdy z filtrów emisyjnych (kontrast fazowy lub inne niefluorescencyjne źródła oświetlenia nie będą skuteczne). Kłębki będą widoczne jako puste okrągłe struktury otoczone kanalikami proksymalnymi, które wykazują naturalną żółto-pomarańczową autofluorescencję przy obserwacji przez filtr dual-pass.
Jeśli mikroskop nie posiada zmotoryzowanego stołu, należy przeskanować nerkę w rastrze za pomocą obiektywu o niskim powiększeniu i sporządzić wstępną mapę rozmieszczenia poszczególnych kłębków, opierając się na naturalnych punktach orientacyjnych, takich jak duże powierzchowne naczynia krwionośne znajdujące się nad torebką nerki lub skupiska tłuszczu.
Należy przełączyć rewolwer na obiektyw imersyjny (wodny) o większym powiększeniu i zebrać zestawy danych 3D dla każdego kłębka, upewniając się, że pętle kapilarne i przestrzeń Bowmana są wyraźnie widoczne. Użycie palety pseudokolorów (czegokolwiek innego niż czerń i biel) ułatwi wizualizację tych struktur.
Skupiając się na powierzchownym naczyniu krwionośnym, należy powoli infundować fluorescencyjną albuminę, zapewniając odpowiedni czas na rozprzestrzenienie systemowe. W przypadku cząsteczek o niskim GSC niezbędne jest zmaksymalizowanie wartości intensywności w osoczu, ale bez osiągania poziomów, które nasyciłyby fotodetektory w mikroskopie. Zwiększa to wykrywalność przefiltrowanych cząsteczek. Uwaga: zazwyczaj występuje 5-7 sekundowe opóźnienie między momentem wprowadzenia fluorescencyjnej albuminy a momentem jej pojawienia się na ekranie (przy pozyskiwaniu pełnych klatek z częstotliwością ~ 1 klatka/sekundę).
Należy odczekać około 10 min, aby umożliwić usunięcie potencjalnych fragmentów o niskiej masie cząsteczkowej przed pozyskaniem wolumenów 3D w interwałach 1 μm, które zostaną wykorzystane do obliczenia GSC albuminy. Typowo szczepy Simonsen szczurów Munich Wistar mają znacznie mniej kłębków powierzchniowych, dlatego obrazowane i ilościowane są wszystkie, które można zwizualizować. Szczep Frömter posiada znacznie większą ich liczbę, dlatego ograniczamy liczbę ilościowanych kłębków do ~10.
Na koniec badania szczur zostaje poddany eutanazji poprzez przedawkowanie środka znieczulającego użytego w badaniu. W celu zapewnienia eutanazji wykonuje się obustronną pneumotorakomię.

6. Obliczanie GSC dla fluorescencyjnej albuminy z objętości 3D

Za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów Metamorph należy wczytać trójwymiarowe zestawy danych dla każdego kłębka nerkowego, zarówno zestaw tła, jak i zestaw uzyskany po infuzji fluorescencyjnej albuminy.
W woluminie zawierającym fluorescencyjną albuminę należy zlokalizować powierzchowną pętlę kapilarną z wystarczającą przestrzenią między jej określonymi krawędziami a brzegiem torebki Bowmana.
W woluminie tła należy zlokalizować tę samą płaszczyznę ogniskową, która powinna zawierać wszystkie punkty orientacyjne widoczne na obrazie z albuminą. Należy wybrać obszar w obrębie interesującej pętli kapilarnej i zapisać średnią wartość intensywności. Następnie należy wybrać obszar w obrębie przestrzeni Bowmana i zapisać średnią wartość intensywności. Wartości te zostaną wykorzystane jako wartości tła.
W celu ilościowego oznaczenia należy wybrać analogiczny obszar w przestrzeni Bowmana na obrazie zawierającym albuminę. Należy powtórzyć tę czynność dla co najmniej dwóch innych obszarów, aby wyznaczyć średnią wartość intensywności w przestrzeni Bowmana.
Należy wybrać pętlę kapilarną o najwyższej intensywności plazmy i obrysować wokół niej obszar. Następnie, korzystając z funkcji progowania, należy zaznaczyć jasne wartości w obrębie krążącej plazmy, unikając ciemnych smug, które stanowią krążące erytrocyty. Należy zapisać średnie wartości intensywności zaznaczonej przestrzeni plazmy. Ważne jest, aby preferencyjnie wybierać jasne obszary plazmy, ponieważ składniki krwi mogłyby doprowadzić do niedoszacowania poziomów fluorescencji plazmy.
W arkuszu Microsoft Excel należy wprowadzić wartości w celu obliczenia GSC, gdzie:

Równanie stanu równowagi statycznej, wzór GSC; schemat analizy natężenia w układzie spektroskopowym.