Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Summary

Technika wykorzystująca mikroskopię 2-fotonową intavital o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określenia filtracji gloemrarnej w kłębuszkach nerkowych na powierzchni. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie charakterystyk przepuszczalności makrocząsteczek zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

Abstract

Choroby nerek polegające na utracie w moczu dużych niezbędnych makrocząsteczek, takich jak albumina surowicy, od dawna uważane są za spowodowane zmianami w barierze przepuszczalności składającej się z podocytów, komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i błony podstawnej, które działają zgodnie. Dane z naszego laboratorium przy użyciu przyżyciowej mikroskopii 2-fotonowej ujawniły bardziej przepuszczalną barierę filtracyjną kłębuszków nerkowych (GFB) niż wcześniej sądzono w warunkach fizjologicznych, z odzyskiwaniem przefiltrowanej albuminy zachodzącej we wczesnej podgrupie komórek zwanej komórkami kanalików proksymalnych (PTC)^1,2,3.

Poprzednie techniki używane do badania filtracji nerkowej i ustalania charakterystyki bariery filtracyjnej obejmowały mikronakłuwanie światła tych wczesnych segmentów rurkowych z próbkowaniem zawartości płynu i analizą⁴. Badania te wykazały, że stężenie albuminy w płynie luminalnym praktycznie nie istnieje; odpowiadające ściśle temu, co jest zwykle wykrywane w moczu. Jednak charakterystyka polimerów dekstranu o określonych rozmiarach za pomocą tej techniki ujawniła, że te o wielkości podobnej do albuminy surowicy miały wyższe poziomy w świetle kanalików i moczu; Sugerowanie zwiększonej przepuszczalności⁵.

To szczegółowy zarys techniki używanej do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określania przepuszczalności albuminy fluorescencyjnej kłębuszków nerkowych in vivo. Metoda ta pozwala na wykrycie przefiltrowanej albuminy przez barierę filtracyjną do przestrzeni Bowmana (początkowa komora filtracji moczu); a także umożliwia ilościowe określenie reabsorpcji albuminy przez kanaliki proksymalne i wizualizację późniejszej transcytozy albuminowej⁶. Brak albuminy fluorescencyjnej wzdłuż późniejszych segmentów kanalików w drodze do pęcherza moczowego podkreśla skuteczność szlaku pobierania we wcześniejszych segmentach kanalików proksymalnych. Ponadto, gdy technika ta została zastosowana do określenia przepuszczalności dekstransu o wielkości podobnej do albuminy, podano praktycznie identyczne wartości przepuszczalności². Obserwacje te bezpośrednio potwierdzają potrzebę rozszerzenia zainteresowania wielu białkomoczowych chorób nerek na uwzględnione zmiany w regeneracji komórek kanalików proksymalnych.

Protocol

1. Koniugacja albuminy surowicy szczura z chlorkiem sulfo-rodaminy 101 (Texas Red)

1. Rozpuścić 100 mg albuminy surowicy szczurzej (RSA) w 6,667 ml 100 mM wodorowęglanu sodu o pH 9,0; końcowe stężenie 15 mg/ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
2. Umieścić roztwór w zlewce z lodem/wodą i ostudzić do temperatury od 0 do 4 °C.
3. Dodać 200 μl wysokiej jakości bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) do fiolki 10 mg czerwonego chlorku sulfonylu Texas (TRSC); wirować na pożywce przez 15 sekund.
4. Odwirować roztwór RSA na pożywce i dodać rozpuszczony TRSC.
5. Zawiń 50 ml stożkowego produktu w folię (można użyć Parafilmu, aby zapewnić s....

Results

Rysunek 3 pokazuje przykład zdjęcia wykonanego z powierzchni kłębuszka nerkowego szczura monachijczyka Wistar Frömter oraz kroki podjęte w celu określenia przepuszczalności albuminy fluorescencyjnej. Wartość GSC dla albuminy wynosząca 0,0111 uzyskana dla tego pojedynczego kłębuszka nerkowego mieści się w zakresie obserwowanym u tego szczepu szczurów Munich Wistar w stanie karmienia³. Stabilność widoczna na tych obrazach wynika ze starannego planowania i wykonywania instrukcji przedstawionych n.......

Discussion

Przedstawione tutaj kroki reprezentują to, co uważamy za te, które zapewnią spójne i dokładne wartości przepuszczalności, ponieważ pozwalają ominąć następujące pułapki:

1. Rozpraszanie: Zastosowanie fluoroforów emitujących czerwień pozwala na bardziej efektywne zbieranie światła, ponieważ fotony o dłuższych falach są mniej podatne na rozpraszanie. Użycie fluoroforów emitujących kolor zielony lub niebieski wprowadzi większą zmienność GSC ze względu na zwiększoną zmienność wartości intensywności z pętli kapil.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop konfokalny/wielofotonowy Olympus Floview 1000	Olympus America		Filtry do detektorów: Niebieski 430/100, Zielony 525/50, Czerwony 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Regulowane długości fal wzbudzenia: ~750-1150 nm
Fotodetektory fosforku arsenku galu	Hamamatsu Corp		Uwaga: Dostępne są konfiguracje montowane z przodu lub z boku.
Metamorph Oprogramowanie do przetwarzania obrazów	Dynamika molekularna		Uwaga: Wersja 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007
wersja Obsługa kleszczy	Mikroskopia elektronowa Nauki	Nr kat. # 78266-04
Nożyczki do preparowania Mayo	Mikroskopia elektronowa Nauki	Nr kat. # 72962
CA Mikronożyczki Model 1C300	Mikroskopia elektronowa Nauki	Kat# 78180-1C3
Kleszcze hemostatyczne Kelly (proste)	Nauki o mikroskopii elektronowej	Cat# 72930
Koc z kurtką wodną + poduszka grzewcza	Gaymar		T / Pump PN 11184-000 Koc-66N111CC
Repti-Therm Podgrzewacz pod zbiornikiem	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl	Chloride Invitrogen/Sondy molekularne	Cat# T-353
Albumina surowicy szczurzej	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
Wysokiej jakości bezwodny DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Taśma autoklawowa Strate-Line	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Szkiełko nakrywkowe z dnem (50 mm/40 mm szkiełko nakrywkowe)	Nauki o mikroskopii elektronowej	Cat# 70665-07