Powiązanie ryzyka drapieżnictwa, stresu fizjologicznego roślinożerców i mikrobiologicznego rozkładu ściółki roślinnej

Podsumowanie

Prezentujemy metody oceny, jak ryzyko drapieżnictwa może zmienić jakość chemiczną ofiar roślinożerców, wywołując zmiany w diecie, aby sprostać wymaganiom zwiększonego stresu, oraz jak rozkład zwłok tych zestresowanych roślinożerców spowalnia późniejszy rozkład ściółki roślinnej przez mikroby glebowe.

Streszczenie

Ilość i jakość detrytusu dostającego się do gleby określa tempo rozkładu przez społeczności mikrobiologiczne, jak również wskaźniki recyklingu sekwestracji azotu (N) i węgla (C)^1,2. Ściółka roślinna składa się z większości detrytusu³, w związku z czym zakłada się, że na rozkład tylko w niewielkim stopniu wpływa biomasa pochodząca od zwierząt takich jak roślinożercy i mięsożercy^4,5. Drapieżniki mogą jednak wpływać na rozkład mikrobiologiczny ściółki roślinnej poprzez łańcuch interakcji, w którym ryzyko drapieżnictwa zmienia fizjologię ich ofiar roślinożerców, co z kolei zmienia funkcjonowanie mikroorganizmów glebowych, gdy zwłoki roślinożerców ulegają rozkładowi⁶. Fizjologiczna reakcja roślinożerców na stres związany z ryzykiem drapieżnictwa może zmienić skład pierwiastkowy C:N biomasy roślinożerców^7,8,9, ponieważ stres spowodowany ryzykiem drapieżnictwa zwiększa podstawowe zapotrzebowanie energetyczne roślinożerców, które w systemach o ograniczonej zawartości składników odżywczych zmusza roślinożerców do przeniesienia spożycia z zasobów bogatych w N, aby wspierać wzrost i reprodukcję, do zasobów węglowodanowych bogatych w C, aby wspierać zwiększony metabolizm⁶. Roślinożercy mają ograniczoną zdolność do magazynowania nadmiaru składników odżywczych, więc zestresowani roślinożercy wydalają N,^{zwiększając spożycie} węglowodanów C. Ostatecznie ofiary zestresowane ryzykiem drapieżnictwa zwiększają stosunek C:N w organizmie^{do 7,10}, co czyni je gorszymi zasobami jakości dla puli mikrobiologicznej gleby, prawdopodobnie z powodu mniejszej dostępności labilnego azotu do produkcji enzymów mikrobiologicznych⁶. Tak więc rozkład zwłok zestresowanych roślinożerców ma wpływ pobudzający funkcjonowanie zbiorowisk drobnoustrojów, co zmniejsza późniejszą zdolność drobnoustrojów do rozkładu ściółki roślinnej^6,10,11.

Przedstawiamy metodologię oceny powiązań między ryzykiem drapieżnictwa a rozkładem ściółki przez mikroorganizmy glebowe. Opisujemy, jak: wywołać stres u roślinożerców spowodowany ryzykiem drapieżnictwa; Zmierz te reakcje na stres i zmierz ich wpływ na rozkład mikrobiologiczny. Korzystamy z informacji pochodzących z modelowego ekosystemu trawiastego obejmującego polującego drapieżnika pająka (Pisuarina mira), dominującego roślinożercę konika polnego (Melanoplus femurrubrum) oraz różnych roślin trawiastych i trawiastych⁹.

Protokół

1. Hodowla koników polnych w warunkach stresowych i bezstresowych

1. Użyć okrągłych, zamkniętych mezokosmosów o powierzchni 0,5 m², aby zapobiec emigracji lub imigracji gatunków zwierząt (Rycina 1). Mezokosmosy należy zbudować, wykorzystując odcinki ogrodzenia aluminiowego z siatki o oczkach ¼", o długości 2,4 m i wysokości 1,5 m, jako stelaż. Ogrodzenie należy pokryć fragmentami aluminiowej siatki okiennej o długości 2,5 m i wysokości 1,75 m, zagiętej nad górną i dolną krawędzią ogrodzenia i zszytej zszywkami wzdłuż zagięcia. Końce ogrodzenia należy połączyć, tworząc zamknięty okrąg, a następnie zszyć nakładające się fragmenty siatki okiennej, aby zapewnić szczelność. Mezokosmos należy osadzić w glebie w terenie, wykopując wokół jego podstawy rów o głębokości 10 cm i szerokości 4 cm, umieścić w nim mezokosmos, a następnie ubić darń wokół zatopionej części. Do góry mezokosmu należy przymocować zszywkami okrągły kawałek siatki okiennej.
2. Mezokosmosy należy rozmieścić w terenie zgodnie z powtórzonym, sparowanym schematem eksperymentalnym. Lokalizacje poletek powinny być dobrane tak, aby odpowiadały tożsamości gatunkowej roślin oraz ich względnemu pokryciu. Klatki należy wbić na głębokość 10 cm w grunt w miejscu poletki.
3. Za pomocą siatki entomologicznej należy zebrać nimfy koników polnych we wczesnym (2.^nd) stadium rozwojowym i wprowadzić je do mezokosmosów w naturalnych zagęszczeniach terenowych.
4. Za pomocą siatki entomologicznej należy odłowić osobniki dominującego gatunku pająka drapieżnego polującego metodą „czekaj i atakuj” (nie tkającego sieci). Chelicery pająka (części gębowe służące do obezwładniania ofiar) należy zakleić szybko schnącym cementem, aby oddzielić efekty stresu od faktycznej selekcji przeżywalności faworyzującej osobniki koników polnych o lepszych zdolnościach unikania drapieżnictwa pająków. Pająki należy wprowadzić w zagęszczeniach terenowych do jednego mezokosmosu z każdej pary. Będzie to grupa traktowana stresem. Mezokosmosy bez pająków stanowić będą grupę kontrolną (bezstresową).
5. Należy pozwolić nimfom koników polnych na rozwój do późnych (4.^th i 5.^th) stadiów rozwojowych. Wszystkie osobniki należy zebrać z klatek i losowo przydzielić osobniki z każdej klatki do jednej z trzech następujących grup badawczych: (1) walidacja fizjologicznego stanu stresu; (2) walidacja zmiany w stechiometrii pierwiastkowej organizmu; (3) rozkład mikrobiologiczny.

2. Walidacja stanu stresu konika polnego

1. Zmierz standardową przemianę materii (SMR) konika polnego jako szybkość emisji dwutlenku węgla () w przepływowym systemie respirometrycznym z natężeniem przepływu powietrza 200 ml/min. Usuń parę wodną, przepuszczając przepływające powietrze przez środek osuszający.
2. Po 16 h głodówki (woda powinna być dostępna), zważ poszczególne osobniki koników polnych (±0.1 mg) i umieść je w przezroczystych komorach respirometrycznych o pojemności 50 ml (9.2 cm L x 2.0 cm D), pozwalając im na regenerację po manipulacjach przez co najmniej 10 min przed rozpoczęciem pomiarów.
3. Przy stałej średniej temperaturze otoczenia (wariancja temperatury ± 1% błędu standardowego) wewnątrz komory respirometrycznej, przeanalizuj powietrze wydechowe za pomocą analizatora CO₂ na podczerwień (np. Qubit S151- 1 ppm rozdzielczości). Zmierz średnią minimalną wartość w stanie stacjonarnym przez 10 min.
4. Analizator podaje ułamkowe stężenie CO₂ (części na milion), jednak SMR należy raportować jako szybkość, zatem należy przekształcić zapisy zgodnie ze wzorem , gdzie przyjęto jako równe 0.85 w przypadku zwierząt roślinożernych.

3. Walidacja przesunięcia w stechiometrii pierwiastkowej organizmu

1. Oznaczyć zawartość węgla i azotu (C:N) w próbce koników polnych zebranych z mezokosmosów polowych.
2. Zredukować zmienność stosunku C:N wynikającą z niedawnego spożycia pokarmu poprzez usunięcie zawartości jelit koników polnych pod mikroskopem stereoskopowym.
3. Liofilizować opróżnione jelita oraz ciało przez 48 h, a następnie rozetrzeć poszczególne tułowia i jelita na jednorodny proszek.
4. Zmierzyć zawartość C:N w proszku przy użyciu autoanalizatora CNH.

4. Rozkład mikrobiologiczny

1. Umieść powtórzone pary obręczy z PVC (średnica 15,4 cm, wbitą na głębokość ok. 4 cm w glebę) na obszarze badawczym (Rysunek 3C). Usuń całą roślinność w ich wnętrzu poprzez przycięcie przy powierzchni gleby. Obręcze te są wykorzystywane do pomiarów rozkładu. Dodatkowo, rozmieść na obszarze badawczym zestaw obręczy z PVC, które będą służyć jako kontrole naturalnej zawartości ¹³C (patrz poniżej), do których nie dodaje się ani koników polnych, ani ściółki trawiastej.
2. Do jednej obręczy z każdej pary dodaj 2 nienaruszone, liofilizowane zwłoki koników polnych (odnotuj dodaną biomasę) hodowanych z ryzykiem drapieżnictwa, zgodnie z powyższym opisem, przy użyciu klatek polowych. Do drugiej obręczy z każdej pary dodaj 2 nienaruszone liofilizowane zwłoki osobników hodowanych bez ryzyka drapieżnictwa.
3. Przykryj obręcze z PVC siatką, aby zapobiec usuwaniu zwłok koników polnych z poletek przez padlinożerców, i pozostaw zwłoki koników polnych do rozkładu na 40 dni.
4. Podczas rozkładu zwłok, oznakuj ściółkę trawiastą izotopem ¹³C.
   1. Zbuduj przezroczystą komorę z pleksiglasu (60 cm x 60 cm x 1,5 m) z zaworem wlotowym i wylotowym (Rysunek 3B).
   2. Wbij w ziemię na głębokość 5 cm kwadratową drewnianą ramę o wymiarach 60 cm x 60 cm z uszczelką gumową pokrytą smarem silikonowym (Rysunek 3B).
   3. Nasuń komorę na drewnianą ramę tak, aby komora została uszczelniona gumą (Rysunek 3B).
   4. Podłącz wloty komory do butli z gazem sprężonym zawierającym 99 atom% ¹³CO_2. Rośliny wewnątrz komory zostaną oznakowane ¹³C, przy czym stężenia CO₂ są utrzymywane na poziomach otoczenia (ponieważ podwyższenie stężeń zmienia podział węgla w roślinie). Poziomy otoczenia są utrzymywane poprzez podawanie oznakowanego CO₂ jedynie w krótkich impulsach. Ponadto monitorowana jest temperatura wewnątrz komory, a komory są usuwane, jeśli temperatura wzrośnie o 5 °C powyżej temperatury otoczenia.
   5. Tydzień po oznakowaniu porównaj δ¹³C ściółki trawiastej z wartościami naturalnej zawartości pobranymi z losowej próbki tych samych gatunków traw za pomocą izotopowego spektrometru mas Thermo DeltaPlus (Thermo, San Jose, CA, USA).
5. Po 40 dniach dodaj 10 g wysuszonej powietrzem, oznakowanej ¹³C ściółki trawiastej do każdej obręczy, do której wcześniej dodano zwłoki koników polnych.
6. Monitoruj tempo mineralizacji ściółki trawiastej in situ przez 75 dni, zamykając każdą obręczy i śledząc zarówno całkowitą respirację gleby, jak i respirację ¹³CO₂. Jest to realizowane przy użyciu techniki komory przepływowej, w której próbki gazu z każdej obręczy są monitorowane w czasie rzeczywistym przez 8 min każda, wykorzystując spektroskopię ring-down wnękowej (CRDS; Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Model: G1101-i). CRDS umożliwia jednoczesne śledzenie całkowitej respiracji gleby oraz wartości δ¹³C.
7. Oszacuj wkład oznakowanej ¹³C ściółki trawiastej do całkowitej respiracji gleby za pomocą równań mieszania izotopów. Ilość CO₂ pochodzącego ze ściółki trawiastej oblicza się następująco: C_{grass-litter derived} = C_total × (δ¹³C_respiration- δ¹³C_nat.abn.)/ (δ¹³C_grass-litter- δ¹³C_nat.abn), gdzie C_total to całkowita ilość C wydzielonego podczas danego pomiaru, δ¹³C_respiration to δ¹³C wydzielonego węgla dla obręczy z dodatkiem oznakowanej ściółki trawiastej, δ¹³C_nat.abn. to średnie δ¹³C wydzielonego węgla w trzech obręczach o naturalnej zawartości (tzn. tych, do których nie dodano ściółki), a δ¹³C_grass-litter to δ¹³C ściółki trawiastej dodanej do obręczy.
8. Monitoruj temperaturę i wilgotność gleby w trakcie trwania eksperymentu za pomocą sond ręcznych, aby skorygować różnice w respiracji gleby wynikające z różnic w temperaturze i wilgotności.
9. Mimo że instrument do spektroskopii ring-down wnękowej (Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Model: G1101-i) jest przeznaczony do użytku polowego, jego odczyty są wrażliwe na ruchy. Dlatego należy ustawić główną stację pomiarową w centrum wszystkich poletek z obręczami z PVC i połączyć instrument z obręczami za pomocą rurek z PVC.

Wyniki

Przykładowy wykres standardowych wskaźników metabolicznych koników polnych w warunkach stresowych i bezstresowych przedstawiono na Rysunku 2. Ze względu na różnice w masie ciała poszczególnych koników polnych oraz fakt, że tempo metabolizmu zmienia się wraz z masą ciała, wykresy powinny przedstawiać wskaźniki metaboliczne w relacji do masy ciała konika polnego. Równoległe trendy dla różnych zabiegów wskazują, że tempo metabolizmu rośnie jako stała wielokrotność standardowego wskaźnika metabolicznego (t.j. brak interakcji między masą ciała a tempem metabolizmu) dla wszystkich osobników poddanych stresowi.

Zawartość pierwiastków C i N w organizmach koników polnych w warunkach ryzyka oraz braku ryzyka przedstawiono w Tabeli 1. Warto zauważyć, że różnica w stosunku C:N w organizmach między grupami badawczymi jest bardzo niewielka (4%). Niemniej jednak te małe różnice mogą przekładać się na duże różnice w rozkładzie ściółki trawiastej przez glebową pulę mikroorganizmów (Rysunek 3).

Dodanie ściółki trawowej do kołnierzy z PVC, które wcześniej zostały wzbogacone o koniki polne poddane stresowi lub pozbawione stresu, prowadzi do różnego stopnia rozkładu ściółki, co odzwierciedlają krzywe opisujące skumulowaną emisję CO₂ z gleby w wyniku oddychania mikrobiologicznego (Rycina 3). Eksperymenty należy monitorować do momentu, aż krzywe skumulowane zaczną osiągać stan nasycenia.

	Stres	Bezstresowy
Węgiel (%)	48.44±0.32	44.73±0.46
Azot (%)	12.11±0.08	11.62±0.12
Węgiel: Azot	4.00±0.03	3.85±0.04

Tabela 1. Porównanie zawartości chemicznej trucheł koników polnych (roślinożerców) z warunków, w których występowało ryzyko drapieżnictwa (stres), oraz z warunków, w których ryzyko drapieżnictwa było nieobecne (brak stresu). Wartości przedstawiono jako średnia ± 1 błąd standardowy.

Rycina 1. Ilustracja projektu mezokosmosów terenowych użytych w eksperymencie oraz ogólny schemat eksperymentalnej oceny wpływu czynników ryzyka na rozkład ściółki.

Rycina 2. Wykres standardowego tempa metabolizmu roślinożerców w zależności od ich masy ciała. Dane zostały podzielone na dwie klasy zgodnie z zabiegiem eksperymentalnym: koniki polne z mezokosmosów zawierających drapieżniki (predacja) w celu wywołania stresu oraz mezokosmosów bez drapieżników (kontrola), a zatem bez wywołanego stresu. Dane pochodzą z nieopublikowanych prac D. Halweny i O.J. Schmitza z 2010 r.

Rysunek 3. Krzywe opisujące skumulowaną emisję CO₂ przez pulę mikrobiologiczną podczas rozkładu eksperymentalnych wkładów z ściółki trawowej w kołnierzach z PVC. Wykres przedstawia wartości średnie ± 1 błąd standardowy. Wykres pokazuje, że gleby wzbogacone zwłokami zestresowanych koników polnych (drapieżnik) wykazują o 19% niższe (ANOVA F_1,6 = 9,06, P < 0,05) tempo rozkładu ściółki roślinnej niż gleby wzbogacone zwłokami koników polnych bezstresowych (kontrola). Wstawka przedstawia aparat z kołnierzem z PVC w terenie. Rysunek powielono z Hawlena et al.⁶ Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Dyskusja

Przedstawiona tu sekwencja metod powinna pozwolić na systematyczny pomiar sposobu, w jaki stres u gatunków tworzących nadziemne sieci pokarmowe może pobudzać zbiorowiska mikroorganizmów glebowych w sposób, który prowadzi do zmiany późniejszego rozkładu ściółki roślinnej. Metody te są idealne do badania ekosystemów składających się z konsumentów stawonogów i roślin zielnych, ponieważ nienaruszone sieci pokarmowe mogą być ograniczone przestrzennie i zawarte w mezokosmosach.

Zmienność przestrzenna może występować ze względu na gradienty wilgotności tła gleby, temperatury gleby, zawartości składników odżywczych roślin itp. Projekt badania pozwala na ustawienie mescosmów i kołnierzy PVC w celu zablokowania wzdłuż przestrzennych gradientów środowiskowych, a tym samym uwzględnienia takiej zmienności środowiskowej podczas analizy efektów.

Chociaż przeznaczony do użytku w terenie, instrument do spektroskopii pierścieniowej (Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Model: G1101-i) odczyty są wrażliwe na ruch. W związku z tym należy postawić centralną stację pomiarową na wszystkich działkach, na których znajdują się kołnierze z PCV i połączyć przyrząd z kołnierzami za pomocą odcinków rurek PVC.

Rozkład ściółki glebowej tradycyjnie mierzy się poprzez zamknięcie znanych ilości ściółki w workach z siatki z włókna szklanego, osadzenie worków na powierzchni gleby na polu i okresowe ponowne mierzenie worków w celu ilościowego określenia szybkości zanikania (rozkładu) ściółki. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie można prześledzić losów rozłożonej materii ani określić udziału w mineralizacji CO₂ dodatku do gleby (dodanej ściółki) z tła mineralizacji gleby CO₂ . Przedstawiona tutaj metoda śledzenia wykorzystująca znakowany CO₂ pomaga złagodzić to ograniczenie logistyczne.

Ekologia ekosystemów i biogeochemia funkcjonują w oparciu o paradygmat roboczy, zgodnie z którym ponieważ niezjedzona ściółka roślinna składa się z większości detrytusu, na podziemne procesy ekosystemowe tylko marginalny wpływ mają dopływy biomasy z wyższych poziomów troficznych w nadziemnych sieciach pokarmowych, takich jak same roślinożercy⁶. Istnieje jednak coraz więcej dowodów na to, że gatunki żyjące na wyższych poziomach troficznych ekosystemów mogą mieć głęboki wpływ na procesy zachodzące pod ziemią^1,4,5. Przedstawiona tutaj metoda ma na celu poprawę kwantyfikacji wpływu wyższych poziomów troficznych, albo bezpośrednio poprzez biomasę z depozycji tuszy (np. ^{12, 13}) lub wydalania i degestacji (np. ^{14, 15}), albo pośrednio poprzez zmianę składu zbiorowisk roślinnych (np. ⁹) na obieg składników odżywczych w ekosystemie. Taka kwantyfikacja może pomóc w ujawnieniu mechanizmów, za pomocą których zwierzęta kontrolują dynamikę ekosystemu w ramach wspólnych wysiłków na rzecz ulepszenia i rewizji obecnego paradygmatu roboczego kontroli biotycznej nad funkcjonowaniem ekosystemu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektroskop pierścieniowy z wnęką	Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA	Model # G1101-i
Respirometr CO2	Qubit Systems, Kingston, ON, Kanada	Model # S151
13C	Sigma-Aldrich	372382
Spektrofotometr	Thermo, San Jose, CA, USA	Model: Spektrofotometr masowy Delta V Plus Isotope Ratio