Artykuł metodologiczny

Powiązanie ryzyka drapieżnictwa, stresu fizjologicznego roślinożerców i mikrobiologicznego rozkładu ściółki roślinnej

DOI:

10.3791/50061

⸱

12 marca 2013

 ,  ,  , 
1School of Forestry and Environmental Studies, Yale University, 2Department of Biological Sciences, Virginia Tech, 3Department of Ecology, Evolution and Behavior, The Hebrew University of Jerusalem

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metody oceny, jak ryzyko drapieżnictwa może zmienić jakość chemiczną ofiar roślinożerców, wywołując zmiany w diecie, aby sprostać wymaganiom zwiększonego stresu, oraz jak rozkład zwłok tych zestresowanych roślinożerców spowalnia późniejszy rozkład ściółki roślinnej przez mikroby glebowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilość i jakość detrytusu dostającego się do gleby określa tempo rozkładu przez społeczności mikrobiologiczne, jak również wskaźniki recyklingu sekwestracji azotu (N) i węgla (C)1,2. Ściółka roślinna składa się z większości detrytusu3, w związku z czym zakłada się, że na rozkład tylko w niewielkim stopniu wpływa biomasa pochodząca od zwierząt takich jak roślinożercy i mięsożercy4,5. Drapieżniki mogą jednak wpływać na rozkład mikrobiologiczny ściółki roślinnej poprzez łańcuch interakcji, w którym ryzyko drapieżnictwa zmienia fizjologię ich ofiar roślinożerców, co z kolei zmienia funkcjonowanie mikroorganizmów glebowych, gdy zwłoki roślinożerców ulegają rozkładowi6. Fizjologiczna reakcja roślinożerców na stres związany z ryzykiem drapieżnictwa może zmienić skład pierwiastkowy C:N biomasy roślinożerców7,8,9, ponieważ stres spowodowany ryzykiem drapieżnictwa zwiększa podstawowe zapotrzebowanie energetyczne roślinożerców, które w systemach o ograniczonej zawartości składników odżywczych zmusza roślinożerców do przeniesienia spożycia z zasobów bogatych w N, aby wspierać wzrost i reprodukcję, do zasobów węglowodanowych bogatych w C, aby wspierać zwiększony metabolizm6. Roślinożercy mają ograniczoną zdolność do magazynowania nadmiaru składników odżywczych, więc zestresowani roślinożercy wydalają N,zwiększając spożycie węglowodanów C. Ostatecznie ofiary zestresowane ryzykiem drapieżnictwa zwiększają stosunek C:N w organizmiedo 7,10, co czyni je gorszymi zasobami jakości dla puli mikrobiologicznej gleby, prawdopodobnie z powodu mniejszej dostępności labilnego azotu do produkcji enzymów mikrobiologicznych6. Tak więc rozkład zwłok zestresowanych roślinożerców ma wpływ pobudzający funkcjonowanie zbiorowisk drobnoustrojów, co zmniejsza późniejszą zdolność drobnoustrojów do rozkładu ściółki roślinnej6,10,11.

Przedstawiamy metodologię oceny powiązań między ryzykiem drapieżnictwa a rozkładem ściółki przez mikroorganizmy glebowe. Opisujemy, jak: wywołać stres u roślinożerców spowodowany ryzykiem drapieżnictwa; Zmierz te reakcje na stres i zmierz ich wpływ na rozkład mikrobiologiczny. Korzystamy z informacji pochodzących z modelowego ekosystemu trawiastego obejmującego polującego drapieżnika pająka (Pisuarina mira), dominującego roślinożercę konika polnego (Melanoplus femurrubrum) oraz różnych roślin trawiastych i trawiastych9.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla koników polnych w warunkach stresu i bez stresu

  1. Użyj okrągłych, zamkniętych mezokosmosów o powierzchni 0,5m2, aby zapobiec emigracji lub imigracji gatunków zwierząt (ryc. 1). Zbuduj mezokosmosy, używając 2,4 m długości aluminiowego ogrodzenia z siatki 1,5 m o wysokości 1/4 "jako rusztowania. Przykryj ogrodzenie aluminiowymi osłonami okiennymi o długości 2,5 m i wysokości 1,75 m, złożonymi na górze i na dole ogrodzenia i zszytymi razem wzdłuż zagięcia. Połącz końce ogrodzenia, aby utworzyć zamknięty okrąg, a następnie zszyj ze sobą nakładające się na siebie osłony okienne, aby utworzyć uszczelnienie. Umieść mezokosmos w glebie na polu, kopiąc rów o głębokości 10 cm i szerokości 4 cm wokół podstawy mezokosmosu, zatop mezokosmos w rowie, a następnie ubij darń rowu wokół zatopionej części mezokosmosu. Zszyj okrągły kawałek osłony okiennej do górnej części mezokosmosu.
  2. Tablica mezokosmosów w replikowanym sparowanym projekcie eksperymentalnym w terenie. Lokalizacje działek powinny być dobrane tak, aby odpowiadały tożsamości gatunkowej roślin i względnemu pokryciu roślin. Klatki wpuszczać 10 cm w ziemię na działce.
  3. Za pomocą siatki zamiatającej zbieraj wczesne (2nd) nimfy konika polnego w stadium rozwojowym i umieszczaj je w mezokosmosach w naturalnych zagęszczeniach pól.
  4. Za pomocą siatki zamiatającej chwytaj osobniki dominującego gatunku pająka polującego (nie tkającego sieć) na polowanie. Klej zamyka pajęcze chelicerae (aparaty gębowe używane do ujarzmiania zdobyczy) szybkoschnącym cementem, aby oddzielić efekty ryzyka wynikające z rzeczywistej selekcji przetrwania, faworyzując poszczególne koniki polne z lepszymi zdolnościami do unikania drapieżnictwa pająków. Trzymaj pająki w zagęszczeniach pól do jednego mezokosmosu każdej pary. To będzie leczenie stresu. Mezokosmosy bez pająków będą bezstresowym leczeniem.
  5. Pozwól nimfom konika polnego rozwinąć się do późnych (4 i 5) stadiów rozwojowych. Zbierz wszystkie osobniki z klatek i losowo przypisz osobniki z każdej klatki do jednej z trzech kolejnych grup testów: (1) walidacja stanu stresu fizjologicznego; (2) walidacja przesunięcia w stechiometrii pierwiastków ciała; (3) Rozkład mikrobiologiczny.

2. Sprawdzanie stanu stresu u konika polnego

  1. Zmierz standardową przemianę materii konika polnego (SMR) jako szybkość emisji dwutlenku węgla (figure-protocol-1) w przepływowym systemie respirometrycznym o natężeniu przepływu powietrza 200 ml/min. Usuń parę wodną, przepuszczając przepływające powietrze przez środek suszący.
  2. Po 16-godzinnym braku pożywienia (powinna być dostępna woda) zważyć poszczególne koniki polne (±0,1 mg) i umieścić je w przezroczystych komorach respirometrycznych o pojemności 50 ml (9,2 cm dł. x 2,0 cm gł.) i pozwolić im dojść do siebie po obchodzeniu się z nimi przez co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem pomiarów.
  3. Przy stałej średniej temperaturze otoczenia (temperatura ± 1% odchylenia błędu standardowego) w komorze respirometru należy analizować oddychane powietrze za pomocą analizatora CO2 w podczerwieni (np. Kubit S151 - rozdzielczość 1 ppm). Zmierz średni minimalny stan ustalony figure-protocol-2 przez 10 minut.
  4. Analizator podaje ułamkowe stężenie CO2 (części na milion), ale SMR powinien być podawany jako szybkość, więc należy przekształcić nagrania jako figure-protocol-3 gdzie figure-protocol-4 figure-protocol-5 figure-protocol-6 figure-protocol-7 przyjmuje się, że u zwierząt roślinożernych wynosi 0,85.

3. Walidacja zmiany w stechiometrii pierwiastków ciała

  1. Oceń zawartość węgla:azotu (C:N) w próbce koników polnych pobranych z mezokosmosów terenowych.
  2. Zmniejsz zmienność C:N spowodowaną niedawnym spożyciem żywności, usuwając zawartość jelit konika polnego pod mikroskopem preparacyjnym.
  3. Liofilizuj puste jelito i ciało przez 48 godzin, a następnie zmiel poszczególne tusze i jelita na jednorodny proszek.
  4. Zmierzyć zawartość C:N w proszku za pomocą autoanalizatora CNH.

4. Rozkład mikrobiologiczny

  1. Umieść zduplikowane pary kołnierzy z PVC (średnica 15,4 cm, włożone ~4 cm w glebę) na terenie pola (Rysunek 3C). Usuń w nich całą roślinność poprzez przycinanie na powierzchni gleby. Obroże te służą do pomiarów rozkładu. Dodatkowo należy ustawić zestaw kołnierzy z PVC na całym terenie, aby działały jako kontrola naturalnej liczebności 13C (patrz poniżej), do których nie dodaje się koników polnych ani ściółki z trawy.
  2. Do jednej obroży w każdej parze dodaj 2 nienaruszone, liofilizowane tusze koników polnych (zapisz dodaną biomasę) hodowanych z narażeniem na ryzyko drapieżników, jak opisano powyżej, przy użyciu klatek polowych. Do drugiej obroży w każdej parze dodaj 2 nienaruszone liofilizowane tusze hodowane bez ryzyka drapieżnika.
  3. Przykryj kołnierze PCV ekranem, aby zapobiec usunięciu konika polnego przez padlinożerców z działek i pozwól tuszom konika polnego rozkładać się przez 40 dni.
  4. Podczas rozkładu tusz ściółkę z trawy należy oznaczyć temperaturą 13C.
    1. Zbuduj przezroczystą komorę z pleksi (60 cm x 60 cm x 1,5 m) z zaworem wlotowym i wylotowym (Rysunek 3B).
    2. Wbij kwadratową drewnianą ramę o wymiarach 60 cm x 60 cm z gumową uszczelką pokrytą smarem silikonowym na 5 cm w ziemię (Rysunek 3B).
    3. Wsuń komorę na drewnianą ramę tak, aby komora została uszczelniona gumą (Rysunek 3B).
    4. Podłączyć wloty komory do butli ze sprężonym gazem zawierających 99% atomów 13CO2 . Rośliny wewnątrz komory będą oznaczone temperaturą 13C, w której stężenia CO2 są utrzymywane na poziomie otoczenia (ponieważ podwyższone stężenia zmieniają podział węgla w roślinach). Poziomy otoczenia są utrzymywane tylko przez pulsacyjne znakowanie CO2 przez krótkie okresy czasu. Monitorowane są również temperatury w komorze i komory są usuwane, jeśli temperatura osiągnie 5 °C powyżej temperatury otoczenia.
    5. Tydzień po oznakowaniu należy porównaćδ 13°C ściółki z naturalnymi wartościami liczebności pobranymi z losowej próbki identycznych gatunków traw za pomocą spektrometru masowego o stosunku izotopów Thermo DeltaPlus (Thermo, San Jose, CA, USA).
  5. Po 40 dniach dodaj 10 g wysuszonej na powietrzu ściółki z 13traw z oznakowaniem C do każdej obroży, która została wcześniej zmodyfikowana tuszami koników polnych.
  6. Monitoruj tempo mineralizacji ściółki z trawy in situ przez 75 dni, zakrywając każdy kołnierz i śledząc zarówno całkowite oddychanie gleby, jak i oddychanie 13CO2 . Osiąga się to za pomocą techniki komory przepływowej, w której próbki gazu z każdego kołnierza są monitorowane w czasie rzeczywistym przez 8 minut każda za pomocą spektroskopii pierścieniowej w jamie (CRDS; Picarro Inc., Santa Clara, Kalifornia, Stany Zjednoczone; Model: G1101-i). CRDS umożliwia jednoczesne śledzenie zarówno całkowitej, jak iδ 13C oddychania gleby.
  7. Oszacuj udział 13ściółki z trawy znakowanej znakiem C w całkowitym oddychaniu gleby za pomocą równań mieszania izotopów. Ilość CO2 pochodzącego z ściółki z traw oblicza się w następujący sposób: Cpochodzącego z ściółki = C× całkowitego (δ13Coddychania - δ13Cnat.abn.)/ (δ13Cściółki z trawy - δ13Cnat.abn), gdzieC ogółem to całkowita ilość C oddychanego podczas danego pomiaru, δ13Coddychania to δ13C oddychania-C dla obroży wzbogaconych oznakowanym ściółką z trawy, δ13Cnat.abn. oznacza średnią δ13C wdychanego C w trzech obrożach z naturalną obfitością (tj. tych, które nie zostały wzbogacone ściółką), a δ13Cściółki z trawy to δ13C ściółki z trawy dodanej do obroży.
  8. Monitoruj zarówno temperaturę, jak i wilgotność gleby w całym eksperymencie za pomocą ręcznych sond, aby skorygować różnice w oddychaniu gleby spowodowane różnicami w temperaturze i wilgotności.
  9. Chociaż przeznaczony do użytku w terenie, instrument do spektroskopii pierścieniowej (Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Model: G1101-i) odczyty są wrażliwe na ruch. W związku z tym należy postawić centralną stację pomiarową na wszystkich działkach, na których znajdują się kołnierze z PCV i połączyć przyrząd z kołnierzami za pomocą odcinków rurek PVC.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykładowy wykres standardowych wskaźników metabolizmu koników polnych w warunkach stresu i bezstresowych jest przedstawiony na rysunku 2. Ze względu na różnice w masie ciała poszczególnych koników polnych oraz fakt, że tempo przemiany materii zmienia się wraz z masą ciała, wykresy powinny przedstawiać tempo metabolizmu w stosunku do masy ciała konika polnego. Równoległe trendy dla różnych metod leczenia wskazują, że tempo przemiany materii wzrasta jako stała wielokrotność standardowej przemiany materii (tj. nie ma interakcji masa ciała x tempo przemiany materii) u wszystkich osób zestresowanych.

Zawartość pierwiastków C i N w ciele konika polnego w warunkach ryzyka i wolnego od ryzyka jest przedstawiona w Tabeli 1. Warto zauważyć, że różnica w stosunku C:N w organizmie między zabiegami jest bardzo mała (4%). Niemniej jednak te niewielkie różnice mogą przekładać się na duże różnice w rozkładzie ściółki trawiastej przez pulę mikrobiologiczną gleby (ryc. 3).

Dodawanie ściółki z trawy do obroży z PVC, które wcześniej zostały zmodyfikowane o zestresowane lub bezstresowe koniki polne, prowadzi do różnych stopni rozkładu ściółki, co znajduje odzwierciedlenie w krzywych opisujących kumulację uwalniania CO2 z gleby w wyniku oddychania mikrobiologicznego (Rysunek 3). Eksperymenty należy monitorować do momentu, aż krzywe kumulatu zaczną się nasycać.

stres Bez stresu Węgiel (%) 48,44±0,32 44,73±0,46 Azot (%) 12.11±0.08 11,62±0,12 Węgiel: Azot 4.00±0.03 3,85±0,04

Tabela 1. Porównanie składu chemicznego tusz koników polnych roślinożerców w warunkach, w których były one narażone na ryzyko drapieżnictwa (stres) i w których ryzyko drapieżnictwa nie występowało (wolne od stresu). Wartości są średnimi ± 1 błędem standardowym.

figure-results-1
Rysunek 1. Ilustracja projektu mezokosmosów terenowych wykorzystanych w doświadczeniu oraz ogólny schemat eksperymentalnej oceny wpływu ryzyka na rozkład ściółki.

figure-results-2
Rysunek 2. Wykres standardowego tempa metabolizmu roślinożerców w stosunku do masy ciała roślinożerców. Dane podzielono na dwie klasy w zależności od traktowania eksperymentalnego: koniki polne z mezokosmosów zawierających drapieżniki (drapieżnictwo) w celu wywołania stresu oraz mezokosmosy bez drapieżników (kontrola), a zatem bez stresu indukowanego. Dane pochodzą z D. Halwena i O.J. Schmitz 2010, niepublikowane.

figure-results-3
Rysunek 3. Krzywe opisujące skumulowane uwalnianie CO2 przez pulę mikrobiologiczną podczas rozkładu eksperymentalnych ilości ściółki z trawy w kołnierzach z PVC. Wykreślone wartości są średnimi ± 1 błędem standardowym. Wykres pokazuje, że gleby zagruntowane tuszami koników polnych (drapieżników) skutkują o 19% niższymi (ANOVA F1,6 = 9,06, P < 0,05) wskaźnikami rozkładu ściółki roślinnej niż gleby zagruntowane tuszami koników polnych wolnych od stresu (kontrola). Wstawka przedstawia aparat z kołnierzem PVC w terenie. Rysunek reprodukowany z Hawlena et al.6 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tu sekwencja metod powinna pozwolić na systematyczny pomiar sposobu, w jaki stres u gatunków tworzących nadziemne sieci pokarmowe może pobudzać zbiorowiska mikroorganizmów glebowych w sposób, który prowadzi do zmiany późniejszego rozkładu ściółki roślinnej. Metody te są idealne do badania ekosystemów składających się z konsumentów stawonogów i roślin zielnych, ponieważ nienaruszone sieci pokarmowe mogą być ograniczone przestrzennie i zawarte w mezokosmosach.

Zmienność przestrzenna może występować ze względu na gradienty wilgotności tła gleby, temperatury gleby, zawartości składników odżywczych roślin itp. Projekt badania pozwala na ustawienie mescosmów i kołnierzy PVC w celu zablokowania wzdłuż przestrzennych gradientów środowiskowych, a tym samym uwzględnienia takiej zmienności środowiskowej podczas analizy efektów.

Chociaż przeznaczony do użytku w terenie, instrument do spektroskopii pierścieniowej (Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Model: G1101-i) odczyty są wrażliwe na ruch. W związku z tym należy postawić centralną stację pomiarową na wszystkich działkach, na których znajdują się kołnierze z PCV i połączyć przyrząd z kołnierzami za pomocą odcinków rurek PVC.

Rozkład ściółki glebowej tradycyjnie mierzy się poprzez zamknięcie znanych ilości ściółki w workach z siatki z włókna szklanego, osadzenie worków na powierzchni gleby na polu i okresowe ponowne mierzenie worków w celu ilościowego określenia szybkości zanikania (rozkładu) ściółki. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie można prześledzić losów rozłożonej materii ani określić udziału w mineralizacji CO2 dodatku do gleby (dodanej ściółki) z tła mineralizacji gleby CO2 . Przedstawiona tutaj metoda śledzenia wykorzystująca znakowany CO2 pomaga złagodzić to ograniczenie logistyczne.

Ekologia ekosystemów i biogeochemia funkcjonują w oparciu o paradygmat roboczy, zgodnie z którym ponieważ niezjedzona ściółka roślinna składa się z większości detrytusu, na podziemne procesy ekosystemowe tylko marginalny wpływ mają dopływy biomasy z wyższych poziomów troficznych w nadziemnych sieciach pokarmowych, takich jak same roślinożercy6. Istnieje jednak coraz więcej dowodów na to, że gatunki żyjące na wyższych poziomach troficznych ekosystemów mogą mieć głęboki wpływ na procesy zachodzące pod ziemią1,4,5. Przedstawiona tutaj metoda ma na celu poprawę kwantyfikacji wpływu wyższych poziomów troficznych, albo bezpośrednio poprzez biomasę z depozycji tuszy (np. 12, 13) lub wydalania i degestacji (np. 14, 15), albo pośrednio poprzez zmianę składu zbiorowisk roślinnych (np. 9) na obieg składników odżywczych w ekosystemie. Taka kwantyfikacja może pomóc w ujawnieniu mechanizmów, za pomocą których zwierzęta kontrolują dynamikę ekosystemu w ramach wspólnych wysiłków na rzecz ulepszenia i rewizji obecnego paradygmatu roboczego kontroli biotycznej nad funkcjonowaniem ekosystemu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez fundusze z Instytutu Klimatu i Energii Yale oraz Narodowej Fundacji Nauki USA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spektroskop pierścieniowy z wnękąPicarro Inc., Santa Clara, CA, USAModel # G1101-i
Respirometr CO2Qubit Systems, Kingston, ON, KanadaModel # S151
13CSigma-Aldrich372382
SpektrofotometrThermo, San Jose, CA, USAModel: Spektrofotometr masowy Delta V Plus Isotope Ratio

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wardle, D. A., et al. Ecological linkages between aboveground and belowground biota. Science. 304, 1629-1633 (2004).
  2. Hattenschwiler, S., Tiunov, A. V., Scheu, S. Biodiversity and litter decomposition in terrestrial ecosystems. Annu. Rev. Ecol. Syst. 36, 191-218 (2005).
  3. Cebrian, J. Role of first-order consumers in ecosystem carbon flow. Ecol. Lett. 7, 232-240 (2004).
  4. Aboveground-Belowground Linkages. Bardgett, R. D., Wardle, D. A. , Oxford University Press. Oxford. (2010).
  5. Schmitz, O. J., Hawlena, D., Trussell, G. C. Predator control of ecosystem nutrient dynamics. Ecol. Lett. 13, 1199-1209 (2010).
  6. Hawlena, D., Strickland, M. S., Bradford, M. A., Schmitz, O. J. Fear of predation slows plant litter decomposition. Science. 336, 1434-1438 (2012).
  7. Hawlena, D., Schmitz, O. J. Physiological stress as a fundamental mechanism linking predation to ecosystem functioning. Am. Nat. 176, 537-556 (2010).
  8. Stoks, R. D. eB. lock, M,, McPeek, M. A. Alternative growth and energy storage responses to mortality threats in damselflies. Ecol. Lett. 8, 1307-1316 (2005).
  9. Hawlena, D., Schmitz, O. J. Herbivore physiological response to predation risk and implications for ecosystem nutrient dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15503-15507 (2010).
  10. Schimel, J. P., Weintraub, M. N. The implications of exoenzyme activity on microbial carbon and nitrogen limitation in soil: a theoretical model. Soil Biol. Biochem. 35, 1-15 (2003).
  11. Allison, S. D., et al. Low levels of nitrogen addition stimulate decomposition by boreal forest fungi. Soil Biol. Biochem. 41, 293-302 (2009).
  12. Bump, J. K., et al. Ungulate carcasses perforate ecological filters and create biogeochemical hotspots in forest herbaceous layers allowing trees a competitive advantage. Ecosystems. 12, 996-1007 (2009).
  13. Yang, L. H. Periodical cicadas and resource pulses in North American forests. Science. 306, 1565(2004).
  14. Belovsky, G. E., Slade, J. B. Insect herbivory accelerates nutrient cycling and increases plant production. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14412(2000).
  15. Frost, C. J., Hunter, M. D. Recycling of nitrogen in herbivore feces: plant recovery, herbivore assimilation, soil retention, and leaching losses. Oecologia. 151, 42(2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stosunek w gla do azotutusza konika polnegooddychanie glebyspektroskopia wn ki optycznej CRDSr wnania mieszania izotopowegoprojekt eksperymentalny mezokosmosu

Powiązane artykuły