C. elegans Test chemotaktyksy

Summary

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

Abstract

Wiele organizmów wykorzystuje chemotaksję do poszukiwania źródeł pokarmu, uniknięcia szkodliwych substancji i znalezienia partnerów. Caenorhabditis elegans ma imponujące zachowanie chemotaksyczne.

Założeniem testowania reakcji robaków na czynnik zapachowy jest umieszczenie ich w danym obszarze i obserwacja ruchu wywołanego w reakcji na czynnik zapachowy. Nawet z wieloma dostępnymi testami, optymalizacja początkowego położenia robaków względem zarówno obszarów kontrolnych, jak i testowych, minimalizując jednocześnie interakcję robaków między sobą, przy zachowaniu znaczącej wielkości próby, pozostaje nadal w trakcie prac ^1-10. Opisana tu metoda ma na celu rozwiązanie tych problemów poprzez zmodyfikowanie testu opracowanego przez Bargmann et al.¹. Podziemka jest podzielona na cztery kwadrany, dwa przeciwległe kwadrany oznaczone jako "Test" i dwa oznaczone jako "Kontrola". Anestetyk jest umieszczany we wszystkich miejscach testowych i kontrolnych. Robaki są umieszczane na środku płytki z zaznaczonym okręgiem wokół punktu początkowego, aby upewnić się, że nieruchome robaki zostaną zignorowane. Wykorzystanie systemu czterech kwadriantów zamiast jednego 2 lub dwóch 1 eliminuje zniekształcenie w ruchu robaków, ponieważ są one w równej odległości od próbek testowych i kontrolnych, niezależnie od tego, z której strony punktu początkowego się zaczynają. To eliminuje problem zmuszania robaków do przejścia przez skupisko innych robaków, aby odpowiedzieć na czynnik zapachowy, co może opóźniać robaki lub zmusić je do zajęcia bardziej krętej trasy, co prowadzi do niewłaściwej interpretacji ich zamierzonej ścieżki. Ta metoda ma również zalety praktyczne, ponieważ ma większą wielkość próby i pozwala badaczowi przeprowadzić test bez nadzoru i oceniać robaki po upływie wyznaczonego czasu.

Introduction

Ward jako pierwszy opracował test chemotaksyczny w 1973 roku ⁵, a od tego czasu ma on dalekosiężne zastosowania. Neurobiologia to jedna z dziedzin, która skorzystała na używaniu różnych testów chemotaksycznych. Adaptacja węchowa, prosta forma uczenia się i pamięci, została wykazana u C. elegans za pomocą testów chemotaksycznych ⁶. Były one również używane do wykazania, że C. elegans może rozwinąć tolerancję na etanol - wynik, który nie tylko pokazuje plasticzność zachowań robaków, ale również pokazuje, że robaki mogą być bardzo przydatne w badaniu uzależnienia od alkoholu u ludzi ³. Testy zostały nawet opracowane, aby wykazać zdolność C. elegans do przechowywania pamięci krótko- i długoterminowej, pokazując, że robaki nawiązują powiązania między chemoatraktantami a pokarmem (OP50) ⁷. Ponadto, biorąc pod uwagę ogromne informacje dostępne obecnie dotyczące genomu C. elegans, zachowanie chemotaksyczne C. elegans zostało wielokrotnie modyfikowane poprzez indukowanie mutacji ^1,8. Umożliwia to wiele ekscytujących możliwości inżynieryjnych, takich jak opracowanie C. elegans jako narzędzia do bioremediacji. W ten sposób, od początkowego opracowania testu chemotaksycznego w 1973 roku, był on często modyfikowany i stosowany do wyjaśniania tajemnic w różnych dziedzinach.

Pewne testy miały na celu odkrycie konkretnej ścieżki podejmowanej przez robaki w kierunku celu. Pierwowzór takiego testu został opracowany przez Warda ⁵. Trzy robaki umieszczano na stopionym agarze na 15 minut. Ich ruchy były śledzone przez ślad, jaki zostawiały podczas przemieszczania się od krawędzi płytki w górę gradientu do atrakcyjnego bodźca w centrum płytki. Wszystkie robaki na płytce były zatrzymywane za pomocą chloroformu pod koniec każdego eksperymentu. Jeden z potomków tej metody umieszczał pojedynczy robak na środku płytki z atrakcyjnym bodźcem i kontrolą w równych i przeciwległych odległościach od punktu początkowego ².

Pierce-Shimomura et al. opracował test w celu obserwacji dokładnej natury ruchu zaangażowanego w chemotaksję⁹. Pojedyncze robaki umieszczano w 9 cm naczyniach Petriego zawierających jednolitą koncentrację atrakcyjnego bodźca lub radialny gradient, kończący się w źródle atrakcyjnego bodźca. Program komputerowy, który rozpoznawał robaka, był używany do rejestracji obserwowanego zachowania. Kamera wideo podłączona do mikroskopu pracowała w połączeniu z etapem, aby automatycznie dostosowywać naczynie Petriego podczas trwania testu, aby zapewnić, że robak pozostawał w polu widzenia. Z tego wynikało bardziej szczegółowe zrozumienie przyczyny piruetów wykonywanych przez C. elegans.

Inne testy, bardziej podobne do tego opisany tutaj, testowały reakcję dużej populacji robaków na badane związki. Testy chemotaksyczne dwudzielne były używane do zbadania ról, jakie odgrywały różne neurony, receptory i cząsteczki transdukcji sygnału, gdy C. elegans był narażony na różne związki ¹. Pomiędzy 20-50 umytych robaków umieszczano w pobliżu środka płytki z atrakcyjnym bodźcem i kontrolą na przeciwległych końcach wraz z anestetykiem, azydem sodu (NaN₃). Po 60 minutach generowano wskaźnik chemotaksyczny o wartościach od -1,0 do +1,0 w oparciu o różnicę między liczbą robaków przymocowanych do atrakcyjnego bodźca lub kontroli. Podobny wskaźnik chemotaksyczny był używany w teście opisanym w tym artykule, chociaż wcześniejszy test nie oceniał ściśle robaków bezruchowych. Test ten został następnie zastosowany do badania wpływu usunięcia neuronów na chemotaksję.

Inna odmiana wspomnianego wcześniej testu została przeprowadzona, gdzie 100-200 robaków umieszczano na środku płytki zawierającej cztery kwatery ³. Przylegające kwatery zawierały albo substancję badaną albo kontrolną. Podobnie jak w poprzednich testach, robaki były unieruchomione działaniem azydu sodu przed wyliczeniem. Podobna metoda jest opisana tutaj jako sposób oceny reakcji C. elegans na różne związki. Jednakże, poniższa metoda ma dodatkową zaletę polegającą na ocenie tylko robaków, które przeszły próg odległości oddzielającej ruchome od nieruchomych robaków.

Inne testy włączyły podobne wytyczne do ignorowania nieruchomych robaków. Frøkjær-Jensen et al. opracował wszechstronny test, który może być używany do badania zarówno lotnych, jak i rozpuszczalnych w wodzie związków ¹⁰. Naczynie Petriego było podzielone na cztery kwatery. Górne i dolne kwatery nie zawierały rozpuszczalników. Lewa kwatera zawierała wodę, a prawa atrakcyjny bodźca. Podczas testowania lotnych substancji zapachowych, analizat był umieszczany na pokrywie naczynia, nad odpowiednią kwaterą, podczas gdy substancje rozpuszczalne w wodzie były umieszczane bezpośrednio na agarze.

Metody obecnie istniejące do oceny reakcji chemotaksycznej

Protocol

1. Przygotowanie/płukanie robaków

1. Synchronizuj robaki na młode dorosłe¹¹.
2. Pipetą wymieszaj 2 ml S Basal na 5 cm płytce Chemotaxis z umieszczonymi na niej synchronizowanymi robakami, które właśnie opuściły dywan OP50 E. coli. Nachyl płytkę w miarę potrzeby, aby upewnić się, że robaki są spłukiwane z powierzchni płytki do buforu.
3. Pipetą wymieszaj 1 ml roztworu robaków-S Basal w mikroprobówce.
4. Wiruj przez 10 s w mikrowirusówce PicoFuge z prędkością 6600 obr./min.
5. Zasosuj S Basal, pozostawiając osadu robaków w spokoju.
6. Dodaj 1 ml roztworu S Basal do mikroprobówki, odwróć kilka razy, aby spłukać robaki.
7. Powtórz kroki 1.4 do 1.6 jeszcze trzy razy.
8. Wiruj po raz piąty przez 10 s, zasosowując tym razem nadstan do końcowej objętości ok. 100 μl.
9. Pipetą uzyskaj 2 μl robaków na płytce NGM, aby upewnić się, że w każdej próbce 2 μl znajduje się od 50 do 250 robaków. Skoryguj stężenie robaków w S Basal w razie potrzeby, ponownie zawieszając robaki w mniejszej lub większej objętości S Basal.
10. Używaj robaków w badaniu natychmiast po ich płukaniu, do maks. 1 godziny.

2. Przygotowanie płytek testowych

1. Zaznacz spodnia stronę 5 cm płytki, podzielając miskę na 4 równe ćwiartki. Można użyć agaru chemotaksycznego lub NGM. Wymagane jest minimum 3 próby na każdą badaną genetycznie odmianę.
2. Zaznacz okrąg o promieniu 0,5 cm wokół początku (Rysunek 1).
3. Zaznacz punkt w każdej ćwiartce albo "T" dla "Test" albo "C" dla "Kontrola", upewniając się, że punkty są równo oddalone od początku i od siebie. Punkty muszą znajdować się co najmniej 2 cm od początku. Zaznacz górne lewe i dolne prawe ćwiartki jako ćwiartki testowe, a górne prawe i dolne lewe ćwiartki jako kontrolne (Rysunek 1).

3. Przeprowadzanie badania

1. Wymieszaj roztwór testowy, łącząc równe objętości związku testowego i 0,5 M azydu (znieczulającego środka używanego do zahamowania robaków po dotarciu do ćwiartki). Wymieszaj roztwór kontrolny, łącząc rozpuszczalnik użyty do rozcieńczenia związku testowego z 0,5 M azydu.
2. Pipetą wymieszaj 2 μl roztworu robaków (przygotowanego w punkcie 1.8) z osadu na początek (gdzie linie się przecinają).
3. Natychmiast potem, pipetą wymieszaj 2 μl roztworu testowego na dwóch punktach "T". Podobnie, pipetą wymieszaj tyle samo roztworu kontrolnego na dwóch punktach "C".
4. Gdy krople robaków i środka zapachowego zostaną wchłonięte przez agar, zasuń pokrywki i odwróć płytki.
5. Po 60 min. umieść robaki w inkubatorze 4 °C. Wyjmuj płytkę z inkubatora tylko wtedy, gdy można przeliczyć robaki. Pozostawienie robaków w temperaturze pokojowej może pozwolić im na ponowne ruchomy.
6. Zapisz liczbę robaków w każdej ćwiartce, które w całości przeszły przez wewnętrzny okrąg.
7. Powtórz kroki 3.2 do 3.6 używając roztworu kontrolnego zarówno na ćwiartkach testowych, jak i kontrolnych. To będzie służyło jako płytka kontrolna. Powinno się wykonać trzy takie płytki i przeprowadzić badanie, aby uzyskać odpowiednie dane kontrolne.

4. Interpretacja wyników/wyznaczanie indeksu chemotaksy

1. Oblicz indeks chemotaksy za pomocą Równania 1. Wynik ten będzie wskazywał indeks chemotaksy w zakresie od -1,0 do +1,0.

(1)

Indeks Chemotaxis = (# Robaków w obu ćwiartkach testowych - # Robaków w obu ćwiartkach kontrolnych) / (Całkowita liczba ocenowanych robaków)

Wynik +1,0 wskazuje na maksymalną atrakcję dla celu i reprezentuje 100% robaków osiągających ćwiartki zawierające chemiczny cel. Indeks -1,0 jest dowodem maksymalnej odpychania. Podobne metody badań zostały już zastosowane ³ (Tabela 1).

2. Zgłoś średni indeks chemotaksy (CI) i błąd standardowy średniej (SEM). Wykonaj test Studenta porównując dane z płytek testowych i kontrolnych.

Results

Porównanie dzikiego typu (N2) C. elegans z mutantem odr-10(ky10).

Do porównania robaków dzikiego typu z mutantem pozbawionym receptora dla diacetylu użyliśmy diacetylu, znanego chemoatraktantowi C. elegans ^1,12. Dla robaków dzikiego typu (N2) wskaźnik chemotaksyczny wynosił 0,100 ± 0,066 dla etanolu i 0,839 ± 0,031 dla 0,5% diacetylu. Jak było spodziewać się, diacetyl wywołał znaczącą reakcję chemotaksyczną u robaków dzikiego typu (P < 0,003). W przeciwieństw...

Discussion

Chemotaxis, choć kontrolowana przez złożony zestaw mechanizmów neuronowych i komórkowych, może być łatwo i obiektywnie zmierzona za pomocą testów chemotaksy. Aby uzyskać najlepsze wyniki z testów, należy podjąć pewne kluczowe kroki. Po pierwsze, ustalenie stadiów rozwojowych dżdżownic jest niezbędne do uzyskania spójnych wyników eksperymentalnych. Dżdżownice na różnych etapach życia zachowują się inaczej ¹³; więc mieszane stadiowo dżdżownice mogą zakłócić wyniki eksperymentu. Po drugie, upewnienie się, że ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O do 1 litra.] Autoklaw
PicoFuge	Stratagene	400552
Mikroskopy	Leica
Do sekcjonowania	Leica
Pipeta P1000	Gilson
Pipeta P10	Gilson
0.5 M Azyd sodu
Agar Chemotaxis [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) lub 2% Difco-agar. Autoklaw. Dodaj 5 mM fosforanu potasu, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Etanol/Woda destylowana
Związki testowe (np. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531