Przedstawiono modyfikację błony komórkowej czerwonych krwinek (RBC) za pomocą hiperrozgałęzionego poliglicerolu (HPG). Zmodyfikowane erytrocyty charakteryzowały się wodnym dwufazowym podziałem, kruchością osmotyczną i lizą za pośrednictwem dopełniacza. Kamuflaż białek powierzchniowych i antygenów oceniano za pomocą kart do fenotypowania krwi za pomocą cytometrii przepływowej i systemu mikrotypowania (MTS).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Antygeny chroniły funkcjonalne czerwone krwinki przez szczepienie błonowe zwartych, hiperrozgałęzionych poligliceroli
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transfuzja czerwonych krwinek (RBC) jest niezbędna w leczeniu wielu ostrych i przewlekłych problemów medycznych, takich jak talasemia większa i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa 1-3. Ze względu na obecność wielu antygenów na powierzchni erytrocytów (~308 znanych antygenów 4), pacjenci w przewlekłej terapii transfuzji krwi wytwarzają alloprzeciwciała z powodu braku dopasowania mniejszych antygenów na przetoczonych krwinkach czerwonych 4, 5. Szczepienie hydrofilowych polimerów, takich jak glikol polietylenowy (PEG) i hiperrozgałęziony poliglicerol (HPG), tworzy warstwę wykluczającą na błonie RBC, która zapobiega interakcji przeciwciał z antygenami powierzchniowymi bez wpływu na przechodzenie małych cząsteczek, takich jak tlen, glukoza i jony3. Obecnie nie jest dostępna żadna metoda wytwarzania uniwersalnych czerwonych komórek dawcy krwi, częściowo ze względu na zniechęcające wyzwanie, jakim jest obecność dużej liczby antygenów (opartych na białkach i węglowodanach) na powierzchni krwinek czerwonych, a opracowanie takich metod znacznie poprawi bezpieczeństwo transfuzji oraz radykalnie poprawi dostępność i wykorzystanie krwinek czerwonych. W niniejszym raporcie przedstawiono eksperymenty, które są wykorzystywane do opracowania funkcjonalnych erytrocytów chronionych antygenem poprzez szczepienie błony HPG i ich charakterystykę. HPG są wysoce biokompatybilnymi zwartymi polimerami 6, 7 i oczekuje się, że będą zlokalizowane w glikokaliksie komórkowym otaczającym błonę lipidową 8, 9 i maskują antygeny powierzchniowe RBC10, 11.
Protokół
A. Modyfikacja hiperrozgałęzionego poliglicerolu (SS-HPG)
- Umieścić liofilizowany HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) w kolbie okrągłodennej i wysuszyć przez noc w próżni w temperaturze 90 °C.
- Wstaw kolbę do lodówki do temperatury pokojowej i rozpuść wysuszony HPG w bezwodnej pirydynie (3 ml).
- Aby funkcjonalizować około ośmiu grup hydroksylowych na HPG z grupami karboksylowymi, dodaj katalityczną ilość dimetyloaminopirydyny (jedna kropla 5 mg/ml roztworu w pirydynie) do roztworu HPG. Do tej mieszaniny dodać bezwodnik bursztynowy (0,0067 g, 0,0664 mmol) rozpuszczony w 0,5 ml pirydyny kroplami przez 10 minut. Mieszaj mieszaninę przez noc w tem....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zamaskowanie antygenu Rhesus D oraz białka powierzchniowego RBC CD47 określono ilościowo metodą cytometrii przepływowej z użyciem znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał monoklonalnych, a reprezentatywny wynik przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku RBC przeszczepionych HPG (kolor szary) natężenie sygnału zmalało (pik przesunął się w lewo) w porównaniu do kontrolnych RBC (kolor czerwony i zielony), co wskazuje na zmniejszenie wiązania przeciwciał z powierzchnią komórki, świadczące o maskowaniu białek po.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Erytrocyty od dawców uniwersalnych mają ogromny potencjał w zwiększaniu dostępności krwi i bezpieczeństwa w terapii transfuzjologicznej. Erytrocyty są również uważane za obiecujące nośniki leków ze względu na ich długie krążenie i nieodłączną biokompatybilność 14, 15. Eksperymenty przedstawione w niniejszej pracy oceniają charakterystykę in vitro krwinek czerwonych modyfikowanych HPG. Właściwości in vitro i krążenie in vivo krwinek czerwonych modyfikowanych HPG były badane w naszej .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez Kanadyjskie Służby Krwi (CBS) oraz Fundusz Partnerstwa Badawczego Kanadyjskich Instytutów Nauk o Zdrowiu (CIHR). Autorzy dziękują LMB Macromolecule Hub w Centrum Badań nad Krwią UBC za korzystanie z ich obiektów badawczych. Infrastruktura jest wspierana przez Kanadyjską Fundację Innowacji (CFI) oraz Fundację Michaela Smitha na rzecz Badań nad Zdrowiem (MSFHR). R. Chapanian jest stypendystą (CIHR/CBS) w dziedzinie transfuzjologii oraz stypendystą stażu podoktorskiego MSFHR. J.N. Kizhakkedathu jest laureatem nagrody MSFHR Career Investigator Scholar Award.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Glycidol | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| Trimethylolpropan | Fluka | (ON, Kanada) | |
| Metylan potasu | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| Bezwodna pirydyna | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| 4-dimetyloaminopirydyna | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| Bursztyn bezwodnik | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| Aceton | Fisher Scientific | (ON, Kanada) | |
| Bezwodny dimetyloformamid | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| N-hydroksysukcynimid | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| N,N'-diizopropylokarbodimid | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| Karty MTS | Karty Micro Typing System (MTS) (FL, USA) | ||
| Dekstran 500 kDa | Pharmacia Fine Chemicals | (Szwecja) | |
| PEG 8 kDa | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| FITC monoklonalny anty-Rh D (RhD) | Biodiagnostyka | (PA, USA) | |
| monoklonalny anty-CD47 | BD Biosciences | (NJ, USA) | |
| Drabkin's odczynnik | Sigma Aldrich | (ON, Kanada) | |
| Table. Chemikalia i odczynniki stosowane do szczepienia polimerów HPG na membranę RBC i ich analiza. |
Bibliografia
- Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter. Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).
- Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
