Antygeny chroniły funkcjonalne czerwone krwinki przez szczepienie błonowe zwartych, hiperrozgałęzionych poligliceroli

Rafi Chapanian; Iren Constantinescu; Donald E. Brooks; Mark D. Scott; Jayachandran Kizhakkedathu

doi:10.3791/50075

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Antygeny chroniły funkcjonalne czerwone krwinki przez szczepienie błonowe zwartych, hiperrozgałęzionych poligliceroli

17.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50075

⸱

2 stycznia 2013

Rafi Chapanian¹^,² , Iren Constantinescu¹^,³ , Donald E. Brooks¹^,²^,⁴ , Mark D. Scott¹^,²^,³ , Jayachandran Kizhakkedathu¹^,²^,⁴

¹Centre for Blood Research, University of British Columbia , ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia , ³Canadian Blood Services, University of British Columbia , ⁴Department of Chemistry, Life Sciences Centre, University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono modyfikację błony komórkowej czerwonych krwinek (RBC) za pomocą hiperrozgałęzionego poliglicerolu (HPG). Zmodyfikowane erytrocyty charakteryzowały się wodnym dwufazowym podziałem, kruchością osmotyczną i lizą za pośrednictwem dopełniacza. Kamuflaż białek powierzchniowych i antygenów oceniano za pomocą kart do fenotypowania krwi za pomocą cytometrii przepływowej i systemu mikrotypowania (MTS).

Streszczenie

Transfuzja czerwonych krwinek (RBC) jest niezbędna w leczeniu wielu ostrych i przewlekłych problemów medycznych, takich jak talasemia większa i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa ^1-3. Ze względu na obecność wielu antygenów na powierzchni erytrocytów (~308 znanych antygenów ⁴), pacjenci w przewlekłej terapii transfuzji krwi wytwarzają alloprzeciwciała z powodu braku dopasowania mniejszych antygenów na przetoczonych krwinkach czerwonych ^{4, 5}. Szczepienie hydrofilowych polimerów, takich jak glikol polietylenowy (PEG) i hiperrozgałęziony poliglicerol (HPG), tworzy warstwę wykluczającą na błonie RBC, która zapobiega interakcji przeciwciał z antygenami powierzchniowymi bez wpływu na przechodzenie małych cząsteczek, takich jak tlen, glukoza i jony³. Obecnie nie jest dostępna żadna metoda wytwarzania uniwersalnych czerwonych komórek dawcy krwi, częściowo ze względu na zniechęcające wyzwanie, jakim jest obecność dużej liczby antygenów (opartych na białkach i węglowodanach) na powierzchni krwinek czerwonych, a opracowanie takich metod znacznie poprawi bezpieczeństwo transfuzji oraz radykalnie poprawi dostępność i wykorzystanie krwinek czerwonych. W niniejszym raporcie przedstawiono eksperymenty, które są wykorzystywane do opracowania funkcjonalnych erytrocytów chronionych antygenem poprzez szczepienie błony HPG i ich charakterystykę. HPG są wysoce biokompatybilnymi zwartymi polimerami ^{6, 7} i oczekuje się, że będą zlokalizowane w glikokaliksie komórkowym otaczającym błonę lipidową ^{8, 9} i maskują antygeny powierzchniowe RBC^{10, 11}.

Protokół

A. Modyfikacja hiperrozgałęzionego poliglicerolu (SS-HPG)

Umieścić liofilizowany HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) w kolbie okrągłodennej i wysuszyć przez noc w próżni w temperaturze 90 °C.
Wstaw kolbę do lodówki do temperatury pokojowej i rozpuść wysuszony HPG w bezwodnej pirydynie (3 ml).
Aby funkcjonalizować około ośmiu grup hydroksylowych na HPG z grupami karboksylowymi, dodaj katalityczną ilość dimetyloaminopirydyny (jedna kropla 5 mg/ml roztworu w pirydynie) do roztworu HPG. Do tej mieszaniny dodać bezwodnik bursztynowy (0,0067 g, 0,0664 mmol) rozpuszczony w 0,5 ml pirydyny kroplami przez 10 minut. Mieszaj mieszaninę przez noc w temperaturze pokojowej pod argonem.
Wytrącić mieszaninę w 40 ml zimnego acetonu (4 °C) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować za pomocą wirówki Beckman J2-MC przy 27 000 x g przez 15 minut. Zdekantować supernatant i usunąć pozostałości acetonu przez przepłukanie argonem w temperaturze pokojowej.
Aby aktywować grupy karboksylowe grupami bursztynianu sukcynimidylu (SS), należy rozpuścić funkcjonalizowany karboksylem HPG w 3 ml bezwodnego DMF. Dodać N-hydroksysukcynimid (0,0077 g, 0,0664 mmol) i N'-diizopropylokarbodimid (0,0084 g, 0,0664 mmol) do roztworu HPG i mieszać mieszaninę przez noc w temperaturze pokojowej pod argonem.
Oczyść SS-HPG przez wytrącanie w zimnym acetonie.
Usuń resztki acetonu przez przepłukanie argonem.
Określić czystość zmodyfikowanego HPG oraz stopień funkcjonalizacji karboksylu i SS za pomocą analizy protonowej (¹H)-NMR.

B. Pobieranie krwi pełnej i separacja czerwonych krwinek (RBC)

Pobrać krew pełną (40% hematokrytu, 3 ml) od zdrowych dawców, którzy wyrazili na to zgodę, do probówki próżniowej z cytrynianem.
Odwirować probówkę z cytrynianem o stężeniu 1 000 x g przez 4 minuty.
Za pomocą pipety Pasteura usunąć supernatant zawierający osocze i płytki krwi oraz pośredni kożuszek zawierający białe krwinki i płytki krwi.
Przenieść zapakowane erytrocyty (80% hematokrytu, 1,2 ml) do probówki wirówkowej Falcon o pojemności 12 ml i dodać bufor PBS (8 ml, pH = 8,0) w celu przepłukania krwinek czerwonych.
Wymieszaj erytrocyty przez inwersję, aby uzyskać równomierny rozkład komórek.
Odwirować probówkę Falcona o sile 1 000 x g przez 4 minuty i usunąć supernatant.
Umyj erytrocyty PBS jeszcze dwa razy, powtarzając kroki 5 i 6.
Umieścić wypełnione erytrocyty (100 μl) w 1,6 ml probówki Eppendorfa i dodać bufor PBS (300 μl, pH = 8,0) w celu uzyskania 20 % hematokrytu krwinek czerwonych.

C. Szczepienie HPG do RBC

Natychmiast po wytrąceniu zmodyfikowanego HPG w acetonie w kroku A6 umieścić SS-HPG (150 mg) w szklanej fiolce (1 dram) i rozpuścić w buforze PBS (300 μl, pH = 8,0).
Dodaj roztwór polimeru SS-HPG do 20% krwinek czerwonych przemytych hematokrytem, aby uzyskać końcową objętość 400 μl i stężenie SS-HPG w zakresie od 0,5 mM do 3 mM. Na przykład, aby przygotować erytrocyty potraktowane 0,5 mM SS-HPG, należy usunąć 36 μl PBS z przemytych RBC i umieścić 36 μl roztworu polimeru SS-HPG.
Delikatnie przemieszać zawiesinę i umieścić probówki Eppendorfa na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
Odwirować probówki Eppendorfa o stężeniu 1 000 x g przez 4 minuty i odpipetować supernatant.
Dodać 1 ml PBS do przepłukania erytrocytów, odwirować i usunąć supernatant.
Dodaj 1 ml soli fizjologicznej i umyj krwinki czerwone dwa razy, jak w kroku 5.
Dodać 300 μl soli fizjologicznej do 100 μl upakowanych krwinek czerwonych (80% hematokrytu) do końcowego stężenia 20% hematokrytu.

D. Charakterystyka krwinek czerwonych modyfikowanych HPG

I. Liza za pośrednictwem dopełniacza

Zebrać około 8 ml krwi pełnej od zdrowych dawców ludzkich do szklanej probówki z surowicą próżniową BD i pozostawić krew do krzepnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Odwirować probówkę o masie 2 000 x g przez 10 minut i zebrać około 3 ml surowicy.
Jeden mililitr surowicy umieszczono w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C na 30 minut w celu przygotowania inaktywowanej termicznie surowicy.
Dodaj 60 μl świeżej surowicy lub surowicy inaktywowanej termicznie do probówki Eppendorfa, która zawiera 60 μl 20% krwinek czerwonych modyfikowanych HPG lub niemodyfikowanych krwinek czerwonych.
Inkubować erytrocyty przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
Aby określić ilościowo ilość hemoglobiny w zawiesinie komórek, umieść 5,9 μl 20% hematokrytu krwinek czerwonych zmodyfikowanych HPG lub niezmodyfikowanych komórek w trzech egzemplarzach na płytce 96-dołkowej. Dodać 294 μl odczynnika Drabkina (odczynnika, który służy do ilościowego oznaczania ilości hemoglobiny spektrofotomerycznie). Wymieszać komórki z odczynnikiem Drabkina, pipetując i pipetując. Zmierz absorbancję cyjanodywatu hemoglobiny przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika płytek SPECTRA MAX 190.
Aby określić ilościowo ilość hemoglobiny w supernatancie, odwiruj komórki przy 13 000 x g przez 1 minutę. Umieść 50 μl supernatantu w trzech kroplach na 96-dołkowej płytce. Dodać 250 μl odczynnika Drabkina. Wymieszać komórki z odczynnikiem Drabkina, pipetując i pipetując. Zmierz absorbancję cyjanodywatu hemoglobiny przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika płytek SPECTRA MAX 190.
Określić ilościowo ilość zlizowanych komórek na podstawie stosunku hemoglobiny w supernatancie (etap 7) do całkowitej hemoglobiny w próbce (krok 6) ^{8, 11, 12}.

II. Kamuflaż głównych i drugorzędnych antygenów za pomocą kart MTS

Umieścić 50 μl zmodyfikowanych HPG krwinek czerwonych (10 % hematokrytu) w probówce Eppendorfa, odwirować przy 1 000 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
Dodać 110 μl rozcieńczalnika MTS do osadu komórkowego i homogenizować zawiesinę komórkową przez pipetowanie i odpipetowanie.
Dodać 11 μl zawiesiny komórkowej do każdej mini kolumny żelowej. Unikaj dotykania żelu podczas dodawania.
Umieść karty MTS w uchwycie na karty wirówki i wiruj przy 156 x g przez 6 minut.
Ochronę antygenów powierzchniowych określa się na podstawie lokalizacji erytrocytów w mini kolumnie żelowej, na podstawie opisu producenta.

III. Pomiary wodnego podziału dwufazowego

Przygotować dwufazowy system separacji Dekstran 500 kDa/PEG 8 kDa składający się z (5% dekstranu 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM fosforanu) zgodnie z ¹³.
Wirować przy 433 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania układu dwufazowego (dekstran na dnie).
Ostrożnie oddziel te dwie fazy.
Porcję 1,0 ml górnej fazy PEG do oznakowanej probówki (z wklęsłym dnem), dodać 20 μl 20% krwinek czerwonych modyfikowanych HPG hematokrytem i delikatnie wymieszać komórki, trzepiąc.
Dodać 0,5 ml górnej fazy zawierającej komórki do 0,5 ml dolnej fazy i delikatnie wymieszać system, trzepiąc.
Umieść rurkę na stole na ~ 2 minuty, aby system się oddzielił, i określ położenie komórek w systemie. Lokalizacja erytrocytów (w górnej fazie PEG, w dolnej fazie dekstranu lub w obu) zależy od stopnia modyfikacji i masy cząsteczkowej HPG.

IV. Pomiary kruchości osmotycznej

Przygotować roztwory NaCl o stężeniach w zakresie od 0 do 0,9 (w/v) %.
Umieścić 0,4 ml roztworów NaCl w 1,5 ml probówkach Eppendorfa.
Dodaj 20 μl erytrocytów (20% hematokrytu) do roztworów NaCl.
Dokładnie wymieszać komórki przez odwrócenie i umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut.
Ostrożnie zawieś komórki przez odwrócenie. Pobrać 50 μl zawiesiny RBC i dodać ją do 1 ml odczynnika Drabkina, umieszczonego w kuwecie. Wymieszać komórki z odczynnikiem Drabkina, pipetując i pipetując. Zmierzyć absorbancję cyjanoderywatu hemoglobiny przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika UV/VIS BECKMAN COULTER DU 730.
Aby określić ilościowo ilość hemoglobiny w supernatancie, odwirować komórki przy 1000 x g przez 1 minutę. Dodać 200 μl supernatantu do 1 ml odczynnika Drabkina w kuwecie. Wymieszać komórki z odczynnikiem Drabkina, pipetując i pipetując. Zmierzyć absorbancję cyjanoderywatu hemoglobiny przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika UV/VIS BECKMAN COULTER DU 730.
Obliczyć ilość komórek poddanych lizie w różnych roztworach NaCl ze stosunku ilości hemoglobiny w supernatancie (krok 6) do całkowitej ilości hemoglobiny w zawiesinie komórki (krok 5).

V. Pomiary cytometrii przepływowej - Ochrona antygenu Rhesus-D (RhD)

Dodać 5 μl kontrolnych lub zmodyfikowanych HPG erytrocytów (20% hematokrytu) w trzech powtórzeniach do buforu PBS uzupełnionego 0,5% BSA, do całkowitej objętości 25 μl.
Dodać 25 μl monoklonalnego anty-Rh D (RhD) FITC zakupionego w Quotient Biodiagnostics (PA, USA).
Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
Przemyć mieszaninę dwukrotnie 1,5 ml buforu PBS. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w celu usunięcia supernatantu.
Zawiesić erytrocyty w 1 ml soli fizjologicznej i przenieść zawiesinę do probówki do cytometrii przepływowej BD o przepływie 4 ml.
Analizuj za pomocą cytometru przepływowego FACSCanto II, uzyskując 5,000 zdarzeń na bramce sterującej RBC i wykorzystuj całe zdarzenia do analizy.

VI. Pomiary cytometrii przepływowej - Ekspresja CD47

Dodać 1,54 μl kontrolnych lub zmodyfikowanych HPG krwinek czerwonych (20 % hematokrytu) w trzech powtórzeniach do buforu PBS uzupełnionego 0,5% BSA, do całkowitej objętości 44 μl.
Dodać 6 μl mysiej anty-ludzkiej CD47 znakowanej fikoerytryną (PE) zakupionej w BD Biosciences (NJ, USA).
Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
Przemyć mieszaninę 1,5 ml buforu PBS dwa razy. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w celu usunięcia supernatantu.
Zawiesić erytrocyty w 1 ml soli fizjologicznej i przepuścić przez igłę 26 G 5/8, aby zminimalizować zbrylanie się komórek.
Przenieść zawiesinę do probówki do cytometrii przepływowej BD o pojemności 4 ml.
Analizuj za pomocą cytometru przepływowego FACSCanto II, uzyskując 10 000 zdarzeń na bramce sterującej RBC.