Kontrolowane środowiskowo badania mikrorozciągalności mechanicznie adaptacyjnych nanokompozytów polimerowych do charakterystyki ex vivo

Summary

Omówiono metodę, za pomocą której mechaniczne zachowanie in vivo materiałów reagujących na bodźce jest monitorowane w funkcji czasu. Próbki są badane ex vivo przy użyciu testera mikrorozciągania z kontrolą środowiska w celu symulacji środowiska fizjologicznego. Praca ta dodatkowo przyczynia się do zrozumienia zachowania naszego materiału in vivo.

Abstract

Wszczepialne mikrourządzenia zyskują na znaczeniu w wielu zastosowaniach biomedycznych^1-4. Takie urządzenia zostały wykonane z różnych materiałów, z których każdy ma swoje zalety i wady^5,6. Przede wszystkim, ze względu na wymiary urządzenia w mikroskali, wymagany jest wysoki moduł, aby ułatwić implantację w żywej tkance. I odwrotnie, sztywność urządzenia powinna pasować do otaczającej tkanki, aby zminimalizować indukowane naprężenie miejscowe^7-9. Dlatego niedawno opracowaliśmy nową klasę materiałów inspirowanych biologią, aby spełnić te wymagania, reagując na bodźce środowiskowe zmianą właściwości mechanicznych^10-14. W szczególności nasz nanokompozyt na bazie poli(octanu winylu) (PVAc-NC) wykazuje zmniejszenie sztywności pod wpływem wody i podwyższonych temperatur (np. temperatury ciała). Niestety, istnieje niewiele metod ilościowego określania sztywności materiałów in vivo¹⁵, a badania mechaniczne poza środowiskiem fizjologicznym często wymagają dużych próbek nieodpowiednich do implantacji. Co więcej, materiały reagujące na bodźce mogą szybko odzyskać swoją początkową sztywność po eksplantacji. W związku z tym opracowaliśmy metodę, za pomocą której właściwości mechaniczne wszczepionych mikropróbek mogą być mierzone ex vivo, z symulowanymi warunkami fizjologicznymi utrzymywanymi za pomocą kontroli wilgotności i temperatury^13,16,17.

W tym celu zaprojektowano niestandardowy tester mikrorozciągania, który obsługuje próbki^{mikroskalowe 13,17} z bardzo zmiennymi modułami Younga (zakres od 10 MPa do 5 GPa). Ponieważ nasze zainteresowania koncentrują się na zastosowaniu PVAc-NC jako biologicznie adaptującego się podłoża sondy neuronowej, konieczne było narzędzie zdolne do mechanicznej charakterystyki próbek w mikroskali. Narzędzie to zostało przystosowane do zapewnienia kontroli wilgotności i temperatury, co zminimalizowało suszenie i chłodzenie próbki¹⁷. W rezultacie, właściwości mechaniczne eksplantowanej próbki ściśle odzwierciedlają charakterystykę próbki znajdującej się tuż przed eksplantacją.

Ogólnym celem tej metody jest ilościowa ocena właściwości mechanicznych in vivo, a konkretnie modułu Younga, materiałów na bazie polimerów reagujących na bodźce, mechanicznie adaptacyjnych. Osiąga się to poprzez uprzednie ustalenie warunków środowiskowych, które zminimalizują zmianę właściwości mechanicznych próbki po eksplantacji, nie przyczyniając się do zmniejszenia sztywności niezależnej od tej wynikającej z implantacji. Próbki są następnie przygotowywane do implantacji, przenoszenia i testowania (ryc. 1A). Każda próbka jest wszczepiana do kory mózgowej szczurów, która jest tutaj reprezentowana jako eksplantowany mózg szczura, na określony czas (ryc. 1B). W tym momencie próbka jest eksplantowana i natychmiast ładowana do testera mikrorozciągania, a następnie poddawana próbie rozciągania (rysunek 1C). Późniejsza analiza danych dostarcza informacji na temat mechanicznego zachowania tych innowacyjnych materiałów w środowisku kory mózgowej.

Protocol

1. Przygotowanie próbki

1. Przygotować folię PVAc-NC o grubości w zakresie 25-100 μm techniką odlewania roztworu i prasowania^10-12.
2. Przyklej folię do płytki krzemowej, ogrzewając ją na płycie grzejnej przez dwie minuty w temperaturze 70 °C (powyżej temperatury zeszklenia), aby zapewnić bliski kontakt między folią a płytką. Ten krok zapewnia, że przygotowana folia pozostaje płaska i przymocowana do płytki Si, co jest niezbędne w planarnych procesach mikroobróbki.
3. Ułóż wzór folii zgodnie z geometrią próbki testowej za pomocą mikroobróbki laserowej (VLS 3.50, VersaLASER). Ustaw parametry mikroobróbki laserowej CO₂ z bezpośrednim zapisem na 1,0% mocy (0,5 W), 4,0% prędkości (56 mm/s) i 1,000 impulsów na cal^13,16.
4. Próbki wzorów, które zostaną wykorzystane do ustalenia warunków środowiskowych ("próbki ustawione") w struktury w kształcie osi o wymiarach bocznych podkładki 1,5 x 1,5 mm² i wymiarach belki bocznej 300 x 3 000 μm², o grubości odpowiadającej grubości folii na całej długości (rysunek 2).
5. Próbki do eksperymentów ex vivo ("próbka implantu") należy uformować w wiązki o wymiarach 300 μm x 6 mm, o grubości odpowiadającej grubości folii.
6. Ostrożnie uwolnij próbki z wafla za pomocą żyletki i pęsety.
7. Do obsługi próbek należy przygotować specjalnie obrobione uchwyty akrylowe, które mają służyć jako część systemu uchwytu w testerze mikrorozciągania. Laserowo wytrawione oznaczenia pokazują linię środkową uchwytu i 1,5 mm od końca. Umieść niewielką ilość kleju na bazie żelu cyjanoakrylowego na linii środkowej akrylowego uchwytu i ostrożnie przyklej próbkę implantu o długości 1,5 mm do uchwytu i załóż na oznaczoną linię środkową (rysunek 3). Każda próbka implantu wymaga jednego akrylowego uchwytu. Należy uważać, aby żel klejący pozostał tylko wzdłuż 1.5 mm długości PVAc-NC przyklejonej do akrylowego uchwytu. W przeciwnym razie żel adhezyjny może zakłócać mechaniczne zachowanie próbki.
8. Usunąć wilgoć ze wszystkich próbek, umieszczając je w eksykatorze na co najmniej 24 godziny.
9. Zmierz długość, szerokość i grubość próbek za pomocą mikroskopu optycznego.

2. Ustal warunki środowiskowe

1. Załaduj próbkę do próbki mikrorozciągania na sucho (patrz rysunek 4), najpierw zaciskając między ruchomymi uchwytami, a następnie między stałymi uchwytami.
2. Zamontuj szczotkę powietrzną ze zbiornikiem wypełnionym wodą w ustalonej pozycji, z dyszą skierowaną w stronę próbki o działaniu mikrorozciągania. Podłącz szczotkę powietrzną do sprężarki powietrza za pomocą plastikowej rurki. Przy całkowicie zamkniętej dyszy szczotki powietrznej włącz sprężarkę powietrza.
3. Rozpocząć cykliczną procedurę próby mikrorozciągania, naprzemiennie między odkształceniem rozciągającym (odkształcenie dodatnie) i odkształceniem ściskającym (odkształcenie ujemne) przyłożonym do próbki, pozostając w liniowym obszarze sprężystym wykresu naprężenie-odkształcenie. W przypadku PVAc-NC zastosowane odkształcenie jest ograniczone do mniej niż 2%. W niestandardowym testerze mikrorozciągania używanym w tych eksperymentach prędkość odkształcania była kontrolowana, podczas gdy mierzono siłę wymaganą do osiągnięcia tego odkształcenia. Alternatywnie, inna konfiguracja może obejmować kontrolowanie przyłożonej siły podczas pomiaru wynikowego odkształcenia.
4. Stopniowo zwiększaj przepływ z dyszy szczotki powietrznej i monitoruj nachylenie wykresu naprężenie-odkształcenie w funkcji wielkości przepływu ze szczotki powietrznej. Maksymalny przepływ, który nie powoduje znaczącego (>10%) zmniejszenia modułu Younga w okresie 60 sekund, to poziom, który zostanie wykorzystany w eksperymentach ex vivo. W tym momencie ustalono warunki wilgotnościowe, które nie zmoczyą suchej próbki (a tym samym przyczynią się do zmniejszenia modułu Younga), a także zminimalizują wysychanie próbki po wystawieniu na działanie płynów biologicznych in vivo.
5. Zmierzyć temperaturę w pobliżu próbki. Idealna konfiguracja obejmowałaby termoparę z odczytem cyfrowym i byłaby wykonywana podczas pracy aerografu. Ustawić intensywność i odległość promieniowania cieplnego w taki sposób, aby temperatura próbki była utrzymywana na poziomie 37 °C, aby dopasować je do warunków fizjologicznych.

3. Porównaj kontrolę środowiskową z kontrolą niezwiązaną z ochroną środowiska

1. Zanurzyć próbki zestawu na co najmniej 30 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Po tym czasie próbka jest całkowicie nasycona i została zredukowana do minimalnego modułu Younga w danej temperaturze.
2. Szybko załaduj próbkę do testera mikrorozciągania i rozpocznij cykliczne próby mikrorozciągania przy wyłączonej szczotki powietrznej, podczas gdy próbka wysycha. Pozwoli to określić, jak szybko próbka wysycha w niekontrolowanych warunkach.
3. Załaduj drugą próbkę konfiguracyjną nasyconą PBS do testera mikrorozciągania i rozpocznij cykliczne próby mikrorozciągania z włączoną szczotką powietrzną. Pozwoli to określić, jak szybko próbka wysycha w kontrolowanych warunkach środowiskowych.

4. Implantacja i eksplantacja sondy

1. Przymocuj próbkę implantu do zacisku mikromanipulatora i ustaw prostopadle do tkanki korowej.
2. Przed włożeniem należy utrzymać tkankę wystarczająco wilgotną solą fizjologiczną, aby zapewnić jednorodność mechaniki tkanki.
3. Opuść próbkę polimeru do kory mózgowej za pomocą pilotów mikromanipulatora. Pozostawić próbkę w tkance korowej do docelowego czasu implantacji, zwykle od 1 do 30 minut. Aby zapobiec wysychaniu chusteczki przez czas dłuższy niż 5 minut, delikatnie przetrzyj chusteczkę co 5 minut za pomocą wacika nasączonego solą fizjologiczną.
4. Podczas gdy sonda jest wszczepiona w korę mózgową, przygotuj tester mikrorozciągania do załadowania aktualnie wszczepionej próbki, ustawiając pręt napędowy w pozycji zerowego przemieszczenia wynoszącej 3.0 mm od nieruchomego zacisku próbki. Ustaw również dyszę szczotki powietrznej na ustawienie przepływu, a źródło promieniowania cieplnego na odpowiednią intensywność określoną w kroku 2.4.
5. Pod koniec określonego czasu implantacji podnieś sondę z kory mózgowej za pomocą pilotów mikromanipulatora. Natychmiast i ostrożnie wyjmij próbkę z zacisku mikromanipulatora i załaduj ją do testera mikrorozciągania, jak opisano bardziej szczegółowo w kroku 5.2.

5. Badanie mikrorozciągalności próbek implantów

1. Aby zaoszczędzić czas po eksplantacji, upewnij się, że tester mikrorozciągania jest całkowicie gotowy do przyjęcia próbki implantu przed implantacją, jak opisano w kroku 4.4.
2. Natychmiast po eksplantacji załadować próbkę między dwa zestawy zacisków testera mikrorozciągania. Ponieważ próbka jest zamontowana na akrylowym uchwycie zaprojektowanym tak, aby służyła jako górna połowa jednego zacisku, umieść zespół próbki implantu na ruchomym uchwycie, próbką stroną do dołu. Ważne jest, aby upewnić się, że próbka jest zamontowana w taki sposób, aby naprężenie było przykładane tylko wzdłuż długości sondy, aby uniknąć przykładania momentu obrotowego do próbki podczas badania. W związku z tym próbka musi być zamontowana na środku każdego zacisku, a zaciski muszą być wypoziomowane względem siebie.
3. Wyreguluj pozycję próbki tak, aby odległość między zaciskami wynosiła 3,0 mm, a koniec sondy był umieszczony w stałym zacisku. Ta długość 3,0 mm między zaciskami jest długością miernika dla próbki i zostanie wykorzystana w późniejszych obliczeniach w celu określenia odkształcenia próbki.
4. Natychmiast po zamocowaniu próbki między oboma zaciskami i w ciągu 2 minut od eksplantacji z tkanki nerwowej, należy uruchomić silnik w kierunku rozciągania, aby wydłużyć próbkę ze stałą szybkością (tutaj stosuje się 10 μm/s), jednocześnie mierząc i rejestrując wydłużenie próbki (za pomocą wskaźnika przemieszczenia, Mitutoyu 543-561) i związaną z tym siłę (za pomocą ogniwa obciążnikowego, Transducer Techniques MDB-2.5) wymagane do odkształcenia próbki.
5. Wstrzymaj próbę mikrorozciągania w przypadku mechanicznego uszkodzenia próbki lub po osiągnięciu końca zakresu pręta napędowego. Eksportuj zebrane dane i przeprowadzaj ich analizę.
6. Powtórzyć próbę mikrorozciągania dla każdej próbki i/lub każdego zestawu warunków (tj. czasu wprowadzania).

6. Analiza danych

1. Przekształć surowe dane dotyczące wydłużenia na odkształcenie inżynieryjne zastosowane do próbki implantu, dzieląc odległość wydłużenia przez początkową długość miernika, jak opisano w równaniu 1, gdzie ε jest przyłożonym odkształceniem, t to czas, d to przemieszczenie mierzone za pomocą wskaźnika mikrometrycznego, a L₀ to początkowa długość miernika próbki:
   (1)
2. Przekształć dane siły surowej na naprężenie inżynierskie na próbce, dzieląc siłę (w niutonach) przez pole przekroju poprzecznego, jak opisano w równaniu 2:
   (2)
   gdzie σ jest naprężeniem działającym na próbkę, F jest siłą mierzoną przez ogniwo obciążnikowe (w niutonach), w₀ jest początkową szerokością próbki, a t₀ jest początkową grubością próbki.
3. Wykreślić krzywą naprężenia (σ[t]) w funkcji odkształcenia (ε[t]) dla każdej próbki za pomocą programu komputerowego, takiego jak Microsoft Excel.
4. Wyizoluj liniową sprężystą część wykresu i użyj narzędzi do dopasowywania krzywych opartych na oprogramowaniu, aby znaleźć najlepszą linię dopasowania do tej części. Nachylenie linii najlepszego dopasowania odpowiada modułowi Younga próbki. Izolowana część powierzchni powinna zawierać co najmniej 10 punktów naprężenie-odkształcenie i powinna być pobrana z części powierzchni, w której nachylenie jest największe.
5. W przypadku badań cyklicznych moduł Younga będzie musiał być określony dla każdego cyklu. Może to być zautomatyzowane lub wykonane ręcznie.
6. W przypadku testów cyklicznych wykreśl moduł Younga każdego cyklu w funkcji czasu. Wskazuje to, jak mierzony moduł zmienia się w czasie, co wskazuje na to, jak szybko próbka zestawu zwilża się lub schnie.
7. W przypadku próbek implantów każda próbka i czas implantu odpowiadają pojedynczemu cyklowi badań cyklicznych. Zmierz moduł Younga, stosując procedurę opisaną powyżej dla każdej próbki implantu.
8. Wykreśl moduł Younga w funkcji czasu implantu. W tym miejscu można dokonać porównań do badań laboratoryjnych itp.

Results

Właściwości mechaniczne prawie wszystkich materiałów polimerowych, w tym naszego PVAc-NC, zależą od ekspozycji na warunki środowiskowe. Należą do nich przede wszystkim narażenie na ciepło i wilgoć. Kiedy materiał jest uplastyczniony w wyniku wchłaniania wilgoci lub ulega przemianie termicznej, wykazuje zmniejszenie modułu Younga. Przygotowując środowisko o kontrolowanej wilgotności i temperaturze do charakterystyki mechanicznej próbki ex vivo, ważne jest, aby upewnić się, że zawartość wilgoci w próbce jest mini...

Discussion

Postęp w dziedzinie wszczepialnych biomedycznych systemów mikroelektromechanicznych (bioMEMS) do interakcji z systemami biologicznymi motywuje do opracowywania nowych materiałów o wysoce dostosowanych właściwościach. Niektóre z tych materiałów są zaprojektowane tak, aby wykazywać zmianę właściwości materiału w odpowiedzi na bodziec znaleziony w środowisku fizjologicznym. Jedna z niedawno opracowanych klas materiałów reaguje na obecność cieczy tworzących wiązania wodorowe (np. wody) i podwyższonych temperatur w c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wafel krzemowy	Wafel		Klasa mechaniczna
Wytłaczany arkusz	akrylowy Profesjonalne tworzywa sztuczne	SACR 062EF	Grubość 0,062 "
Żyletka	McMaster-Carr	3962A3
Pęseta	McMaster-Carr	8384A47	#5 końcówka
Super Glue Gel	Loctite	130380
Air Szczotka	Zatrzaskowa Przemysłowa	BF175TA
Sprężarka powietrza	Paasche	B002YKN8YO	D500
Termopara	Omega	HH12A
Płyta grzejna	Cimarec	SP131325Q
Laser CO2 do bezpośredniego zapisu	VersaLaser	3.5
Eksykator	Fisher Scientific	08-595
Lampa			zbudowany na zamówienie
		mikrorozciągania	zbudowany na zamówienie