Eksperymentalne metody testowania wpływu peptydu neurotroficznego, ADNF-9, przeciwko apoptozie wywołanej alkoholem podczas ciąży u myszy C57BL/6

Podsumowanie

Proponowane tutaj projekty eksperymentalne koncentrują się na badaniu wpływu ekspozycji na alkohol w apoptozie i zastosowaniu peptydu neurotroficznego podczas ciąży w mózgu płodu. Opisano szczegółowy opis od hodowli do zbioru mózgów płodów. Szczegółowo opisano również techniki oznaczania apoptozy.

Streszczenie

Eksperymentalne projekty badania skutków prenatalnej ekspozycji na alkohol we wczesnych stadiach embrionalnych rozwoju mózgu płodu są wyzwaniem. Wynika to głównie z trudności w mikrodysekcji mózgów płodu i ich sekcji w celu określenia komórek apoptotycznych spowodowanych prenatalną ekspozycją na alkohol. Opisane tutaj eksperymenty dostarczają wizualizowanych technik od hodowli myszy do identyfikacji śmierci komórkowej w tkance mózgowej płodu. W badaniu tym wykorzystano myszy C57BL/6 jako model zwierzęcy do badania ekspozycji płodu na alkohol i roli peptydu troficznego w apoptozie wywołanej alkoholem. Hodowla składa się z 2-godzinnego okna matowania w celu określenia dokładnego etapu wieku embrionalnego. W tym badaniu wykorzystano ustalony model ekspozycji płodu na alkohol w celu określenia skutków prenatalnej ekspozycji na alkohol w mózgach płodów. Wiąże się to ze swobodnym dostępem do alkoholu lub diety płynnej karmionej parami jako jedynego źródła składników odżywczych dla ciężarnych myszy.

Techniki polegające na preparowaniu płodów i mikrodysekcji mózgów płodów są dokładnie opisane, ponieważ te ostatnie mogą być trudne. Mikrodysekcja wymaga mikroskopu stereoskopowego i ultracienkich kleszczyków. Procedury krok po kroku dotyczące preparowania mózgu płodu są przedstawione wizualnie. Mózg płodu jest preparowany od podstawy opuszki węchowej zawiązka do podstawy śródmózgowia.

W celu zbadania apoptozy, mózgi płodów są najpierw zanurzane w żelatynie za pomocą odklejanej formy, aby ułatwić ich sekcję za pomocą aparatu wibratomowego. Mózgi płodów osadzone i umocowane w paraformaldehydzie można łatwo podzielić, a swobodnie unoszące się sekcje można zamontować w szkiełkach superfrost plus w celu określenia apoptozy lub śmierci komórki.

TUNEL (etykietowanie końca dUTP za pośrednictwem TdT; TdT: końcowa deoxynukleotydylotransferaza) zastosowano w celu identyfikacji śmierci komórki lub komórek apoptotycznych. Warto zauważyć, że apoptoza i cytotoksyczność za pośrednictwem komórek charakteryzują się fragmentacją DNA. Tak więc wizualizowane komórki TUNEL-dodatnie wskazują na śmierć komórki lub komórki apoptotyczne.

Projekty eksperymentalne tutaj dostarczają informacji na temat stosowania ustalonej diety płynnej do badania skutków alkoholu i roli peptydów neurotroficznych podczas ciąży w mózgach płodów. Obejmuje to hodowlę i karmienie ciężarnych myszy, mikropreparację mózgów płodów i określanie apoptozy. Razem, te wizualne i tekstowe techniki mogą być źródłem do badania prenatalnej ekspozycji na szkodliwe czynniki w mózgach płodów.

Wprowadzenie

Celem opisanych tutaj metod eksperymentalnych jest ocena neuroprotekcyjnych efektów peptydów troficznych w modelu ekspozycji na alkohol płodowy przy użyciu kilku technik obejmujących hodowlę, karmienie, mikropreparację i wykrywanie śmierci komórek. Badania przeprowadzone w naszym laboratorium obejmowały dietę płynną zmieszaną z alkoholem jako model umiarkowanego picia alkoholu, który może być podobny do paradygmatu picia przez człowieka pod względem ilości spożywanego alkoholu ^1-5. My i inni zidentyfikowaliśmy trzy pochodne peptydów, które działają neuroprotekcyjnie przeciwko szkodliwym skutkom ekspozycji płodu na alkohol. Badania nad narażeniem na alkohol w fazie embrionalnej z wykorzystaniem modeli zwierzęcych mogą doprowadzić do identyfikacji potencjalnych mechanizmów neuroprotekcji i pozwolić na opracowanie procedur interwencyjnych. Może to dostarczyć wielu informacji na temat działania neuroprotekcyjnego i łagodzenia szkodliwych skutków ekspozycji na alkohol w czasie ciąży.

Możliwe zapobieganie skutkom prenatalnej ekspozycji na alkohol może polegać na leczeniu ciężarnych myszy peptydami, które, jak wykazano, są zaangażowane w neuroprotekcję in vitro ^6,7 i in vivo ^1,2,4,8,9. Wśród tych peptydów SALLRSIPA, znany jako ADNF-9 lub SAL, pochodzi od zależnego od aktywności czynnika neurotroficznego (ADNF) ^7,10. Inny peptyd z sekwencją peptydu NAPVSIPQ, określany jako NAP, pochodzący z białka neuroprotekcyjnego zależnego od aktywności (ADNP) ^6,11, wykazał silne działanie ochronne przed stresem oksydacyjnym związanym z ekspozycją na alkohol ^12,13. Ponadto niedawno zidentyfikowaliśmy nowy syntetyzowany peptyd, kolivelinę, który wydaje się odgrywać kluczową rolę neuroprotekcyjne w płodowym modelu ekspozycji na alkohol ². Kolivelina składa się z ADNF-9 i AGA-(C8R)HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). Znaczenie stosowania tych peptydów polega na tym, że mają one zdolność przekraczania bariery mózg-krew, aby zapobiec skutkom apoptozy wywołanej alkoholem i deficytom wzrostu mózgu.

Metody eksperymentalne wykorzystywały myszy C57BL/6 do testowania neuroprotekcyjnych efektów przeciwko apoptozie wywołanej alkoholem. Przyjęliśmy 2-godzinne okno zamiast nocnego rozmnażania, aby dokładnie oszacować dzień embrionalny 0 (E0), ponieważ można to ujawnić poprzez wykrycie czopa plemnika i wymaz z pochwy ^1-5. Zastosowaliśmy dietę płynną z rurkami do karmienia, ponieważ jest to uważane za swobodny dostęp zamiast dostarczania alkoholu drogą przez zgłębnik, co może wywoływać stres u ciężarnych myszy. Z drugiej strony, mikrodysekcja może być trudna ze względu na miękkość tkanki mózgowej płodu, którą można napotkać podczas preparowania mózgów płodu we wczesnych stadiach embrionalnych. Tutaj pokazujemy zwizualizowane techniki radzenia sobie ze wszystkimi wyzwaniami związanymi z mikrodysekcjami. Co więcej, ponieważ sekcja mózgu płodu może być również trudna, przyjęliśmy technikę, która polega na osadzaniu mózgów płodu w żelatynie za pomocą odklejanych form do zatapiania. Udało nam się przeciąć mózg płodu w swobodnie pływających odcinkach o grubości 50 μm. To pozwala nam badać wszelkie zmiany zawartości białka w sekcjach mózgu płodu, w tym identyfikację śmierci komórki.

Protokół

1. Hodowla zwierząt i leczenie peptydami troficznymi

1. Hoduj C57BL / myszy, umieszczając samice myszy (~6 tygodni, średnia waga 20 g) w klatkach domowych dla samców na 2 godziny.
2. Natychmiast po tym należy sprawdzić, czy nie ma czopa nasienia i/lub wymazu z pochwy.
3. Jeśli wynik jest pozytywny, oznacz ten punkt czasowy jako dzień embrionalny 0 (E0).
4. Na E7 ciężarne samice z dopasowaną wagą ciała do grup kontrolnych i leczonych (3 grupy) są przydzielane zgodnie z opisem ostatnio ⁴: 1) Grupa diety płynnej z alkoholem (etanolem) (ALC); 2) grupa kontrolna karmiona parami (PF); 3) Grupa leczona peptydami, która powinna otrzymać dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie peptydu ADNF-9 wraz z płynną dietą ekspozycyjną na alkohol (ALC / ADNF-9). Szczegóły dotyczące przygotowania diet ALC i PF oraz procedury wstrzykiwań i.p. można znaleźć w naszej najnowszej pracy ⁴.
5. Mierz codzienną dietę płynną z alkoholem, która może być zapewniona jako wolny dostęp jako jedyne źródło składników odżywczych. Płynna dieta PF dopasowana indywidualnie do matki ALC może być również mierzona codziennie.
6. Objętość płynnej diety spożytej w ciągu ostatnich 24 godzin można zapisać z 30-mililitrowych probówek z podziałką, a świeżo przygotowana dieta powinna być podawana codziennie od E7 do E13.

2. Preparacja płodów i mikrodysekcja mózgów płodów

1. Uśmierc ciężarne myszy na E13 poprzez głęboką eutanazję myszy za pomocą procedury CO₂, po której następuje zwichnięcie szyjki macicy.
2. Oczyść miejsce nacięcia w jamie brzusznej 70% etanolem.
3. Wykonaj nacięcie brzucha za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.
4. Gdy brzuch jest otwarty, wypreparuj macicę, przytrzymując ją jednym kleszczem i używając drugich kleszczy do oderwania mezometrium od macicy. Upewnij się, że wykonujesz tę procedurę powoli, aby uniknąć nakłucia zarodków.
5. Usuń zarodki z macicy i przenieś je do naczynia do hodowli komórkowej (60 mm x 15 mm) zawierającego zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) w lodowatej wodzie.
6. Wypreparuj mózgi płodu z całych zarodków pod mikroskopem stereoskopowym w celu przeprowadzenia mikrodysekcji.
7. Używając ultracienkich kleszczy do mikrodysekcji, ściągnij skórę zarodków w górnej części głowy, aby odsłonić czaszkę.
8. Gdy czaszka jest odsłonięta i wyraźnie uwidoczniona pod mikroskopem stereoskopowym mikrodysekcji, należy oderwać czaszkę, zaczynając od tylnej części mózgu w obszarze rdzenia kręgowego i pnia mózgu.
9. Pamiętaj, aby odkleić czaszkę kawałek po kawałku od tylnej do przedniej części głowy.
10. Gdy mózgi płodów zostaną wizualnie odsłonięte, przystąp do ich ekstrakcji.
11. Wypreparuj mózg płodu od podstawy opuszki węchowej zawiązka do podstawy śródmózgowia.
12. Postfix wszystkie wypreparowane mózgi płodów w 4% paraformaldehydzie przez 2-3 dni. Możesz również zamrozić inne mózgi płodów z każdej matki, jeśli testujesz je pod kątem Western blot lub testów enzymatycznych.

Uwaga: Procedury dotyczące wykorzystania zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Toledo, które są zgodne z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zdrowia oraz Przewodnikiem dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych.

3. Osadzanie mózgów płodów w żelatynie w celu podziału

na sekcje

1. Przygotuj 10% żelatyny klasy A.
2. Napełnij do połowy odklejaną foremkę do zatapiania i poczekaj, aż żelatyna zastygnie.
3. Umieść kontrolne i prenatalne mózgi płodowe obok siebie na zestalonej żelatynie. Ma to na celu utrzymanie spójnych warunków immunodetekcji śmierci komórki zarówno pomiędzy grupą kontrolną, jak i eksperymentalną.
4. Dodaj płynną żelatynę na wierzch mózgów płodu, aby uzyskać kompletną formę (upewnij się, że żelatyna nie jest zbyt gorąca).
5. Przygotowaną żelatynową foremkę, w której znajduje się mózg płodu, należy przechowywać w lodówce przez 15 minut.
6. Oderwij plastikową formę do zatapiania, a następnie przenieś wcześniej przygotowaną żelatynę zawierającą mózgi płodu do 4% paraformaldehydu na dwa dni.
7. Umieść i pokrój unieruchomione mózgi płodu w żelatynie za pomocą wibratomu do cięcia (Leica VT 1000S) o grubości 50 μm w celu przekroju koronalnego. Ta grubość jest testowana w naszych badaniach, ponieważ zapewnia lepsze cechy anatomiczne. Ponadto za pomocą tej techniki można również testować grubości 25 μm i wyższe, polegające na zanurzeniu mózgu płodu w 10% żelatynie. Należy zauważyć, że odcinki koronalne zostały przecięte za pomocą wibratomu na poziomie wypukłości zwojów podstawy na przodomózgowiu
8. Zebrać skrawki mózgu płodu w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
9. Zamontuj sekcje mózgu płodu w zjeżdżalniach Superfrost Plus w wodzie.
10. Suszyć zamontowane sekcje przez 15 minut.
11. Umieść szkiełka (zamontowane z sekcjami mózgu płodu) w PBS do następnego dnia testowania reakcji TUNEL.

4. Reakcja TUNEL do wykrywania śmierci komórki lub apoptozy

(TUNEL: Etykietowanie końca dUTP za pośrednictwem TdT; TdT: końcowa deoksynukleotydylotransferaza). Ten test ma na celu określenie śmierci komórki.

1. Skrawki mózgu płodu zamontowane na szkiełkach Superfrost Plus należy traktować proteinazą K (20 μg/ml) przez 5 minut w temperaturze 37 °C (300 μl proteinazy K zmieszanej w 20 ml PBS). Zjeżdżalnie montowane są w 5-Plend otwarta poczta).
2. Przepłukać skrawki mózgu płodu (zamontowane w szkiełkach) PBS trzy razy przez 5 minut pod wytrząsarką orbitalną.
3. Inkubować skrawki z 3% H₂O₂ w metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej (3 ml 30% H₂O₂ w 27 ml 100% metanolu) (szkiełka nie powinny znajdować się w shakerze).
4. Przepłukać skrawki PBS trzykrotnie przez 5 minut w wytrząsarce orbitalnej.
5. Inkubować skrawki w roztworze permeabilizacyjnym (0,1% TritonX-100 w 0,1% roztworze cytrynianu sodu) przez 2 minuty na lodzie (4 °C) (100 μl TritonX + 0,1 g cytrynianu sodu + 99,9 ml wody destylowanej).
6. Przepłukać sekcje w PBS dwa razy przez 5 minut w wytrząsarce orbitalnej.
7. Suchy obszar wokół sekcji w zjeżdżalniach.
8. Narysuj barierę na slajdach Superfrost Plus za pomocą pióra PAP. Ma to na celu zapobieżenie wyciekom roztworu, który jest używany do obróbki skrawków do wykrywania komórek TUNEL-dodatnich.
9. Inkubować skrawki z mieszaniną reakcyjną TUNEL (50 μl z butelki 1 i 450 μl z butelki 2) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, kontrolę stosuje się przez inkubację w roztworze z butelki 2.
10. Spłukać PBS trzy razy po 5 minut pod wytrząsarką Orbit
.
11. Suchy obszar wokół tkanki.
12. Inkubować sekcje z konwertorem-POD przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
13. Przepłukać skrawki trzy razy przez 5 minut za pomocą Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M).
14. Inkubować skrawki przez 7 minut w 0,05% tetrachlorowodorku 3'-3'-diaminobenzydyny (DAB) i 0,003% H₂O_{2 (}25 ml Tris HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 μl 3% H_{20 2} + 500 μl DAB) pod wytrząsarką Oribtal w temperaturze 4 °C (w lodzie) i w ciemności (upewnij się, że wykonasz tę procedurę w nowej otwartej skrzynce pocztowej 5-Plend).
15. Przepłukać skrawki PBS trzy razy po 5 minut pod wytrząsarką orbitalną.
16. Przechowuj sekcje slajdów w PBS nie dłużej niż 24 godziny w PBS, a następnie przetwarzaj je do barwienia Nissl, jak opisano w protokole następnej sekcji.

Uwaga: DAB jest czynnikiem rakotwórczym. Używaj rękawiczek i wyczyść wszystkie naczynia używane wybielaczem po zakończeniu wszystkich eksperymentów.

5. Barwienie Nissl do przygotowania wycinków mózgu płodu do obserwacji mikroskopowej

1. Procedura barwienia Nissl powinna być wykonywana w biologicznym kapturze bezpieczeństwa.
2. Płukać sekcje szkiełka wodą dejonizowaną przez 2 minuty.
3. Inkubować sekcje w 70% etanolu przez 2 minuty.
4. Inkubować sekcje w 95% etanolu przez 6 minut.
5. Inkubować sekcje w 70% etanolu przez 2 minuty.
6. Opłucz skrawki w wodzie dejonizowanej przez 2 minuty.
7. Inkubować skrawki w Cresyl Violet Stain przez 3 minuty.
8. Opłucz skrawki w wodzie dejonizowanej przez 2 minuty.
9. Inkubować sekcje w 70% etanolu przez 2 minuty.
10. Inkubować skrawki w 95% etanolu + 3 ml lodowatego kwasu octowego przez 3 minuty.
11. Inkubować sekcje w 95% etanolu przez 2 minuty.
12. Inkubuj sekcje w 100% etanolu przez 2 minuty trzy razy.
13. Inkubować skrawki w ksylenie przez 10 minut trzy razy.
14. Szkiełka przytrzymujące sekcje mózgu płodu mogą być montowane za pomocą szkiełek Permount i szkiełek nakrywkowych.
15. Zamontowane szkiełka należy pozostawić na noc przed obserwacją mikroskopową i analizą.
16. Obserwację mikroskopową i mikrofotografie można wykonać pod mikroskopem pionowym Leica.

Wyniki

Opisane tutaj metody eksperymentalne pokazują, że 2-godzinne okno hodowlane jest niezbędne do oszacowania dokładnego etapu ciąży. Pokazaliśmy sekcję zarodków w wieku E13. Wykazaliśmy również mikrodysekcję mózgów płodu w E13. Procedura składa się z kilku etapów (a-c), jak opisano na rysunku 1. Mózgi płodu są preparowane od podstawy opuszki węchowej primordium do podstawy śródmózgowia (ryc. 1). Mózgi płodów są następnie utrwalane w 4% paraformaldehydzie w celu wykrycia immunochemicznego. P...

Dyskusja

Metodologia i technologia przedstawione w tym badaniu pokazują wpływ prenatalnej ekspozycji na alkohol w mózgach płodów oraz rolę peptydów troficznych w zapobieganiu tym skutkom. Mogą one dostarczyć informacji o tym, jak badać inne narkotyki lub inne toksyczne substancje chemiczne w mózgach płodów na różnych etapach ciąży.

Jeśli chodzi o paradygmat hodowlany, w niektórych przypadkach wykrycie czopa plemnikowego może być niezauważalne. W tym momencie ważne jest, aby przetestować wymaz z pochwy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Prowadnice Superfrost Plus	VWR	48311-703
PAP PEN	Research Products Int. Corp.
5-Plend Open Mailer	Heathrow Scientific, LLC	HS 15983G
Odklejane formy do zatapiania	Mikroskopia elektronowa Sciences	70182
Zestaw do wykrywania śmierci komórkowej in situ, POD	Roche Diagnostics, Inc	11684817910
Zbilansowany roztwór soli Hanksa	Invitrogen	14170-120
Żelatyna typu A	Mikroskop	G8-500
	W. NUHSBAUM, Inc	Leica M60, KL 200 LED
Micro-Vibratome	Leica, Inc Leica	VT 1000S
Moria Ultra Fine	Science Tools	11370-40	2 pary
probówek do karmienia Graduate 30 ml	Dyets, Inc	900012
Vitamin Mix	Bio-Serv. Inc.	F8031
Mieszanka mineralna	Bio-Serv. Inc.	F8598
Dekstryna maltozy	Bio-Serv. Inc.	3650
Alkohol etylowy 190 Proof, 5 galonów	111000190-SS05	Pharmco-AAPER
Mikroskop pionowy	W. NUHSBAUM, Inc	LEICA DM 4000