Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Podsumowanie

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Streszczenie

Epilepsja dotyka prawie 3 miliony ludzi w Stanach Zjednoczonych i do 50 milionów ludzi na całym świecie. Padaczka, definiowana jako występowanie spontanicznych, niesprowokowanych napadów, może być nabyta w wyniku uszkodzenia mózgu lub mutacji genetycznej. Próby modelowania napadów padaczkowych u zwierząt wykorzystywały przede wszystkim nabyte zniewagi (leki drgawkowe, stymulacja lub uszkodzenie mózgu) oraz manipulacje genetyczne (knockdown antysensowny, rekombinacja homologiczna lub transgeneza) u gryzoni. Danio pręgowany to system modelowy^{kręgowców 1-3}, który może stanowić cenną alternatywę dla badań nad padaczką na gryzoniach. Danio pręgowany jest szeroko stosowany w badaniach nad genetyką lub rozwojem kręgowców, wykazuje wysoki stopień podobieństwa genetycznego do ssaków i wyraża homologi dla ~ 85% znanych mutacji padaczki jednogenowej u ludzi. Ze względu na niewielkie rozmiary (4-6 mm długości) larwy danio pręgowanego mogą być utrzymywane w płynnych objętościach już od 100 μl we wczesnym okresie rozwoju i umieszczane w płytkach wielodołkowych. Odczynniki mogą być dodawane bezpośrednio do roztworu, w którym rozwijają się zarodki, co upraszcza podawanie leków i umożliwia szybkie badania przesiewowe in vivo badanych związków⁴. Syntetyczne oligonukleotydy (morfolinos), mutageneza, nukleaza palca cynkowego i podejścia transgeniczne mogą być stosowane do szybkiego generowania knockdownu lub mutacji genów u danio pręgowanego^5-7. Właściwości te dają danio pręgowanemu bezprecedensową przewagę nad gryzoniami w badaniach nad zaburzeniami neurologicznymi, takimi jak padaczka. Ponieważ "złotym standardem" w badaniach nad padaczką jest monitorowanie i analizowanie nieprawidłowych wyładowań elektrycznych, które powstają w centralnej strukturze mózgu (tj. napadów), opisano tutaj metodę efektywnego rejestrowania aktywności mózgu u larw danio pręgowanego. Metoda ta jest adaptacją konwencjonalnych technik rejestracji zewnątrzkomórkowej i pozwala na stabilne, długoterminowe monitorowanie aktywności mózgu u nienaruszonych larw danio pręgowanego. Przykładowe zapisy są pokazane dla ostrych napadów padaczkowych wywołanych przez stosowanie w kąpieli leków przeciwdrgawkowych oraz napadów spontanicznych zarejestrowanych u ryb zmodyfikowanych genetycznie.

Protokół

1. Produkcja i zbiór jaj

1. Hodowla danio pręgowanego odbywa się zgodnie ze standardowymi procedurami opisanymi wcześniej⁸. Krótko mówiąc, dorosłe danio pręgowane umieszcza się w zbiornikach hodowlanych z przegrodami. Kiedy następnego ranka zapalą się światła w pomieszczeniu, przegrody są usuwane ze zbiorników hodowlanych, a ryby mają około 20 do 60 minut niezakłóconego czasu godowego.
2. Jaja ze zbiorników hodowlanych zbiera się na sitku i spłukuje wodą z jaj. Jaja są następnie przenoszone na szalkę Petriego z wodą jajeczną. Niezapłodnione jaja i zanieczyszczenia usuwa się za pomocą pipety transferowej.
3. Umieścić szalkę Petriego zawierającą zebrane jaja w inkubatorze (28-32 °C). Po wykluciu się z jaj, około dwa dni po zapłodnieniu (dpf), usuń kosmówkę i wszelkie inne zanieczyszczenia za pomocą pipety transferowej.
4. W wybranym dniu po zapłodnieniu (od 3 do 8 dpf) należy zdjąć szalkę Petriego zawierającą swobodnie pływające larwy i umieścić na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej.

2. Pobieranie i przygotowanie mikroelektrod

1. Za pomocą ściągacza do mikropipet przeciągnij kapilarnę ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,2 mm do dwóch igieł i przechowuj na szalce Petriego o średnicy 150 mm lub pustym pudełku na pipety, kładąc je na głupich rampach szpachlowych. Igły można wyciągnąć z wyprzedzeniem. Można zastosować różne szklane kapilary o średnicy zewnętrznej w zależności od typu dostępnego stopnia głównego wzmacniacza.
2. Ponownie napełnić mikroelektrodę zewnątrzkomórkowym roztworem rejestrującym (2 M NaCl) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z dołączonym filtrem strzykawkowym Nalgene (4 mm) i dołączonym filamentem Microfil (Warner Precision Instruments). Potrząsać lub postukać bolusem w kierunku końcówki igły, aż pozostanie niewiele pęcherzyków lub nie pozostanie ich wcale.

3. Unieruchomienie w agarze

1. Przygotuj świeży roztwór 1,2% agaru o niskiej temperaturze topnienia w wodzie jajecznej. Umieścić roztwór agaru w łaźni wodnej o temperaturze ~37 °C.
2. Przygotuj szkiełko nakrywkowe z komorą nagrywającą i umieść w zamrażarce (5-10 min). Komora zapisu powinna być zgodna z tą używaną na stanowisku do elektrofizjologii. Korzystamy z niskoprofilowej otwartej komory obrazowania w kąpieli diamentowej firmy Warner Instruments (model RC-26GLP).
3. Za pomocą pipety Pasteura lub pipety transferowej umieść jedną larwę danio pręgowanego w małej kropelce wody z jaj na czystej płytce Petriego. Do tej kropli dodać kroplę roztworu zawierającego środek znieczulający (0,02% tricainy) i środek paraliżujący (1 mg/ml α-bungarotoksyny).
4. Monitoruj danio pręgowanego pod kątem utraty ruchu (5 do 10 min).
5. Wyjmij szkiełko nakrywkowe/komorę zapisu z zamrażarki. Umieść komorę na stoliku mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą pipety transferowej wymieszać kilka ml 1,2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia z kropelką i roztworem transferowym (z rybą) do szkiełka nakrywkowego/komory rejestrującej.
6. Za pomocą końcówki pipety lub cienkiej, igły umieść larwy pod mikroskopem stereoskopowym tak, aby grzbietowa strona ryby była wystawiona na powierzchnię żelu agarozowego. Pozostaw agarozę do stwardnienia (5-10 min), a następnie za pomocą płaskiej szpatułki przenieś blok agaru do komory rejestracyjnej ustawionej na stanowisku do elektrofizjologii.

3. Rejestracja pola zewnątrzkomórkowego

1. Dodać 2-5 ml nośnika do zapisu danio pręgowanego do komory zapisu. Jeśli konieczna jest zmiana leku, należy umieścić w komorze perfuzyjnej z roztworem rejestrującym o stężeniu około 1 ml/min. Nie jest konieczne natlenianie roztworu rejestrującego.
2. Włóż mikroelektrodę (o średnicy końcówki około 1 μm, 2-7 MΩ) do wzmacniacza amplifier zamontowany na trójwymiarowym mikromanipulatorze. Sprawdź, czy mikromanipulator znajduje się we właściwej pozycji, aby umożliwić pewien zakres ruchu i regulacji. Umieść końcówkę mikroelektrody w płaszczyźnie view mikroskopu, wysoko od stolika i używając zgrubnej regulacji niżej do punktu tuż powyżej i nieco przed głową danio pręgowanego.
3. Gdy wzmacniacz jest w trybie "cęgów prądowych", wyzeruj elektrodę.
4. Korzystając z regulacji zgrubnej, opuść końcówkę elektrody tak, aby dotykała tylko powierzchni danio pręgowanego, nieco przed przodomózgowiem.
5. Za pomocą precyzyjnych kroków regulacji przesuwaj końcówkę elektrody, aż przebije skórę danio pręgowanego. Pozostaw do ustabilizowania się, a następnie przesuń elektrodę o kilka mikronów do przodomózgowia.
6. Rejestruj aktywność elektryczną w trybie cęgów prądowych za pomocą oprogramowania Axoscope. Dane są pozyskiwane z częstotliwością próbkowania 10 kHz.

Wyniki

Przykłady elektrograficznych wyładowań przypominających napady drgawkowe, zarejestrowane w przedmózgowiu larw zebrafish zatopionych w agarze, przedstawiono na Rysunku 1. Wyładowania w postaci wielopiąstkowych serii o dużej amplitudzie w tych próbkach zostały wywołane poprzez aplikację kąpielową leku konwulsyjnego: 40 mM pilokarpiny (na A; 6 dpf) lub 1 mM piktoksyny (na B; 8 dpf). W tych pomiarach unieruchomione i zatopione w agarze zebrafish są monitorowane w sposób ciągły przez maksymalnie 90 min. Ryby ...

Dyskusja

Przedstawiona tu metoda zapisu zewnątrzkomórkowego umożliwia bardzo czułą i szybką analizę aktywności mózgu. Zapisy te są analogiczne do monitorowania elektroencefalograficznego (EEG) powszechnie stosowanego do oceny obecności nieprawidłowego wyładowania elektrycznego (tj. napadu) w modelach padaczki u gryzoni¹¹ i pacjentów¹². Zapisy zewnątrzkomórkowe można łączyć z manipulacjami farmakologicznymi, jak pokazano tutaj. Tego typu zapisy mogą być również wykorzystane do oceny potencjalnych fen...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza niskotopliwa	Fisher-Scientific	BP1360-100	Rozpuszczać w pożywkach zarodkowych o stężeniu 1,2%
Nośniki zapisujące	Fisher-Scientific	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 10 mM dekstroza, 2,1 mM CaCl2 pH do około 7,3 z 1 N NaOH
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0,02%
&alfa;-bungarotoksyna	Tocris Bioscience	2133	1 mg/ml
Rurka ze szkła kapilarnego	Warner Instruments	G120TF-3	Pociągnij do oporu 2 -7 MΩ
Wzmacniacz z zaciskiem krosowym	Warner Instruments	PC-505B	Używamy wzmacniacza Warner w trybie cęgów prądowych; Wzmocnienie ustawione na 2 mV/pA i filtr Bessela ustawione na 2K. Porównywalne modele mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta.
Filtr/wzmacniacz	Cygnus Technology	FLA-01	Używamy przedwzmacniacza Cygnus; Wzmocnienie ustawione na 10-20; Częstotliwość graniczna ustawiona na 1-2K; Filtr wycinający IN. Porównywalne modele mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta.
Płytka Axon A/D i oprogramowanie Axoscope	, Molecular Devices	, Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2	Dane są zbierane w Axoscope w trybie akwizycji bez przerw; próbkowanie z częstotliwością 10 KHz. Porównywalne modele i programy mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta.
Woda jajeczna	Instant Ocean		3 g Sól morska Instant Ocean, 2 ml 0,1% błękitu metylenowego w 10 ml wody dejonizowanej