Artykuł metodologiczny

Zbieranie, izolacja i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska

23.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50123

⸱

15 listopada 2012

 ,  ,  , 
1School of Earth Sciences, The Ohio State University, 2School of Environment & Natural Resources, The Ohio State University, 3Institute of Geology and Geophysics, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Demonstrujemy metodę zbierania bakterii magnetotaktycznych (MTB), które można zastosować do naturalnych wód. MTB można wyizolować i wzbogacić z próbek osadu przy użyciu stosunkowo prostej konfiguracji, która wykorzystuje naturalny magnetyzm bakterii. Wyizolowany MTB można następnie szczegółowo zbadać zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej.

Streszczenie

Bakterie magnetotaktyczne (MTB) to mikroorganizmy wodne, które po raz pierwszy zostały opisane w 1975 roku1 na podstawie próbek osadów zebranych na słonych bagnach Massachusetts (USA). Od tego czasu MTB zostały odkryte w warstwowych kolumnach wodnych i osadowych z całego świata2. Jedną z cech wspólnych dla wszystkich MTB jest to, że zawierają one magnetosomy, które są wewnątrzkomórkowymi, związanymi z błoną nanokryształami magnetycznymi magnetytu (Fe3O4) i / lub greigitu (Fe3S4) lub obu3, 4. Na półkuli północnej MTB są zazwyczaj przyciągane do południowego końca magnesu sztabkowego, podczas gdy na półkuli południowej są zwykle przyciągane do północnego końca magnesu3,5. Właściwość tę można wykorzystać przy próbie odizolowania MTB od próbek środowiskowych.

Jednym z najczęstszych sposobów na wzbogacenie MTB jest użycie przezroczystego plastikowego pojemnika do zbierania osadów i wody z naturalnego źródła, takiego jak staw słodkowodny. Na półkuli północnej południowy koniec magnesu sztabkowego jest umieszczony na zewnątrz pojemnika tuż nad osadem na granicy osad-woda. Po pewnym czasie bakterie można usunąć z wnętrza pojemnika w pobliżu magnesu za pomocą pipety, a następnie dodatkowo wzbogacić za pomocą kapilarnego toru wyścigowego6 i magnesu. Po wzbogaceniu bakterie można umieścić na szkiełku mikroskopowym za pomocą metody wiszącej kropli i obserwować w mikroskopie świetlnym lub zdeponować na miedzianej siatce i obserwować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Korzystając z tej metody, izolowane MTB mogą być badane mikroskopowo w celu określenia takich cech jak zachowanie podczas pływania, typ i liczba wici, morfologia komórek komórkowych, kształt kryształów magnetycznych, liczba magnetosomów, liczba łańcuchów magnetosomów w każdej komórce, skład kryształów nanomineralnych i obecność wewnątrzkomórkowych wakuoli.

Protokół

1. Kolekcja MTB

  1. Decydując się na miejsce słodkowodne do zbierania bakterii magnetotaktycznych (MTB), często najlepiej jest zacząć od stawu lub wolno płynącego strumienia, który ma miękką błotnistą warstwę osadu. W tej demonstracji pobraliśmy próbkę na brzegu rzeki Olentangy na terenie kampusu Uniwersytetu Stanowego Ohio (OSU) w Columbus w stanie Ohio (USA). Chociaż była to dogodna lokalizacja dla naszej demonstracji, opisany tutaj protokół ma zastosowanie do każdej lokalizacji wodnej. Materiały użyte w tym protokole znajdują się w tabeli 1. Znajdź miejsce, w którym głębokość wody wynosi od 10 do 100 cm. W takim miejscu należy zebrać najwyższą warstwę osadu za pomocą przezroczystego, zakręcanego pojemnika. Nabierz osad i wodę do pojemnika, aż zostanie wypełniony jedną trzecią do połowy osadu, a pozostałą objętość wodą. Trzymaj pojemnik zanurzony, aż zostanie napełniony wodą, a następnie szczelnie zakręć pojemnik zakręcaną pokrywką. Nie ma potrzeby mieszania osadu. Wytrzyj zewnętrzną część pojemnika do sucha ręcznikiem, a następnie zabierz próbkę do laboratorium. Nie ma potrzeby spieszyć się z powrotem próbki do laboratorium. Zostawiliśmy próbki MTB w plastikowych pojemnikach na polu przez kilka dni, zanim przywieźliśmy je z powrotem do naszego laboratorium. MTB powinien być żywy przez kilka tygodni do miesięcy, o ile przechowujesz próbki w chłodnym, zacienionym miejscu na polu.
  2. Gdy próbka znajdzie się w laboratorium, poluzuj nakrętkę i pozostaw ją przykrywającą pojemnik, aby zmniejszyć ilość parowania. Przechowuj pojemnik w temperaturze pokojowej w ciemnym pomieszczeniu, szufladzie lub całkowicie przykryj pojemnik folią aluminiową. Pozwolić, aby osad i drobne cząstki całkowicie osiadły na dnie pojemnika, pozostawiając próbkę w nienaruszonym stanie przez kilka godzin do kilku dni. Nie jest konieczne mieszanie osadu, MTB preferuje niezakłócone środowisko. Przezroczyste ścianki plastikowego pojemnika pozwolą Ci potwierdzić, że cząstki osiadły na dnie. W zależności od próbki, MTB może pozostać żywy w próbce przez wiele miesięcy.

2. Izolacja MTB

  1. Kiedy będziesz gotowy do odizolowania MTB, umieść magnesy po bokach plastikowego pojemnika około 1 cm nad powierzchnią styku osad-woda (rysunek 1A). Uważaj, aby nie naruszyć osadu na dnie pojemnika. Umieść południowy biegun magnesu sztabkowego po jednej stronie pojemnika, a północną stronę innego magnesu sztabkowego po przeciwnej stronie (Rysunek 1A). Można użyć prawie każdego magnesu, takiego jak mieszadło magnetyczne lub duży magnes na lodówkę. Do podparcia magnesów na odpowiedniej wysokości nad powierzchnią styku osad-woda można użyć wszystkiego. Odkryliśmy, że najlepiej jest umieścić magnesy na kartonie lub plastikowym pudełku, jednak magnesy można również przykleić taśmą na zewnątrz plastikowego pojemnika. Odczekaj od 30 minut do kilku godzin, aż bakterie podpłyną do magnesu.
  2. Za pomocą sterylnej pipety ostrożnie zebrać wodę z wnętrza pojemnika (Rysunek 1A) w pobliżu pozycji magnesu sztabkowego na biegunie południowym (dla próbek pobranych na półkuli północnej). Ta woda powinna zawierać MTB, które zostały przyciągnięte do magnesu sztabkowego na biegunie południowym. Następnie należy wykorzystać kapilarny tor wyścigowy, aby jeszcze bardziej wzbogacić MTB.

3. Tor wyścigowy MTB

  1. Aby wzbogacić próbkę w bakterie magnetotaktyczne, konieczny jest kapilarny tor wyścigowy (rysunki 1B i 1C). Należy je wykonać przed odizolowaniem komórek od przezroczystego plastikowego pojemnika.
  2. Użyj szklanej pipety Pasteura o średnicy 5,75 cala (146 mm), aby zrobić tor wyścigowy. Użyj diamentowego długopisu lub pilnika, aby odciąć górną część pipety, długość pipety nie jest kluczowa, ale powinna być w stanie pomieścić około 1-2 ml wody. Następnie użyj palnika Bunsena, aby stopić końcówkę, aby została uszczelniona (Rysunek 1C). Powstała pipeta powinna mieć otwarty koniec i uszczelniony koniec.
  3. Stwórz kilka takich torów wyścigowych, a następnie autoklaw. Dodatkowo będziesz musiał autoklawować bawełnę i kilka długich metalowych igieł.
  4. Dodać przefiltrowaną próbkę wody, pobraną z okolic granicy faz osadu z wodą pokazaną na rysunku 1A, do autoklawowanego toru wyścigowego za pomocą długiej metalowej igły przymocowanej do przefiltrowanej strzykawki. Wielkość porów filtra powinna wynosić 0,22 mm, aby wyeliminować zanieczyszczenia i zanieczyszczenia z wody. Ważne jest, aby mieć absolutną pewność, że w szklanej kapilarze nie ma pęcherzyków powietrza.
  5. Zatkaj spód toru wyścigowego sterylną bawełną (Rysunek 1B). Użyj metalowej igły, aby popchnąć bawełnę w kierunku uszczelnionego końca toru wyścigowego, tak aby znajdowała się w odległości 0.5 - 1 cm od uszczelnionej końcówki (Rysunek 1C).
  6. Za pomocą sterylnej pipety dodaj wodę zawierającą MTB (z sekcji 2.2) do zbiornika próbki (otwarty koniec) przygotowanego toru wyścigowego MTB (rysunek 1B).

4. Wzbogacenie MTB

  1. Gdy tor wyścigowy zostanie wypełniony próbką płynu, połóż go na boku na poziomej powierzchni (np. blacie stołowym) i umieść południowy biegun magnesu sztabkowego (na półkuli północnej) obok uszczelnionej końcówki toru wyścigowego (rysunki 1B i 1C).
  2. Poczekaj od 5 do 30 minut, aż rower MTB przejdzie przez bawełnę. Następnie należy zebrać płyn w pobliżu końcówki toru wyścigowego. Zbyt długie czekanie może wprowadzić zanieczyszczenia, takie jak inne ruchliwe bakterie, do końca naczynia włosowatego. Opcjonalnie możesz użyć mikroskopu świetlnego, aby zobaczyć końcówkę toru wyścigowego i obserwować, jak MTB zbiera się na końcu toru wyścigowego. Pozwoli Ci to określić, ile czasu zajmuje rowerowi MTB migrację przez bawełnianą zatyczkę.
  3. Delikatnie użyj diamentowego noża, aby zrobić małe zadrapanie w pobliżu bawełnianej zatyczki i oderwać koniec toru wyścigowego.
  4. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml z wąską igłą (rozmiar 25 lub 27), aby usunąć płyn z końcówki toru wyścigowego. Ta płynna próbka powinna teraz zawierać wzbogacony MTB.

5. Obserwacja MTB za pomocą mikroskopii świetlnej

  1. Umieścić kroplę (10-20 μl) wzbogaconej próbki MTB na szkiełku nakrywkowym.
  2. Szybko odwróć szkiełko nakrywkowe, tak aby kropla była teraz skierowana w dół i zwisała z szkiełka nakrywkowego.
  3. Umieść szkiełko nakrywkowe na o-ringu, który spoczywa na szklanym szkiełku. O-ring powinien mieć nieco mniejszą średnicę niż szkiełko nakrywkowe (około 1 cm; Rysunek 2).
  4. Umieść tę wiszącą kroplę na lekkim mikroskopie i skup się na jednej krawędzi kropli. Suchy obiektyw 60X działa bardzo dobrze, ponieważ większość z nich ma wysoką aperturę numeryczną (NA; np. 0,93), ale nie wymagają oleju, który jest trudny w użyciu w przypadku metody wiszącej kropli (rysunek 2).
  5. Umieść południowy koniec magnesu sztabkowego blisko wiszącego spadku, a MTB zacznie migrować w kierunku krawędzi kropli znajdującej się najbliżej magnesu (Rysunek 3). W ciągu kilku minut wiele rowerów MTB powinno znaleźć się na skraju spadku (Rysunek 3). Udowodnij sobie, że bakterie są magnetyczne, odwracając biegun magnesu, a następnie obserwuj, jak bakterie pływają w przeciwnym kierunku.

6. Obserwacja MTB za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

  1. Umieść kroplę (~20 μl) wzbogaconego MTB na miedzianej siatce i pozwól bakteriom osiąść przez 10 minut.
  2. Odetnij nadmiar wody kawałkiem czystej bibuły filtracyjnej.
  3. Opcjonalnie siatkę można barwić ujemnie 2% octanem uranylu, 2% kwasem fosfatungstycznym o pH 7,2 lub 2,5% molibdenianem sodu7, 8, 9. Odbywa się to poprzez umieszczenie miedzianej siatki na kropli bejcy natychmiast po inkubacji siatki ze wzbogaconym MTB. Inkubuj siatkę z ujemną plamą, czasy będą się różnić w zależności od użytej plamy, a następnie odchodź płyn kawałkiem czystej bibuły filtracyjnej.
  4. Obserwuj MTB za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM, rysunek 4). Do opisanej tutaj pracy MTB zostały zaadsorbowane na stabilizowanych i powlekanych węglem siatkach miedzianych Formvar o siatce 200 mesh (Ted Pella #01800). Kratki umieszczono stroną węglową do dołu na kropli zawiesiny ogniw na okres do 10 minut, a następnie natychmiast umyto jeden raz, umieszczając siatkę na kropli wody na 30 sekund. W celu barwienia siatki umieszczono na kropli 2% octanu uranylu (Ted Pella #19481) na 30 sekund do 5 minut, a następnie całkowicie wysuszono za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej. Sieci były analizowane przez TEM przy użyciu FEI Tecnai Spirit przy napięciu 80 kV lub FEI Tecnai F20 przy użyciu pierścieniowego STEM o wysokim kącie nachylenia przy napięciu 200 kV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Magnes jest skutecznym narzędziem, które może być wykorzystane do izolacji bakterii magnetotaktycznych (MTB) zawartych w próbkach środowiskowych (Rysunek 1A). Kapilarny tor wyścigowy (Rysunek 1B) wykorzystuje właściwości magnetyczne MTB, aby przyciągnąć je przez bawełniany czopek, gdzie mogą one zostać oddzielone od mikroorganizmów niemagnetotaktycznych, które również znajdują się w próbce środowiskowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Bakterie magnetotaktyczne niekoniecznie występują w każdym środowisku wodnym8 ale kiedy już wystąpią, można je znaleźć rzędu 100 - 1,000 komórek na mililitr2. Aby obserwować MTB za pomocą mikroskopii optycznej, potrzebujesz około 50 bakterii/ml w próbce8. Jeśli w próbce nie ma MTB lub jest ich niewiele, będziesz musiał wybrać nowy teren środowiskowy w celu pobrania próbek lub będziesz musiał wypróbować jedną lub więcej technik omówionych w następnej sekcji.

Po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z U.S. National Science Foundation (EAR-0920299 i EAR-0745808); U.S. National Science Foundation East Asian and Pacific Summer Institutes; Geological Society of America Research Grant Program oraz Alumni Grants for Graduate Research and Scholarship z Uniwersytetu Stanowego Ohio. Dziękujemy redaktorowi i dwóm anonimowym recenzentom za wnikliwe komentarze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka szklaneFisher ScientificS95933
Szklane pipety PasteuraFisher Scientific13-678-6A
O-ringSklep
narzędziami Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-542B
Magnes sztabkowyFisher ScientificS95957
PojemnikdowolnyKażdy plastikowy lub szklany pojemnik, który może pomieścić co najmniej 0,5 l i może być zamknięty
BawełnaDowolny
mikroskop z suchą soczewką 60XZeissSucha soczewka 60X nie jest absolutnie konieczna, ale daje to wysokie NA bez użycia oleju
Długopis diamentowyFisher Scientific08-675
Filtr 0,22 mm
mlFisher ScientificNC9788564
Probówki do mikrowirówekFisher Scientific02-681-320
Formvar/Carbon 200 mesh, siatki miedzianeTed Pella Inc.01800
Octan uranyluTed Pella Inc.19481
Tecnai Spirit TEMFEI
Tecnai F20 S/TEMFEI
z Strzykawka Fisher Scientific 09-719C 1

Bibliografia

  1. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, 377-379 (1975).
  2. Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).
  3. Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).
  4. Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria. Science. 334, 1720-1723 (2011).
  5. Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere. Science. 311, 371-374 (2006).
  6. Wolfe, R., Thauer, R., et al. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).
  7. Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote. Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).
  8. Moench, T. T., Konetzka, W., et al. A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium. Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).
  9. Balkwill, D., Maratea, D. Ultrastructure of a magnetotactic spirillum. Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).
  10. Lins, U., Freitas, F., et al. Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).
  11. Jogler, C., Lin, W., et al. Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).
  12. Lin, W., Li, J., et al. Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China. Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).
  13. Li, J., Pan, Y., et al. Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria. Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).
  14. Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy. Micron. 43, 1331-1335 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

separacja magnetycznator kapilarnymikroskopia wietlnatransmisyjna mikroskopia elektronowapobieranie pr bek rodowiskowychosad s odkowodnyanaliza magnetosom wmetoda wisz cej kropliwzbogacanie magnesem sztabkowym

Powiązane artykuły