Nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek

Summary

Tutaj prezentujemy histologiczną metodę przechwytywania, znakowania, optycznego oczyszczania i obrazowania nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle wszczepionych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni. Wyniki technik obejmujących tę metodę są przydatne do zrozumienia wpływu różnych penetrujących implantów mózgowych na otaczające je tkanki.

Abstract

Badania nad projektowaniem i wykorzystaniem mikrourządzeń z implantami do mózgu, takich jak układy mikroelektrod, mają na celu wyprodukowanie klinicznie istotnych urządzeń, które chronicznie łączą się z otaczającą tkanką mózgową. Uważa się, że tkanka otaczająca te implanty reaguje na obecność urządzeń w miarę upływu czasu, co obejmuje tworzenie izolującej "blizny glejowej" wokół urządzeń. Jednak analiza histologiczna tych zmian tkankowych jest zwykle wykonywana po eksplantacji urządzenia, w procesie, który może zakłócić morfologię tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.

Tutaj demonstrujemy protokół, w którym urządzenia z wszczepioną korą są zbierane w stanie nienaruszonym w otaczającej tkance mózgowej gryzoni. Opisujemy, w jaki sposób, po perfuzji utrwalaczem, mózgi są usuwane i krojone w taki sposób, aby uniknąć eksplantacji urządzeń. Przedstawiamy metody znakowania przeciwciałami fluorescencyjnymi i optycznego usuwania przydatne do wytwarzania pouczającego, ale grubego wycinka tkanki. Na koniec demonstrujemy montaż i obrazowanie tych skrawków tkanek w celu zbadania interfejsu biologicznego wokół urządzeń z implantami mózgu.

Introduction

Dziedzina badań neuroprotetycznych ma na celu pomoc osobom cierpiącym na różne niepełnosprawności i zaburzenia poprzez omijanie chorych lub uszkodzonych struktur w ciele za pomocą urządzeń łączących OUN^1,2. Mikrourządzenia z implantami do mózgu, takie jak matryce mikroelektrod (MEA), mogą być wykorzystywane do rejestrowania lub stymulowania struktur mózgu, a tym samym umożliwiają ustanowienie długoterminowych interfejsów między elektroniką a tkanką OUN^3-5. Penetrujące MEA, urządzenia, które są wprowadzane do tkanki mózgowej, są szczególnie obiecujące jako dwukierunkowe interfejsy ze względu na bliską bliskość, w której prezentują elektrody do stosunkowo niewielkiego zestawu pobliskich neuronów⁶.

Jednak złożone reakcje tkanek wynikają z długotrwałej implantacji penetrujących MEA, co często skutkuje zmiennymi i stopniowo pogarszającymi się elektrofizjologicznymi stosunkami sygnału do szumu w ciągu dni do miesięcy oraz wzrostem impedancji elektrycznej między miejscami elektrod a ziemią^7,8. Przypuszczalne pochodzenie tych zmian obejmuje aktywację mikrogleju, reaktywną astrocytozę wzdłuż mikrourządzeń oraz utratę lub migrację neuronów z tkanki otaczającej do wszczepionych urządzeń^9-11. Głównym wyzwaniem dla zrozumienia tych zmian tkankowych wokół przewlekłych, penetrujących MEA jest trudność w uchwyceniu danych histologicznych nienaruszonego interfejsu tkankowego otaczającego przewlekle wszczepione urządzenia¹². Analiza histologiczna tkanki z nadal obecnym interfejsem wyrób/tkanka poprawiłaby obecne protokoły histologiczne usuwania urządzenia. Gdy niezakłócone urządzenie pozostaje w tkance, biologiczny wpływ stosunkowo subtelnych interakcji, takich jak zastosowanie biokompatybilnych powłok^13,14 lub elektryczne oczyszczanie powierzchni elektrody^15,16, może być obrazowany i analizowany w odniesieniu do implantu.

Tutaj demonstrujemy metodę zbierania, przetwarzania i obrazowania nienaruszonego interfejsu mikrourządzenia do szczegółowej analizy otaczającej tkanki mózgowej opartej na mikroskopii. W tej metodzie urządzenie i otaczająca tkanka mózgowa są zbierane w grubym (>250 μm) skrawku tkanki za pomocą wibratomu. Aby poprawić penetrację znacznika histologicznego do tych grubych plastrów, fluorescencyjne znaczniki histochemiczne i immunohistochemiczne są nakładane w wysokich stężeniach w roztworach zawierających surowicę blokującą i detergent przez wiele dni. W celu poprawy głębokości obrazowania mikroskopowego zastosowano rozwiązanie do czyszczenia optycznego, a tkanka jest umieszczana w 2-stronnych komorach w celu późniejszej laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej¹⁷. Aby uchwycić pełny interfejs histologiczny, podczas obrazowania stosuje się sterowany komputerowo etap translacyjny w celu zebrania panoram stosu z wzdłuż implantów. Oprócz obrazowania nałożonych etykiet tkankowych, zbieranie odbicia laserowego z powrotem z implantów i przepuszczanie światła przez tkankę pomaga zlokalizować interfejs urządzenia w stosunku do otaczającej tkanki. Tkanka przygotowana przy użyciu tego protokołu "Device-Capture Histology" (DCHist) zapewnia dostęp do obrazowania morfologicznie zachowanych interakcji tkanka/urządzenie, a tym samym poprawia się w stosunku do poprzednich protokołów histologicznych usuwania urządzenia¹⁸.

Protocol

Rozwiązania

Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) - w g/l; 9 g NaCl, 0,144 g KH₂PO₄, 0,795 g Na₂HPO₄, przy pH 7,4

4% Formaldehyd - w ml/l; 202 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu sodu (0,4 M Na₂HPO₄), 48 ml roztworu jednozasadowego fosforanu sodu (0,4 M NaH₂PO₄), 500 ml 8% roztworu formaldehydu, 250 ml wody Milli-Q DDi, o pH 7,4

HEPES Buforowana sól fizjologiczna Hanka z azydkiem sodu (HBHS) - w g/l; 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g KH₂PO₄, 0,13 g Na₂HPO₄, 2 g glukozy, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgCl₂ 6 części H₂O, 0,05 g MgSO₄ 7 części H₂O, 0,165 g CaCl₂, 0,09 g NaN₃ przy pH 7,4

Roztwór do mycia (WS) - 1% obj./obj., normalna surowica kozia, 0,3% Triton X-100, w HBHS z azydkiem sodu (NaN₃). Wstaw WS do lodówki w temperaturze 4 °C przed użyciem w kolejnych etapach.

U2 Roztwór Scale - 4 M mocznik, 30% glicerol i 0,1% Triton X-100 ¹⁷

PROCEDURA

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone pod nadzorem Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Purdue oraz Programu Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Purdue.

1. Chirurgia

1. Różne aseptyczne metody chirurgiczne są zgodne z prezentowaną metodą histologiczną. Zaleca się stosowanie ramy stereotaktycznej i automatycznych podajników w celu poprawy odtwarzalności i kontroli kąta implantacji matryc mikroelektrod (MEA) w odniesieniu do płaszczyzn stereotaktycznych.

Uwaga: W tej demonstracji nasza metoda chirurgiczna jest następująca: trzymaj gryzonia w stereotaktycznych nausznikach podczas znieczulenia izofluranem (między 1-3%) przenoszonym przez tlen medyczny. Przetestuj na brak odbicia przytrzaśnięcia palca u szczura lub brak odruchu szczypania ogona u myszy, aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Nałóż maść do oczu i oczyść miejsce operowane trzema naprzemiennymi płukaniami betadiny i etanolu. Umyj ręce, rękawiczki chirurgiczne o świcie, siatkę na włosy, maskę na twarz i fartuch. Wstrzyknij bolus lidokainy, aby znieczulić obszar chirurgiczny, wykonaj nacięcie za pomocą nożyczek lub skalpela, oczyść okostną za pomocą skrobaka do kości i bawełnianych aplikatorów oraz wykonaj kraniotomię za pomocą rękojeści wiertła dentystycznego i wiertła. Wbij jednozębowy MEA do kory mózgowej za pomocą mikromanipulatora. Skorzystaj z pomocy asystenta chirurgicznego w utrzymaniu aseptycznych warunków chirurgicznych i dokumentuj postępy operacji.

2. Po wszczepieniu MEA do mózgu należy zebrać obrazy za pomocą mikroskopu chirurgicznego, aby poinformować o ewentualnym usunięciu czaszki z okolic mózgu. Wszczepione części urządzeń zostaną zakonserwowane in situ.

Uwaga: Ostateczne pobranie tkanki za pomocą urządzeń in situ polega na ścisłym dopasowaniu płaszczyzny włożenia urządzenia do płaszczyzny cięcia tkanki. Szczegółowe notatki na temat płaszczyzny wprowadzania urządzenia względem mózgu są więc bardzo ważne.

3. Po wszczepieniu urządzenia nałóż elastomer silikonowy Kwik-Sil (WPI) na odsłonięte trzpienie MEA lub okablowanie i pozostaw do utwardzenia. Wysterylizowany kawałek plastiku, taki jak wycięta końcówka pipety, może być użyty do utrzymania elastomeru silikonowego w małym dołku wokół kraniotomii podczas utwardzania.
4. Nałóż warstwę dwuskładnikowego akrylu dentystycznego ("Jet Liquid" i "Jet Powder" firmy Lang Dental) na Kwik-Sil i odsłoniętą czaszkę.

Uwaga: W późniejszym kroku, głowica zostanie stopiona, aby umożliwić oddzielenie implantu od czaszki. Należy unikać utwardzania promieniami UV akrylu przed Kwik-Sil i kraniotomią, ponieważ ten bardzo twardy akryl jest trudny do późniejszego usunięcia. Należy również unikać wizualnie nieprzezroczystych materiałów wokół implantu; clear Kwik-Sil zapewnia wgląd w implant podczas kolejnych etapów tego protokołu.

5. Wykonywanie zabiegów opieki pooperacyjnej zgodnie z lokalnym protokołem przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt i powrót pacjentów ambulatoryjnych do jednorodzinnych boksów.

2. Perfuzja i pobieranie tkanek

Uwaga: Zobacz Gage et al. Aby zapoznać się ze szczegółowym przewodnikiem po procedurze perfuzji w modelu szczura^{zwierzęcego 19}.

1. Stosuj protokół znieczulenia i perfuzji zatwierdzony przez komitet ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania instytucji. Po głębokim znieczuleniu gryzonia (potwierdzonym brakiem odruchu szczypania palców u szczurów lub odruchem szczypania ogona u myszy) i odsłonięciu serca należy wykonać płytkie nacięcia nożycowe w lewej komorze i prawym przedsionku. Włóż igłę do lewej komory i podaj PBS w temperaturze pokojowej. Dostarczyć łącznie ~10 ml PBS przy ~5 ml/min u myszy i ~200 ml PBS przy ~100 ml/min u szczurów. Poszukaj klirenu krwi z wątroby podczas.
2. W razie potrzeby wstrzyknąć histologicznie istotne etykiety chemiczne przezsercowo, podając strzykawkę, zachowując ostrożność, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków.

Uwaga: Etykiety naczyniowe (np. DiI) i barwniki przeciwbarwiące kwasy nukleinowe (np. Hoechst 33342) są przykładami etykiet chemicznych, które można dostarczyć podczas perfuzji. Przy prawidłowym podawaniu, te markery histologiczne powinny oznaczać całe zwierzę²⁰.

3. Dostarczyć buforowany 4% formaldehyd o temperaturze pokojowej przezskórnie, aby utrwalić zwierzę. Należy unikać perforacji przegrody w poprzek serca, o czym może świadczyć drenaż płuc i nosa podczas perfuzji. Poszukaj drżenia fiksacyjnego w dużych mięśniach, aby wskazać na całkowitą perfuzję. Dostarczyć łącznie ~10 ml utrwalacza przy ~5 ml/min u myszy i ~200 ml utrwalacza przy ~100 ml/min u szczurów.
4. Po perfuzji odciąć zwierzęciu głowę, odsłonić część pnia mózgu lub móżdżku za pomocą rongeurs lub nożyczek i umieścić głowę w 4% roztworze formaldehydu na noc w temperaturze 4 °C.
5. Umyj głowę w trzech zmianach PBS w odstępach od jednej do czterech godzin między praniami.
6. Stałe głowice należy przechowywać w HBHS zawierającym azydek sodu w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub miesięcy.

3. Usuwanie mózgu za pomocą urządzeń in situ

Uwaga: Wykonaj tę sekcję pod wyciągiem wyciągowym, nosząc odpowiedni sprzęt ochrony osobistej. Unikaj wysuszania tkanek, okresowo wkładając stałą głowicę do roztworu HBHS.

1. Ostrożnie wypreparuj skórę i inne tkanki z okolic akrylowej czapki czaszki za pomocą kleszczy i małych nożyczek.
2. Nosząc rękawice niewrażliwe na ciepło, użyj lutownicy, aby usunąć akryl dentystyczny i odsłonić obszar leżącego pod spodem przezroczystego Kwik-Sil (Rysunek 2a).

Uwaga: Celem tego kroku jest umożliwienie mikronożyczkom odpowiedniego kąta dostępu do pozycji, w których wszczepione urządzenia wchodzą do mózgu, tak aby elementy wszczepione do mózgu mogły być oddzielone od elementów przymocowanych do czaszki.

3. Pod mikroskopem chirurgicznym pokrój elastomer silikonowy za pomocą zakrzywionych mikronożyczek, usuwając małe kawałki Kwik-Sil za pomocą pęsety aż do miejsca, w którym urządzenia wchodzą do mózgu.
4. Kontynuuj cięcie wzdłuż powierzchni kraniotomii za pomocą zakrzywionych mikronożyczek, aby oddzielić elementy urządzenia przyczepione do polikrzemu i czaszki od elementów wszczepionych do mózgu. Ponownie należy używać powiększenia mikroskopu i zachować szczególną ostrożność podczas przecinania odsłoniętych elementów urządzenia, uważając, aby nie wciskać lub nie przeciągać implantów w utrwalonej tkance.
5. Ostrożnie usuń kość wokół główki za pomocą rongeurs. Użyj szpatułki, aby oddzielić mózg z wszczepionymi urządzeniami od czaszki. Przechowuj mózg w roztworze HBHS, aż będzie gotowy do krojenia.
6. Umieść mózg na szklanej szalce Petriego wypełnionej HBHS i użyj żyletki, aby usunąć obce tkanki, takie jak rdzeń kręgowy, móżdżek lub opuszka węchowa, w zależności od tego, czy są one istotne dla lokalizacji implantacji urządzenia. Użyj bloku mózgowego (Ted Pella) i żyletek, aby podzielić mózg na sekcje i stworzyć płaską płaszczyznę ściśle dopasowaną do kąta wszczepionych urządzeń; Osiąga się to poprzez umieszczenie mózgu w bloku mózgowym o odpowiedniej wielkości, zorientowanie mózgu w taki sposób, aby każda widoczna część implantu była równoległa do prowadnicy żyletki, oraz umieszczenie żyletki w prowadnicy ostrza w odległości co najmniej 2 mm od implantu. Wciśnij żyletkę przez tkankę. Zamontuj tę powierzchnię na platformie wibratomowej. Alternatywnie, żyletka zamontowana na mikromanipulatorze może być używana w podobnie kontrolowany sposób jak blok mózgowy, aby stworzyć płaszczyznę ściśle dopasowaną do kierunku implantu.
7. Umieść lód pod platformą wibratomu, a po pozostawieniu powierzchni tkanki do krótkiego wyschnięcia na ręczniku papierowym, przyklej mózg do wibratomu za pomocą Super Glue. Przyklej płaską płaszczyznę tkanki utworzoną w poprzednim kroku do etapu. W przypadku asymetrycznych wymiarów tkanki należy ustawić próbkę w taki sposób, aby najszerszy wymiar był przyklejony równolegle do kierunku ruchu ostrza wibratomu, aby uniknąć potencjalnego przewrócenia tkanki przez ostrze. Po związaniu kleju (~1-2 min) dodaj schłodzony (~4 °C) PBS do naczynia wibratomu wokół tkanki.
8. Zbieraj grube plastry tkanek o wielkości od 200 do 400 μm, w tym tkankę kontrolną, używając maksymalnej szybkości wibracji (~100 Hz) i powolnej szybkości postępu ostrza (< 0,2 mm na sekundę), przy kącie ostrza 10 ° od poziomu. Ostrożnie zebrać plastry za pomocą pędzla lub szpatułki i przechowywać w HBHS na 24-dołkowej płytce w temperaturze 4 °C.
9. Gdy urządzenie in situ jest widoczne gołym okiem lub pod mikroskopem chirurgicznym, należy pobrać cieńsze fragmenty, aby zbliżyć się do urządzenia w odstępach co 100 μm lub mniejszych.

Uwaga: Typowe mikroimplanty silikonowe są widoczne gołym okiem w tkance kory mózgowej gryzoni utrwalonej formaldehydem w odległości od 300 do 500 μm od powierzchni urządzenia.

10. Gdy urządzenie in situ znajduje się teraz blisko powierzchni tkanki, zbierz wycinek tkanki o wielkości >250 μm zawierający znajdujące się w nim urządzenie. Oszacowanie potrzebnej grubości może być wspomagane przez odniesienie do wcześniej zebranych plastrów.

>Uwaga: Większe urządzenia, urządzenia wielozębowe i urządzenia kątowe mogą wymagać grubszych warstw tkanki (>500 μm), aby uchwycić urządzenie w jednym kawałku tkanki; pamiętaj, że zarówno penetracja nałożonych etykiet, jak i głębokość obrazowania mikroskopowego będą ograniczone w ostatecznym zbieraniu danych z tych bardzo grubych warstw. Jeśli to możliwe, unikaj uderzania urządzenia ostrzem wibratomowym, ponieważ może to spowodować przeciąganie urządzenia przez tkankę i deformację morfologiczną.

4. Przetwarzanie i oczyszczanie tkanek

1. Pierz plastry 3x po 5 minut na pranie w HBHS
2. Inkubować w borowodorku sodu (5 mg NaBH₄/ 1 ml HBHS) łącznie przez 30 minut (15 minut z każdej strony plastra). Odwróć plastry za pomocą mikro łyżki ze stali nierdzewnej lub pokrytej teflonem i małego pędzelka (Ted Pella). Powolne i przemyślane ruchy poprawiają sukces każdego przewrócenia plasterka. Unikaj dotykania szczoteczką jakichkolwiek obszarów wokół wszczepionego urządzenia. Jeśli to możliwe, dodanie znacznie większej ilości roztworu niż wymagane (>2 ml) pozwala na łatwiejsze manipulowanie i odwracanie plasterków tkanki.

Uwaga: Ten krok zmniejsza endogeniczną autofluorescencję; Pomiń ten krok, jeśli etykiety fluorescencyjne zostały nałożone podczas perfuzji lub obecne są markery transgeniczne xFP.

3. Plastry myć 3x po 5 minut na pranie w roztworze myjącym o temperaturze pokojowej.

Uwaga: Mieszanie podczas etapów mycia i inkubacji jest opcjonalne. Autorzy spekulują, że subtelne wstrząsy sztywnego implantu w stosunku do otaczającej tkanki mózgowej mogą wystąpić wraz z pobudzeniem. Jednak mieszalnik orbitalny poruszający się z łagodną prędkością (< 60 obr./min) może tego uniknąć, jednocześnie zwiększając ruch roztworów.

4. Blokuj przez 2 godziny w roztworze do mycia w temperaturze pokojowej (odwróć plasterki po godzinie).
5. Inkubować w przeciwciałach pierwszorzędowych (rozcieńczonych w roztworze do mycia) przez około 48 godzin (24 godziny z każdej strony plastru) w temperaturze 4 °C.
6. Wykonaj 6 szybkich, 3-minutowych myć roztworem do mycia.
7. Wykonaj 6, 1 godzinne pranie (3 prania z każdej strony plastra chusteczki) w roztworze do mycia (przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku prania przez noc).
8. Inkubować w przeciwciałach drugorzędowych (rozcieńczonych roztworem do mycia) przez około 48 godzin (24 godziny z każdej strony) w temperaturze 4 °C.
9. Wykonaj 6 szybkich, 3-minutowych myć roztworem do mycia.
10. Wykonaj 6, 1 godzinne pranie (3 prania z każdej strony) w roztworze myjącym; przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku prania przez noc.
11. Usuń roztwór myjący i dodaj roztwór oczyszczający "U2 - Scale" na bazie glicerolu. Pozostawić do oczyszczenia około 1 tygodnia w przypadku grubych plastrów (250-500 μm) lub 2-3 tygodni w przypadku bardzo grubych skrawków tkanek (>500 μm) w temperaturze 4 °C.
12. Przykryć płytę folią i przechowywać w temperaturze 4 °C.
13. Zamontuj w szkiełkach mieszczących grube skrawki tkanki (ryc. 2b, 2c) za pomocą roztworu czyszczącego jako nośnika montażowego i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.

5. Obrazowanie panoramiczne pełnego interfejsu tkanek i urządzeń

1. Używając obiektywów mikroskopu o większej odległości roboczej (> 2 mm), rozpocznij obrazowanie za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu 2-fotonowego. Zademonstrujemy to za pomocą Zeiss LSM 710, oprogramowania "Zen" Carl Zeiss (2010) i sterowanego komputerowo stolika translacyjnego XY, aby zobrazować panoramę 3D wokół implantu.

Uwaga: Popraw współczynnik załamania światła roztworu czyszczącego albo w oprogramowaniu, poprzez kołnierz korekcyjny na obiektywie, albo w przetwarzaniu danych po zebraniu. W tej demonstracji wprowadzamy wartość współczynnika załamania światła dla roztworu czyszczącego "U2" wynoszącą 1,4 do oprogramowania mikroskopu Leica Zen; To ustawienie subtelnie dostosowuje odstępy kroku Z, aby uwzględnić niedopasowanie współczynnika załamania światła.

2. W tkance w pobliżu urządzenia z grubsza oceń odpowiednie okno osi z i ustawienia zbierania danych w wymiarze z dla każdego kanału fluorescencyjnego przy użyciu niskiej mocy lasera (~0,5 do 5%) i dużych rozmiarów kroku z (>25 μm).

Uwaga: Uwzględnij dodatkowe miejsce powyżej i poniżej podczas ustawiania osi z podczas ustawiania do zbierania danych panoramicznych, ponieważ tkanka może nie leżeć całkowicie płasko na szkle szkiełkowym (~20 μm w każdym kierunku).

3. Ustaw cel w centrum x-y swojej ostatecznej panoramy; korzystając z oprogramowania Zen panorama, określ liczbę pozycji zbierania wymaganych dla każdej osi (x i y), aby pokryć obszar zainteresowania.
4. Ponownie oceń i sfinalizuj okno zbierania danych na osi z.
5. Ręcznie ustaw czułość detektora i moc lasera tak, aby odpowiednio narastały wraz ze wzrostem głębokości; celem jest zazwyczaj utrzymanie w przybliżeniu tej samej intensywności obrazu niezależnie od głębokości obrazowania w wycinku tkanki, ale także uniknięcie wysokiego szumu tła.
6. Zbierz każdą serię danych obrazu fluorescencyjnego. Jeśli to konieczne, aby uniknąć nakładania się sygnałów, należy sekwencyjnie uruchamiać linie laserowe.

Uwaga: Jeśli to możliwe, ustaw oprogramowanie tak, aby automatycznie zapisywało dane na dysku twardym podczas zbierania.

7. Zmień ustawienia oprogramowania, aby zbierać dane o "odbiciu" i "transmitancji", a następnie użyj dłuższego, bardziej penetrującego lasera o długości fali (np. 633 nm) do uchwycenia tych kanałów. Określ odpowiednią moc lasera i czułość detektora dla zbierania "odbicia" i "transmitancji", a następnie powtórz tę samą serię zbierania wokół wszczepionego urządzenia.
8. Eksportuj dane do późniejszego przetwarzania, kwantyfikacji i analizy.

Results

MEA z implantami mózgu mogą być zbierane w wycinkach tkanki, najpierw oddzielając wszelkie elementy zamontowane na czaszce od elementów osadzonych w mózgu. Rysunek 2a przedstawia wyniki usunięcia jednej strony nasadki z cementu dentystycznego i części Kwik-Sil otaczającej MEA na czaszce szczura. Do usunięcia cementu dentystycznego i Kwik-Sil użyto lutownicy. Okablowanie i wszelkie niewszczepione struktury MEA zostały następnie przecięte mikronożycami, powoli przebijając się przez Kwik-Sil do powierzchni nieruchomego mózgu.

Po pokrojeniu, oznaczeniu i oczyszczeniu tkanki, do montażu grubych plastrów tkanki przydatne są proste, wykonane na zamówienie preparaty (Rysunek 2b). Zamontowany wycinek mózgu zawierający wszczepione mikrourządzenie pokazano na rysunku 2c. Obrazowanie po obu stronach szkiełka może pozwolić na ocenę granicy faz wokół urządzenia, jak pokazano na rysunku 3, gdzie mikroglej wzdłuż krzemowego podłoża MEA jest widoczny z jednej strony (rysunek 3a), a mikroglej wzdłuż miejsc elektrod i śladów są widoczne po drugiej stronie (rysunek 3b).

Po zamontowaniu, tkanka może być obrazowana za pomocą etapu translacji XY. Przeglądy znaczników fluorescencyjnych na całych wycinkach tkanek mogą być generowane w żądanej rozdzielczości (rysunek 4). Szczegółowe badanie morfologicznie zachowanej granicy tkanek wokół wszczepionych mikrourządzeń można pobrać w dużym powiększeniu w celu analizy lokalnej odpowiedzi tkankowej (ryc. 5).

Rysunek 1. Przegląd procedury. lit. a-c) Operacje wszczepienia mikroimplantów mózgowych są finalizowane warstwą polimeru Kwik-Sil bezpośrednio otaczającą urządzenie, a następnie pokryciem z cementu akrylowego. d, e) Po eutanazji warstwa akrylowa jest wypalana, a elementy urządzenia montowane na czaszce są oddzielane od elementów wszczepionych poprzez przecięcie elastomeru silikonowego. (f), g) Mózg jest następnie usuwany z czaszki, wycinany i montowany do etapu wibratomu. (h-k) Pobierane są wycinki tkanek, w tym wycinek tkanki zawierający urządzenie. (l) Tkanka może być następnie przetwarzana i umieszczana w niestandardowych komorach w celu szczegółowej mikroskopii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. (a) Przezroczysty elastomer silikonowy Kwik-Sil otaczający elektrody (strzałka) został odsłonięty przez wypalenie okienka w nasadce z cementu dentystycznego na perfundowanej głowie gryzonia za pomocą lutownicy. (b) Aby umożliwić obrazowanie po obu stronach grubego wycinka tkanki, można wykonać proste "komory szkiełkowe" poprzez wycięcie plastikowego szkiełka i przyklejenie szkła nakrywkowego z obu stron wokół tkanki i roztworu montażowego. (c) Wycinek tkanki mózgowej szczura z nienaruszonym implantem (czerwona strzałka) jest pokazany po zamontowaniu. Dzięki tej konfiguracji każda strona tkanki jest szybko dostępna do obrazowania mikroskopowego. W przypadku skali panel (a) ma 25 mm średnicy u dołu, podczas gdy panele (b, c) mają 80 mm średnicy u dołu.

Rysunek 3. Projekcje z o maksymalnej intensywności ze stosów obrazów o grubości 40 μm, zebrane wokół tylnej strony (a) i przodu (b) wszczepionego układu mikroelektrod. Mikroglej (oznaczony anty-Iba1 i Alexa Fluor 633, biały) i odbicie światła laserowego (czerwone), zebrane z powierzchni urządzenia, zostały sekwencyjnie zobrazowane z obu stron wycinka tkanki o grubości 400 μm. Ponieważ implanty mózgowe są często nieprzezroczyste, montaż z dostępem optycznym po obu stronach zapewnia wyraźny widok oznakowanych struktur tkankowych "za" implantem w stosunku do obiektywu mikroskopu. Podziałka 50 μm.

Rysunek 4. Oznaczony wycinek DCHist zobrazowany za pomocą sterowanego komputerowo stolika na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. (a) Jądra komórkowe (barwione Hoechst 33342) i (b) monocyty/mikroglej (znakowane anty-Iba1) były jednocześnie obrazowane na oddzielnych kanałach. (c) Zebrano również światło transmisyjne i współczynnik odbicia, pokazując lokalizację implantu w ciągu 4 tygodni w odniesieniu do danych Hoechst i Iba1. (d) Pokazane jest również nakładanie wszystkich kanałów, ale także transmisja. Biały obszar prostokąta jest rozszerzony na obrazach wyświetlanych po prawej stronie. Podziałka liniowa 1 mm.

Rysunek 5. Za pomocą sterowanego komputerowo stolika mikroskopowego i odpowiedniego oprogramowania można zebrać dane z obrazowania panoramicznego wokół implantu. Współczynnik odbicia (a) i transmitancja (b) umożliwiają lokalizację urządzenia, podczas gdy fluorescencyjne przeciwciała lub znaczniki chemiczne (c, znakowanie anty-Iba1 mikrogleju i makrofagów) umożliwiają szczegółowe obrazowanie składników tkanki wzdłuż nienaruszonego interfejsu tkankowego. Podziałka 200 μm.

Discussion

Zademonstrowana tutaj metoda "Device-Capture Histology" (DCHist) umożliwia dokładną ocenę histologiczną morfologicznie zachowanych interakcji między tkanką mózgową a implantami tkankowymi. Pobranie tkanek DCHist wymaga starannego oddzielenia elementów urządzenia montowanego na czaszce od elementów wszczepionych do mózgu. DCHist wymaga również pobrania grubego wycinka tkanki histologicznej (>250 μm). Te skrawki tkanek, po oznaczeniu, oczyszczeniu, zamontowaniu i zobrazowaniu, mogą dostarczyć nowych informacji na temat urazu implantacyjnego lub późniejszej przewlekłej reakcji na urządzenia zainstalowane na stałe. Korzystając z zaawansowanych narzędzi mikroskopowych, interfejs między tkanką a urządzeniem może być obrazowany i analizowany z dużą szczegółowością, jak pokazano na rysunkach 3-5.

Prezentowane techniki w swojej obecnej formie polegają na możliwości powolnego wydobywania nasadki wykonanej z dwuskładnikowego cementu dentystycznego i Kwik-Sil aż do momentu wszczepienia urządzenia. Wykorzystanie cementu dentystycznego, który można spalić lub w inny sposób usunąć, oraz przezroczystego elastomeru silikonowego, przez który można wizualnie prowadzić małe nożyczki, znacznie pomaga w skutecznym oddzieleniu wszczepionego urządzenia od jego elementów zamontowanych na czaszce. Nie zaleca się prób przecięcia urządzenia pod czaszką i nad mózgiem w celu zebrania go in situ , ponieważ implant montowany na czaszce zostanie znacznie wyciągnięty z mózgu.

Chociaż cieńsze, mniejsze implanty, takie jak jednozębowe MEA firmy NeuroNexus Technologies, są najbardziej podatne na DCHist, zasady nie ograniczają się do pojedynczych trzonków urządzeń lub układów mikroelektrod. Strategie pobierania i obrazowania mają szerokie zastosowanie w przypadku wyrobów wielotrzpieniowych i większych implantów, takich jak kaniule, przy czym wymagania są takie, że muszą one być oddzielone od dowolnego mocowania czaszki i pobrane w grubym wycinku tkanki. Chociaż autorzy koncentrują się na analizie tkanki otaczającej implanty korowe, urządzenia wbite głębiej w mózg mogą być również zbierane i obrazowane. Głębokość wprowadzenia implantu nie powinna mieć wpływu na uchwycenie implantu w plastrze, pod warunkiem, że urządzenie nie odchyla się gwałtownie od znanego kąta wprowadzenia.

Istnieją ograniczenia w użytecznym zastosowaniu metody DCHist. Skrawki tkanki mózgowej są trudne do zobrazowania za pomocą setek mikrometrów, zwłaszcza w obszarach istoty białej, chociaż rozwiązania w zakresie oczyszczania optycznego mogą znacznie poprawić głębokość obrazowania w różnych tkankach²¹. Aby jeszcze bardziej poprawić głębię obrazowania, można zastosować mikroskopię wzbudzenia dwufotonowego wraz z opisanym oczyszczaniem optycznym.

Kolejnym potencjalnym ograniczeniem opisywanej metody mogą być specyficzne metody immunohistochemiczne fluorescencyjne oraz stosowane przez badaczy przeciwciała. Dyfuzja bierna zazwyczaj napędza inkorporację tych markerów przez utrwaloną tkankę i do miejsc wiązania antygenu. Końcowe stężenia robocze przeciwciał muszą być określane przez badaczy indywidualnie dla każdego przypadku, aby zmaksymalizować penetrację znacznika przy jednoczesnym uniknięciu wysokich poziomów znakowania tła. Znakowanie przeciwciał nie powinno być zmienne między warstwami, które są przetwarzane identycznie, ale różne przeciwciała mogą się znacznie różnić pod względem zdolności do przenikania i znakowania antygenu, przy czym niektóre przeciwciała łatwo znakują antygeny na głębokość wielu setek mikrometrów, a inne znakują antygeny tylko na głębokość kilkudziesięciu mikrometrów. Opisujemy poprawę tej dyfuzji poprzez stosowanie etykiet przeciwciał w stężeniach wyższych niż typowe, przez wiele dni stosowania oraz w roztworze zawierającym rozcieńczony detergent i surowicę blokującą. Okresowe przewracanie plasterków sprzyja również równomiernemu etykietowaniu. Etapy pobierania antygenu i alternatywne procesy wiązania (np. aldehyd glutarowy, mikrofale itp.) mogą być odpowiednie dla określonych antygenów. Drugorzędowe koniugaty przeciwciało-fluorochrom mogą również różnić się wydajnością znakowania grubych odcinków, chociaż nie zostało to zaobserwowane przez autorów używających znaczników Alexa Fluor firmy Invitrogen. Alternatywnie, transgeniczne zwierzęta wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w typach komórek będących przedmiotem zainteresowania mogą być wykorzystane w celu uniknięcia problemów z penetracją znacznika przeciwciała, ponieważ wiele białek fluorescencyjnych, takich jak eGFP, zachowuje swoją fluorescencję po traktowaniu formaldehydem i może być natychmiast uwidocznione w skrawkach tkanki.

DCHist to potężny zestaw technik do przechwytywania i analizowania wpływu wszczepionych mikrourządzeń na tkankę mózgową. Połączenie tego protokołu histologicznego z oceną in vivo jakości elektrofizjologii i danych dotyczących impedancji elektrod²² może znacznie poprawić naszą wiedzę na temat biologicznych źródeł zmienności i degradacji fizjologii. W szczególności dziedzina wszczepianych protez nerwowych może skorzystać ze szczegółowego obrazowania DCHist nienaruszonego interfejsu urządzenie/tkanka w celu informowania o dalszym rozwoju biologicznie neutralnych urządzeń MEA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynniki
H– chst 33342	Invitrogen	14533	Marker DNA
Królik anty-Iba1	Wako (Japonia)	019-19741	Przeciwciało monocytowe
Akryl	dentystyczny Lang Dental (różni dystrybutorzy)	Proszek do naprawy protez zębowych i Płynna	konstrukcja nasadki
Kwik-Sil	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Pokrywanie odsłoniętych implantów czaszki
Normalna surowica kozia	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Przetwarzanie tkanek
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Przetwarzanie tkanek
Mocznik	Sigma-Aldrich	U4883	Roztwór
Glycerol	Sigma-Aldrich	G20225	Roztwór
Sprzęt
Zakrzywione mikronożyczki	World Precision Instruments	14208	Cięcie implantu przed usunięciem mózgu
Żyletki	Ted Pella	(różne rozmiary)	Do użytku z Brain Block
Acrylic Brain Matrice	Ted Pella	15054	Blok mózgu do tworzenia początkowej płaszczyzny w tkance
Szkiełka plastikowe	Ted Pella	260225	Montaż chusteczki
Szkło nakrywkowe	Ted Pella	(różne rozmiary)	Montaż tkanki
Matryce elektrod	NeuroNexus Technologies	(różne projekty)	Przykład MEA
Vibratome	Leica	VT1000 S	Specyficzny system zastosowany w prezentowanej metodzie
Ostrza wibratomu	(różni dostawcy)		Zbieranie plastrów
Płytki 24-dołkowe	(różni dostawcy)		Przechowywanie i przetwarzanie plastrów tkanek
Mikroskop konfokalny z zmotoryzowanym stolikiem skanowania XY	Mikroskopia Carl Zeiss Zeiss	LSM 710 i ’ Zen 2010’ oprogramowanie	Specyficzny system zastosowany w prezentowanej metodzie
Lutownica	(różni dostawcy)		Nasadka do kopania