Tutaj prezentujemy histologiczną metodę przechwytywania, znakowania, optycznego oczyszczania i obrazowania nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle wszczepionych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni. Wyniki technik obejmujących tę metodę są przydatne do zrozumienia wpływu różnych penetrujących implantów mózgowych na otaczające je tkanki.
Artykuł metodologiczny
Nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania nad projektowaniem i wykorzystaniem mikrourządzeń z implantami do mózgu, takich jak układy mikroelektrod, mają na celu wyprodukowanie klinicznie istotnych urządzeń, które chronicznie łączą się z otaczającą tkanką mózgową. Uważa się, że tkanka otaczająca te implanty reaguje na obecność urządzeń w miarę upływu czasu, co obejmuje tworzenie izolującej "blizny glejowej" wokół urządzeń. Jednak analiza histologiczna tych zmian tkankowych jest zwykle wykonywana po eksplantacji urządzenia, w procesie, który może zakłócić morfologię tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.
Tutaj demonstrujemy protokół, w którym urządzenia z wszczepioną korą są zbierane w stanie nienaruszonym w otaczającej tkance mózgowej gryzoni. Opisujemy, w jaki sposób, po perfuzji utrwalaczem, mózgi są usuwane i krojone w taki sposób, aby uniknąć eksplantacji urządzeń. Przedstawiamy metody znakowania przeciwciałami fluorescencyjnymi i optycznego usuwania przydatne do wytwarzania pouczającego, ale grubego wycinka tkanki. Na koniec demonstrujemy montaż i obrazowanie tych skrawków tkanek w celu zbadania interfejsu biologicznego wokół urządzeń z implantami mózgu.
Wprowadzenie
Dziedzina badań neuroprotetycznych ma na celu pomoc osobom cierpiącym na różne niepełnosprawności i zaburzenia poprzez omijanie chorych lub uszkodzonych struktur w ciele za pomocą urządzeń łączących OUN1,2. Mikrourządzenia z implantami do mózgu, takie jak matryce mikroelektrod (MEA), mogą być wykorzystywane do rejestrowania lub stymulowania struktur mózgu, a tym samym umożliwiają ustanowienie długoterminowych interfejsów między elektroniką a tkanką OUN3-5. Penetrujące MEA, urządzenia, które są wprowadzane do tkanki mózgowej, są szczególnie obiecujące jako dwukierunkowe interfejsy ze względu na bliską bliskość, w której prezentują elektrody do stosunkowo niewielkiego zestawu pobliskich neuronów6.
Jednak złożone reakcje tkanek wynikają z długotrwałej implantacji penetrujących MEA, co często skutkuje zmiennymi i stopniowo pogarszającymi się elektrofizjologicznymi stosunkami sygnału do szumu w ciągu dni do miesięcy oraz wzrostem impedancji elektrycznej między miejscami elektrod a ziemią7,8. Przypuszczalne pochodzenie tych zmian obejmuje aktywację mikrogleju, reaktywną astrocytozę wzdłuż mikrourządzeń oraz utratę lub migrację neuronów z tkanki otaczającej do wszczepionych urządzeń9-11. Głównym wyzwaniem dla zrozumienia tych zmian tkankowych wokół przewlekłych, penetrujących MEA jest trudność w uchwyceniu danych histologicznych nienaruszonego interfejsu tkankowego otaczającego przewlekle wszczepione urządzenia12. Analiza histologiczna tkanki z nadal obecnym interfejsem wyrób/tkanka poprawiłaby obecne protokoły histologiczne usuwania urządzenia. Gdy niezakłócone urządzenie pozostaje w tkance, biologiczny wpływ stosunkowo subtelnych interakcji, takich jak zastosowanie biokompatybilnych powłok13,14 lub elektryczne oczyszczanie powierzchni elektrody15,16, może być obrazowany i analizowany w odniesieniu do implantu.
Tutaj demonstrujemy metodę zbierania, przetwarzania i obrazowania nienaruszonego interfejsu mikrourządzenia do szczegółowej analizy otaczającej tkanki mózgowej opartej na mikroskopii. W tej metodzie urządzenie i otaczająca tkanka mózgowa są zbierane w grubym (>250 μm) skrawku tkanki za pomocą wibratomu. Aby poprawić penetrację znacznika histologicznego do tych grubych plastrów, fluorescencyjne znaczniki histochemiczne i immunohistochemiczne są nakładane w wysokich stężeniach w roztworach zawierających surowicę blokującą i detergent przez wiele dni. W celu poprawy głębokości obrazowania mikroskopowego zastosowano rozwiązanie do czyszczenia optycznego, a tkanka jest umieszczana w 2-stronnych komorach w celu późniejszej laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej17. Aby uchwycić pełny interfejs histologiczny, podczas obrazowania stosuje się sterowany komputerowo etap translacyjny w celu zebrania panoram stosu z wzdłuż implantów. Oprócz obrazowania nałożonych etykiet tkankowych, zbieranie odbicia laserowego z powrotem z implantów i przepuszczanie światła przez tkankę pomaga zlokalizować interfejs urządzenia w stosunku do otaczającej tkanki. Tkanka przygotowana przy użyciu tego protokołu "Device-Capture Histology" (DCHist) zapewnia dostęp do obrazowania morfologicznie zachowanych interakcji tkanka/urządzenie, a tym samym poprawia się w stosunku do poprzednich protokołów histologicznych usuwania urządzenia18.
Protokół
Rozwiązania
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) - w g/l; 9 g NaCl, 0,144 g KH2PO4, 0,795 g Na2HPO4, przy pH 7,4
4% Formaldehyd - w ml/l; 202 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu sodu (0,4 M Na2HPO4), 48 ml roztworu jednozasadowego fosforanu sodu (0,4 M NaH2PO4), 500 ml 8% roztworu formaldehydu, 250 ml wody Milli-Q DDi, o pH 7,4
HEPES Buforowana sól fizjologiczna Hanka z azydkiem sodu (HBHS) - w g/l; 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g KH2PO4, 0,13 g Na2HPO4, 2 g glukozy, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgCl2 6 części H2O, 0,05 g MgSO4 7 części H2O, 0,165 g CaCl2, 0,09 g NaN3 przy pH 7,4
Roztwór do mycia (WS) - 1% obj./obj., normalna surowica kozia, 0,3% Triton X-100, w HBHS z azydkiem sodu (NaN3). Wstaw WS do lodówki w temperaturze 4 °C przed użyciem w kolejnych etapach.
U2 Roztwór Scale - 4 M mocznik, 30% glicerol i 0,1% Triton X-100 17
PROCEDURA
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone pod nadzorem Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Purdue oraz Programu Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Purdue.
1. Chirurgia
- Różne aseptyczne metody chirurgiczne są zgodne z prezentowaną metodą histologiczną. Zaleca się stosowanie ramy stereotaktycznej i automatycznych podajników w celu poprawy odtwarzalności i kontroli kąta implantacji matryc mikroelektrod (MEA) w odniesieniu do płaszczyzn stereotaktycznych.
Uwaga: W tej demonstracji nasza metoda chirurgiczna jest następująca: trzymaj gryzonia w stereotaktycznych nausznikach podczas znieczulenia izofluranem (między 1-3%) przenoszonym przez tlen medyczny. Przetestuj na brak odbicia przytrzaśnięcia palca u szczura lub brak odruchu szczypania ogona u myszy, aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Nałóż maść do oczu i oczyść miejsce operowane trzema naprzemiennymi płukaniami betadiny i etanolu. Umyj ręce, rękawiczki chirurgiczne o świcie, siatkę na włosy, maskę na twarz i fartuch. Wstrzyknij bolus lidokainy, aby znieczulić obszar chirurgiczny, wykonaj nacięcie za pomocą nożyczek lub skalpela, oczyść okostną za pomocą skrobaka do kości i bawełnianych aplikatorów oraz wykonaj kraniotomię za pomocą rękojeści wiertła dentystycznego i wiertła. Wbij jednozębowy MEA do kory mózgowej za pomocą mikromanipulatora. Skorzystaj z pomocy asystenta chirurgicznego w utrzymaniu aseptycznych warunków chirurgicznych i dokumentuj postępy operacji.
- Po wszczepieniu MEA do mózgu należy zebrać obrazy za pomocą mikroskopu chirurgicznego, aby poinformować o ewentualnym usunięciu czaszki z okolic mózgu. Wszczepione części urządzeń zostaną zakonserwowane in situ.
Uwaga: Ostateczne pobranie tkanki za pomocą urządzeń in situ polega na ścisłym dopasowaniu płaszczyzny włożenia urządzenia do płaszczyzny cięcia tkanki. Szczegółowe notatki na temat płaszczyzny wprowadzania urządzenia względem mózgu są więc bardzo ważne.
- Po wszczepieniu urządzenia nałóż elastomer silikonowy Kwik-Sil (WPI) na odsłonięte trzpienie MEA lub okablowanie i pozostaw do utwardzenia. Wysterylizowany kawałek plastiku, taki jak wycięta końcówka pipety, może być użyty do utrzymania elastomeru silikonowego w małym dołku wokół kraniotomii podczas utwardzania.
- Nałóż warstwę dwuskładnikowego akrylu dentystycznego ("Jet Liquid" i "Jet Powder" firmy Lang Dental) na Kwik-Sil i odsłoniętą czaszkę.
Uwaga: W późniejszym kroku, głowica zostanie stopiona, aby umożliwić oddzielenie implantu od czaszki. Należy unikać utwardzania promieniami UV akrylu przed Kwik-Sil i kraniotomią, ponieważ ten bardzo twardy akryl jest trudny do późniejszego usunięcia. Należy również unikać wizualnie nieprzezroczystych materiałów wokół implantu; clear Kwik-Sil zapewnia wgląd w implant podczas kolejnych etapów tego protokołu.
- Wykonywanie zabiegów opieki pooperacyjnej zgodnie z lokalnym protokołem przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt i powrót pacjentów ambulatoryjnych do jednorodzinnych boksów.
2. Perfuzja i pobieranie tkanek
Uwaga: Zobacz Gage et al. Aby zapoznać się ze szczegółowym przewodnikiem po procedurze perfuzji w modelu szczurazwierzęcego 19.
- Stosuj protokół znieczulenia i perfuzji zatwierdzony przez komitet ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania instytucji. Po głębokim znieczuleniu gryzonia (potwierdzonym brakiem odruchu szczypania palców u szczurów lub odruchem szczypania ogona u myszy) i odsłonięciu serca należy wykonać płytkie nacięcia nożycowe w lewej komorze i prawym przedsionku. Włóż igłę do lewej komory i podaj PBS w temperaturze pokojowej. Dostarczyć łącznie ~10 ml PBS przy ~5 ml/min u myszy i ~200 ml PBS przy ~100 ml/min u szczurów. Poszukaj klirenu krwi z wątroby podczas.
- W razie potrzeby wstrzyknąć histologicznie istotne etykiety chemiczne przezsercowo, podając strzykawkę, zachowując ostrożność, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków.
Uwaga: Etykiety naczyniowe (np. DiI) i barwniki przeciwbarwiące kwasy nukleinowe (np. Hoechst 33342) są przykładami etykiet chemicznych, które można dostarczyć podczas perfuzji. Przy prawidłowym podawaniu, te markery histologiczne powinny oznaczać całe zwierzę20.
- Dostarczyć buforowany 4% formaldehyd o temperaturze pokojowej przezskórnie, aby utrwalić zwierzę. Należy unikać perforacji przegrody w poprzek serca, o czym może świadczyć drenaż płuc i nosa podczas perfuzji. Poszukaj drżenia fiksacyjnego w dużych mięśniach, aby wskazać na całkowitą perfuzję. Dostarczyć łącznie ~10 ml utrwalacza przy ~5 ml/min u myszy i ~200 ml utrwalacza przy ~100 ml/min u szczurów.
- Po perfuzji odciąć zwierzęciu głowę, odsłonić część pnia mózgu lub móżdżku za pomocą rongeurs lub nożyczek i umieścić głowę w 4% roztworze formaldehydu na noc w temperaturze 4 °C.
- Umyj głowę w trzech zmianach PBS w odstępach od jednej do czterech godzin między praniami.
- Stałe głowice należy przechowywać w HBHS zawierającym azydek sodu w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub miesięcy.
3. Usuwanie mózgu za pomocą urządzeń in situ
Uwaga: Wykonaj tę sekcję pod wyciągiem wyciągowym, nosząc odpowiedni sprzęt ochrony osobistej. Unikaj wysuszania tkanek, okresowo wkładając stałą głowicę do roztworu HBHS.
- Ostrożnie wypreparuj skórę i inne tkanki z okolic akrylowej czapki czaszki za pomocą kleszczy i małych nożyczek.
- Nosząc rękawice niewrażliwe na ciepło, użyj lutownicy, aby usunąć akryl dentystyczny i odsłonić obszar leżącego pod spodem przezroczystego Kwik-Sil (Rysunek 2a).
Uwaga: Celem tego kroku jest umożliwienie mikronożyczkom odpowiedniego kąta dostępu do pozycji, w których wszczepione urządzenia wchodzą do mózgu, tak aby elementy wszczepione do mózgu mogły być oddzielone od elementów przymocowanych do czaszki.
- Pod mikroskopem chirurgicznym pokrój elastomer silikonowy za pomocą zakrzywionych mikronożyczek, usuwając małe kawałki Kwik-Sil za pomocą pęsety aż do miejsca, w którym urządzenia wchodzą do mózgu.
- Kontynuuj cięcie wzdłuż powierzchni kraniotomii za pomocą zakrzywionych mikronożyczek, aby oddzielić elementy urządzenia przyczepione do polikrzemu i czaszki od elementów wszczepionych do mózgu. Ponownie należy używać powiększenia mikroskopu i zachować szczególną ostrożność podczas przecinania odsłoniętych elementów urządzenia, uważając, aby nie wciskać lub nie przeciągać implantów w utrwalonej tkance.
- Ostrożnie usuń kość wokół główki za pomocą rongeurs. Użyj szpatułki, aby oddzielić mózg z wszczepionymi urządzeniami od czaszki. Przechowuj mózg w roztworze HBHS, aż będzie gotowy do krojenia.
- Umieść mózg na szklanej szalce Petriego wypełnionej HBHS i użyj żyletki, aby usunąć obce tkanki, takie jak rdzeń kręgowy, móżdżek lub opuszka węchowa, w zależności od tego, czy są one istotne dla lokalizacji implantacji urządzenia. Użyj bloku mózgowego (Ted Pella) i żyletek, aby podzielić mózg na sekcje i stworzyć płaską płaszczyznę ściśle dopasowaną do kąta wszczepionych urządzeń; Osiąga się to poprzez umieszczenie mózgu w bloku mózgowym o odpowiedniej wielkości, zorientowanie mózgu w taki sposób, aby każda widoczna część implantu była równoległa do prowadnicy żyletki, oraz umieszczenie żyletki w prowadnicy ostrza w odległości co najmniej 2 mm od implantu. Wciśnij żyletkę przez tkankę. Zamontuj tę powierzchnię na platformie wibratomowej. Alternatywnie, żyletka zamontowana na mikromanipulatorze może być używana w podobnie kontrolowany sposób jak blok mózgowy, aby stworzyć płaszczyznę ściśle dopasowaną do kierunku implantu.
- Umieść lód pod platformą wibratomu, a po pozostawieniu powierzchni tkanki do krótkiego wyschnięcia na ręczniku papierowym, przyklej mózg do wibratomu za pomocą Super Glue. Przyklej płaską płaszczyznę tkanki utworzoną w poprzednim kroku do etapu. W przypadku asymetrycznych wymiarów tkanki należy ustawić próbkę w taki sposób, aby najszerszy wymiar był przyklejony równolegle do kierunku ruchu ostrza wibratomu, aby uniknąć potencjalnego przewrócenia tkanki przez ostrze. Po związaniu kleju (~1-2 min) dodaj schłodzony (~4 °C) PBS do naczynia wibratomu wokół tkanki.
- Zbieraj grube plastry tkanek o wielkości od 200 do 400 μm, w tym tkankę kontrolną, używając maksymalnej szybkości wibracji (~100 Hz) i powolnej szybkości postępu ostrza (< 0,2 mm na sekundę), przy kącie ostrza 10 ° od poziomu. Ostrożnie zebrać plastry za pomocą pędzla lub szpatułki i przechowywać w HBHS na 24-dołkowej płytce w temperaturze 4 °C.
- Gdy urządzenie in situ jest widoczne gołym okiem lub pod mikroskopem chirurgicznym, należy pobrać cieńsze fragmenty, aby zbliżyć się do urządzenia w odstępach co 100 μm lub mniejszych.
Uwaga: Typowe mikroimplanty silikonowe są widoczne gołym okiem w tkance kory mózgowej gryzoni utrwalonej formaldehydem w odległości od 300 do 500 μm od powierzchni urządzenia.
- Gdy urządzenie in situ znajduje się teraz blisko powierzchni tkanki, zbierz wycinek tkanki o wielkości >250 μm zawierający znajdujące się w nim urządzenie. Oszacowanie potrzebnej grubości może być wspomagane przez odniesienie do wcześniej zebranych plastrów.
>Uwaga: Większe urządzenia, urządzenia wielozębowe i urządzenia kątowe mogą wymagać grubszych warstw tkanki (>500 μm), aby uchwycić urządzenie w jednym kawałku tkanki; pamiętaj, że zarówno penetracja nałożonych etykiet, jak i głębokość obrazowania mikroskopowego będą ograniczone w ostatecznym zbieraniu danych z tych bardzo grubych warstw. Jeśli to możliwe, unikaj uderzania urządzenia ostrzem wibratomowym, ponieważ może to spowodować przeciąganie urządzenia przez tkankę i deformację morfologiczną.
4. Przetwarzanie i oczyszczanie tkanek
- Pierz plastry 3x po 5 minut na pranie w HBHS
- Inkubować w borowodorku sodu (5 mg NaBH4/ 1 ml HBHS) łącznie przez 30 minut (15 minut z każdej strony plastra). Odwróć plastry za pomocą mikro łyżki ze stali nierdzewnej lub pokrytej teflonem i małego pędzelka (Ted Pella). Powolne i przemyślane ruchy poprawiają sukces każdego przewrócenia plasterka. Unikaj dotykania szczoteczką jakichkolwiek obszarów wokół wszczepionego urządzenia. Jeśli to możliwe, dodanie znacznie większej ilości roztworu niż wymagane (>2 ml) pozwala na łatwiejsze manipulowanie i odwracanie plasterków tkanki.
Uwaga: Ten krok zmniejsza endogeniczną autofluorescencję; Pomiń ten krok, jeśli etykiety fluorescencyjne zostały nałożone podczas perfuzji lub obecne są markery transgeniczne xFP.
- Plastry myć 3x po 5 minut na pranie w roztworze myjącym o temperaturze pokojowej.
Uwaga: Mieszanie podczas etapów mycia i inkubacji jest opcjonalne. Autorzy spekulują, że subtelne wstrząsy sztywnego implantu w stosunku do otaczającej tkanki mózgowej mogą wystąpić wraz z pobudzeniem. Jednak mieszalnik orbitalny poruszający się z łagodną prędkością (< 60 obr./min) może tego uniknąć, jednocześnie zwiększając ruch roztworów.
- Blokuj przez 2 godziny w roztworze do mycia w temperaturze pokojowej (odwróć plasterki po godzinie).
- Inkubować w przeciwciałach pierwszorzędowych (rozcieńczonych w roztworze do mycia) przez około 48 godzin (24 godziny z każdej strony plastru) w temperaturze 4 °C.
- Wykonaj 6 szybkich, 3-minutowych myć roztworem do mycia.
- Wykonaj 6, 1 godzinne pranie (3 prania z każdej strony plastra chusteczki) w roztworze do mycia (przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku prania przez noc).
- Inkubować w przeciwciałach drugorzędowych (rozcieńczonych roztworem do mycia) przez około 48 godzin (24 godziny z każdej strony) w temperaturze 4 °C.
- Wykonaj 6 szybkich, 3-minutowych myć roztworem do mycia.
- Wykonaj 6, 1 godzinne pranie (3 prania z każdej strony) w roztworze myjącym; przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku prania przez noc.
- Usuń roztwór myjący i dodaj roztwór oczyszczający "U2 - Scale" na bazie glicerolu. Pozostawić do oczyszczenia około 1 tygodnia w przypadku grubych plastrów (250-500 μm) lub 2-3 tygodni w przypadku bardzo grubych skrawków tkanek (>500 μm) w temperaturze 4 °C.
- Przykryć płytę folią i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Zamontuj w szkiełkach mieszczących grube skrawki tkanki (ryc. 2b, 2c) za pomocą roztworu czyszczącego jako nośnika montażowego i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.
5. Obrazowanie panoramiczne pełnego interfejsu tkanek i urządzeń
- Używając obiektywów mikroskopu o większej odległości roboczej (> 2 mm), rozpocznij obrazowanie za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu 2-fotonowego. Zademonstrujemy to za pomocą Zeiss LSM 710, oprogramowania "Zen" Carl Zeiss (2010) i sterowanego komputerowo stolika translacyjnego XY, aby zobrazować panoramę 3D wokół implantu.
Uwaga: Popraw współczynnik załamania światła roztworu czyszczącego albo w oprogramowaniu, poprzez kołnierz korekcyjny na obiektywie, albo w przetwarzaniu danych po zebraniu. W tej demonstracji wprowadzamy wartość współczynnika załamania światła dla roztworu czyszczącego "U2" wynoszącą 1,4 do oprogramowania mikroskopu Leica Zen; To ustawienie subtelnie dostosowuje odstępy kroku Z, aby uwzględnić niedopasowanie współczynnika załamania światła.
- W tkance w pobliżu urządzenia z grubsza oceń odpowiednie okno osi z i ustawienia zbierania danych w wymiarze z dla każdego kanału fluorescencyjnego przy użyciu niskiej mocy lasera (~0,5 do 5%) i dużych rozmiarów kroku z (>25 μm).
Uwaga: Uwzględnij dodatkowe miejsce powyżej i poniżej podczas ustawiania osi z podczas ustawiania do zbierania danych panoramicznych, ponieważ tkanka może nie leżeć całkowicie płasko na szkle szkiełkowym (~20 μm w każdym kierunku).
- Ustaw cel w centrum x-y swojej ostatecznej panoramy; korzystając z oprogramowania Zen panorama, określ liczbę pozycji zbierania wymaganych dla każdej osi (x i y), aby pokryć obszar zainteresowania.
- Ponownie oceń i sfinalizuj okno zbierania danych na osi z.
- Ręcznie ustaw czułość detektora i moc lasera tak, aby odpowiednio narastały wraz ze wzrostem głębokości; celem jest zazwyczaj utrzymanie w przybliżeniu tej samej intensywności obrazu niezależnie od głębokości obrazowania w wycinku tkanki, ale także uniknięcie wysokiego szumu tła.
- Zbierz każdą serię danych obrazu fluorescencyjnego. Jeśli to konieczne, aby uniknąć nakładania się sygnałów, należy sekwencyjnie uruchamiać linie laserowe.
Uwaga: Jeśli to możliwe, ustaw oprogramowanie tak, aby automatycznie zapisywało dane na dysku twardym podczas zbierania.
- Zmień ustawienia oprogramowania, aby zbierać dane o "odbiciu" i "transmitancji", a następnie użyj dłuższego, bardziej penetrującego lasera o długości fali (np. 633 nm) do uchwycenia tych kanałów. Określ odpowiednią moc lasera i czułość detektora dla zbierania "odbicia" i "transmitancji", a następnie powtórz tę samą serię zbierania wokół wszczepionego urządzenia.
- Eksportuj dane do późniejszego przetwarzania, kwantyfikacji i analizy.
Wyniki
Implantowane w mózgu MEA można odzyskać z plastrów tkankowych, najpierw oddzielając komponenty zamocowane na czaszce od komponentów osadzonych w mózgu. Rycina 2a przedstawia wyniki usunięcia jednej strony nakładki czaszkowej z cementu dentystycznego oraz części Kwik-Sil otaczającego kabel MEA na czaszce szczura. Do usunięcia cementu dentystycznego i Kwik-Sil w dygestorium użyto lutownicy. Następnie okablowanie oraz wszelkie nieimplantowane struktury MEA przecięto mikronożyczkami, powoli wydrążając Kwik-Sil aż do powierzchni utrwalonego mózgu.
Po pocięciu, znakowaniu i klarowaniu tkanki, proste szkiełka wykonane na zamówienie są przydatne do montażu grubych skrawków tkanki (Rysunek 2b). Na Rysunku 2c przedstawiono zamontowany skrawka mózgu z implantowanym mikro urządzeniem. Obrazowanie z obu stron szkiełka pozwala ocenić interfejs wokół urządzenia, co zaprezentowano na Rysunku 3, gdzie z jednej strony widoczna jest mikroglej wzdłuż silikonowego podłoża MEA (Rysunek 3a), a z drugiej strony widoczna jest mikroglej wzdłuż miejsc elektrod i ścieżek (Rysunek 3b).
Po zamocowaniu tkanka może być obrazowana przy użyciu stolika translacyjnego XY. Przeglądowe obrazy znaczników fluorescencyjnych w obrębie całych przekrojów tkanki mogą być generowane z pożądaną rozdzielczością (Rysunek 4). Szczegółowa analiza morfologicznie zachowanego interfejsu tkankowego wokół implantowanych mikrourządzeń może być przeprowadzona przy dużym powiększeniu w celu oceny lokalnej odpowiedzi tkankowej (Rysunek 5).
Rysunek 1. Przegląd procedury. (a-c) Operacje mikroimplantacji mózgu kończy się nałożeniem warstwy polimeru Kwik-Sil bezpośrednio wokół urządzenia, a następnie pokryciem go cementem akrylowym. (d, e) Po eutanazji warstwa akrylowa zostaje wypalona, a komponenty urządzenia zamocowane do czaszki zostają oddzielone od komponentów implantowanych poprzez przecięcie elastomeru silikonowego. (f, g) Mózg zostaje następnie usunięty z czaszki, przecięty i zamontowany na stole wibratomu. (h-k) Pobierane są plastry tkanek, w tym plaster zawierający urządzenie. (l) Tkankę można następnie przetworzyć i zamontować w specjalnych komorach do szczegółowej mikroskopii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rycina 2. (a) Przezroczysty elastomer silikonowy Kwik-Sil otaczający kabel macierzy elektrod (strzałka) został odsłonięty poprzez wypalenie otworu w cementowej zakładce stomatologicznej na perfundowanej głowie gryzonia przy użyciu lutownicy. (b) Aby umożliwić obrazowanie obu stron grubego przekroju tkanki, proste „komory szkiełka” można wykonać poprzez docięcie szkiełka plastikowego i przyklejenie szkiełka nakrywkowego po obu stronach wokół tkanki i roztworu montującego. (c) Przedstawiono przekrój tkanki mózgu szczura z nienaruszonym implantem (czerwona strzałka) po montażu. Dzięki takiemu ustawieniu obie strony tkanki są szybko dostępne do obrazowania mikroskopowego. Dla skali: panel (a) ma 25 mm szerokości u dołu, natomiast panele (b, c) mają 80 mm szerokości u dołu.
Rysunek 3. Z-projekcje maksymalnej intensywności stosów obrazów o grubości 40 μm, zebranych z tyłu (a) i z przodu (b) wszczepionej macierzy mikroelektrod. Mikroglej (oznaczony przeciwciałem anty-Iba1 i Alexa Fluor 633, kolor biały) oraz odblask światła laserowego (kolor czerwony), zebrane z powierzchni urządzenia, obrazowano sekwencyjnie z obu stron skrawka tkanki o grubości 400 μm. Ponieważ implanty mózgowe są często nieprzezroczyste, montaż z dostępem optycznym do obu stron zapewnia wyraźny widok oznakowanych struktur tkankowych znajdujących się „za” implantem względem obiektywu mikroskopu. Pasek skali 50 μm.
Rysunek 4. Oznaczony przekrój DCHist obrazowany przy użyciu sterowanego komputerowo stolika w konfokalnym mikroskopie skaningowym. (a) Jądra komórkowe (barwione Hoechst 33342) oraz (b) monocyty/mikroglej (oznaczone przeciwciałem anty-Iba1) były obrazowane jednocześnie na osobnych kanałach. (c) Zebrano również światło transmisyjne i odbite, co pokazuje położenie 4-tygodniowego implantu w odniesieniu do danych Hoechst i Iba1. (d) Przedstawiono również nałożenie wszystkich kanałów z wyjątkiem transmisyjnego. Obszar białego prostokąta został powiększony na obrazach widocznych po prawej stronie. Pasek skali 1 mm.
Rycina 5. Przy użyciu sterowanego komputerowo stolika mikroskopowego i odpowiedniego oprogramowania można zebrać panoramiczne dane obrazowe wokół implantu. Reflektancja (a) i transmitancja (b) pozwalają na lokalizację urządzenia, natomiast fluorescencyjne przeciwciała lub znaczniki chemiczne (c, znakowanie mikrogleju i makrofagów przeciwciałami anty-Iba1) umożliwiają szczegółowe obrazowanie składników tkanki wzdłuż nienaruszonego interfejsu tkankowego. Pasek skali 200 μm.
Dyskusja
Zademonstrowana tutaj metoda "Device-Capture Histology" (DCHist) umożliwia dokładną ocenę histologiczną morfologicznie zachowanych interakcji między tkanką mózgową a implantami tkankowymi. Pobranie tkanek DCHist wymaga starannego oddzielenia elementów urządzenia montowanego na czaszce od elementów wszczepionych do mózgu. DCHist wymaga również pobrania grubego wycinka tkanki histologicznej (>250 μm). Te skrawki tkanek, po oznaczeniu, oczyszczeniu, zamontowaniu i zobrazowaniu, mogą dostarczyć nowych informacji na temat urazu implantacyjnego lub późniejszej przewlekłej reakcji na urządzenia zainstalowane na stałe. Korzystając z zaawansowanych narzędzi mikroskopowych, interfejs między tkanką a urządzeniem może być obrazowany i analizowany z dużą szczegółowością, jak pokazano na rysunkach 3-5.
Prezentowane techniki w swojej obecnej formie polegają na możliwości powolnego wydobywania nasadki wykonanej z dwuskładnikowego cementu dentystycznego i Kwik-Sil aż do momentu wszczepienia urządzenia. Wykorzystanie cementu dentystycznego, który można spalić lub w inny sposób usunąć, oraz przezroczystego elastomeru silikonowego, przez który można wizualnie prowadzić małe nożyczki, znacznie pomaga w skutecznym oddzieleniu wszczepionego urządzenia od jego elementów zamontowanych na czaszce. Nie zaleca się prób przecięcia urządzenia pod czaszką i nad mózgiem w celu zebrania go in situ , ponieważ implant montowany na czaszce zostanie znacznie wyciągnięty z mózgu.
Chociaż cieńsze, mniejsze implanty, takie jak jednozębowe MEA firmy NeuroNexus Technologies, są najbardziej podatne na DCHist, zasady nie ograniczają się do pojedynczych trzonków urządzeń lub układów mikroelektrod. Strategie pobierania i obrazowania mają szerokie zastosowanie w przypadku wyrobów wielotrzpieniowych i większych implantów, takich jak kaniule, przy czym wymagania są takie, że muszą one być oddzielone od dowolnego mocowania czaszki i pobrane w grubym wycinku tkanki. Chociaż autorzy koncentrują się na analizie tkanki otaczającej implanty korowe, urządzenia wbite głębiej w mózg mogą być również zbierane i obrazowane. Głębokość wprowadzenia implantu nie powinna mieć wpływu na uchwycenie implantu w plastrze, pod warunkiem, że urządzenie nie odchyla się gwałtownie od znanego kąta wprowadzenia.
Istnieją ograniczenia w użytecznym zastosowaniu metody DCHist. Skrawki tkanki mózgowej są trudne do zobrazowania za pomocą setek mikrometrów, zwłaszcza w obszarach istoty białej, chociaż rozwiązania w zakresie oczyszczania optycznego mogą znacznie poprawić głębokość obrazowania w różnych tkankach21. Aby jeszcze bardziej poprawić głębię obrazowania, można zastosować mikroskopię wzbudzenia dwufotonowego wraz z opisanym oczyszczaniem optycznym.
Kolejnym potencjalnym ograniczeniem opisywanej metody mogą być specyficzne metody immunohistochemiczne fluorescencyjne oraz stosowane przez badaczy przeciwciała. Dyfuzja bierna zazwyczaj napędza inkorporację tych markerów przez utrwaloną tkankę i do miejsc wiązania antygenu. Końcowe stężenia robocze przeciwciał muszą być określane przez badaczy indywidualnie dla każdego przypadku, aby zmaksymalizować penetrację znacznika przy jednoczesnym uniknięciu wysokich poziomów znakowania tła. Znakowanie przeciwciał nie powinno być zmienne między warstwami, które są przetwarzane identycznie, ale różne przeciwciała mogą się znacznie różnić pod względem zdolności do przenikania i znakowania antygenu, przy czym niektóre przeciwciała łatwo znakują antygeny na głębokość wielu setek mikrometrów, a inne znakują antygeny tylko na głębokość kilkudziesięciu mikrometrów. Opisujemy poprawę tej dyfuzji poprzez stosowanie etykiet przeciwciał w stężeniach wyższych niż typowe, przez wiele dni stosowania oraz w roztworze zawierającym rozcieńczony detergent i surowicę blokującą. Okresowe przewracanie plasterków sprzyja również równomiernemu etykietowaniu. Etapy pobierania antygenu i alternatywne procesy wiązania (np. aldehyd glutarowy, mikrofale itp.) mogą być odpowiednie dla określonych antygenów. Drugorzędowe koniugaty przeciwciało-fluorochrom mogą również różnić się wydajnością znakowania grubych odcinków, chociaż nie zostało to zaobserwowane przez autorów używających znaczników Alexa Fluor firmy Invitrogen. Alternatywnie, transgeniczne zwierzęta wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w typach komórek będących przedmiotem zainteresowania mogą być wykorzystane w celu uniknięcia problemów z penetracją znacznika przeciwciała, ponieważ wiele białek fluorescencyjnych, takich jak eGFP, zachowuje swoją fluorescencję po traktowaniu formaldehydem i może być natychmiast uwidocznione w skrawkach tkanki.
DCHist to potężny zestaw technik do przechwytywania i analizowania wpływu wszczepionych mikrourządzeń na tkankę mózgową. Połączenie tego protokołu histologicznego z oceną in vivo jakości elektrofizjologii i danych dotyczących impedancji elektrod22 może znacznie poprawić naszą wiedzę na temat biologicznych źródeł zmienności i degradacji fizjologii. W szczególności dziedzina wszczepianych protez nerwowych może skorzystać ze szczegółowego obrazowania DCHist nienaruszonego interfejsu urządzenie/tkanka w celu informowania o dalszym rozwoju biologicznie neutralnych urządzeń MEA.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych istotnych ujawnień do deklaracji, finansowych lub innych.
Podziękowania
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone pod nadzorem Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Purdue oraz Programu Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Purdue.
Ta praca była sponsorowana przez Biuro Technologii Mikrosystemów (MTO) Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych Obrony (DARPA), pod auspicjami Dr. Jacka W. Judy (jack.judy@darpa.mil) w ramach Programu Niezawodnej Technologii Neuronowej, za pośrednictwem Space and Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No. N66001-11-1-4013.
Autorzy chcieliby podziękować Mikhailowi Slipchenko, Donowi Ready'emu, Gregowi Richterowi, Aaronowi Taylorowi i Kevinowi Eliceiri za podzielenie się swoją wiedzą na temat mikroskopii.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynniki | |||
| H– chst 33342 | Invitrogen | 14533 | Marker DNA |
| Królik anty-Iba1 | Wako (Japonia) | 019-19741 | Przeciwciało monocytowe |
| Akryl | dentystyczny Lang Dental (różni dystrybutorzy) | Proszek do naprawy protez zębowych i Płynna | konstrukcja nasadki |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Pokrywanie odsłoniętych implantów czaszki |
| Normalna surowica kozia | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Przetwarzanie tkanek |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Przetwarzanie tkanek |
| Mocznik | Sigma-Aldrich | U4883 | Roztwór |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Roztwór |
| Sprzęt | |||
| Zakrzywione mikronożyczki | World Precision Instruments | 14208 | Cięcie implantu przed usunięciem mózgu |
| Żyletki | Ted Pella | (różne rozmiary) | Do użytku z Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Blok mózgu do tworzenia początkowej płaszczyzny w tkance |
| Szkiełka plastikowe | Ted Pella | 260225 | Montaż chusteczki |
| Szkło nakrywkowe | Ted Pella | (różne rozmiary) | Montaż tkanki |
| Matryce elektrod | NeuroNexus Technologies | (różne projekty) | Przykład MEA |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specyficzny system zastosowany w prezentowanej metodzie |
| Ostrza wibratomu | (różni dostawcy) | Zbieranie plastrów | |
| Płytki 24-dołkowe | (różni dostawcy) | Przechowywanie i przetwarzanie plastrów tkanek | |
| Mikroskop konfokalny z zmotoryzowanym stolikiem skanowania XY | Mikroskopia Carl Zeiss Zeiss | LSM 710 i ’ Zen 2010’ oprogramowanie | Specyficzny system zastosowany w prezentowanej metodzie |
| Lutownica | (różni dostawcy) | Nasadka do kopania | |
Bibliografia
- Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
- Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
- Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
- Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
- Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
- Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
- Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003(2009).
- Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
- Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
- Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
- Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
- Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
- Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
- Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566(2012).
Przedruki i uprawnienia
