Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zbieranie i pomiar biochemicznych mediatorów wysięku z rany w ranach chirurgicznych

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50133

⸱

20 października 2012

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółowy i wizualny opis metodologii zbierania i pomiaru biochemicznych mediatorów stanu zapalnego i nocyceptywnego w miejscu rany operacyjnej po cesarskim cięciu. Ten ludzki test biologiczny został wykorzystany do określenia korelacji między stężeniami cytokin w ranie i surowicy a zmianami w cytokinach, chemokinach i neuropetydach spowodowanych lekiem.

Streszczenie

Opisujemy metodologię, dzięki której jesteśmy w stanie zebrać i zmierzyć biochemiczne mediatory stanu zapalnego i nocyceptywnego w miejscu rany chirurgicznej. Zbieranie markerów biochemicznych specyficznych dla danego miejsca jest ważne dla zrozumienia związku między poziomami w surowicy a raną pooperacyjną, określenia wszelkich powiązań między uwalnianiem mediatorów, bólem, stosowaniem leków przeciwbólowych i innymi interesującymi wynikami oraz oceny wpływu podawania leków ogólnoustrojowych i obwodowych na biochemię ran chirurgicznych. Metodologia ta została zastosowana u zdrowych kobiet poddawanych planowemu cięciu cesarskiemu w znieczuleniu podpajęczynówkowym. Mierzyliśmy wysięk z rany i mediatory surowicy w tych samych odstępach czasu, co ocena bólu pacjentki i zużycie leków przeciwbólowych przez okres do 48 godzin po cesarskim cięciu. Korzystając z tej metodologii, byliśmy w stanie wykryć różne mediatory biochemiczne, w tym czynnik wzrostu nerwów (NGF), prostaglandynę E2 (PG-E2), substancję P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 i MIP-1β. Badania z zastosowaniem tego testu biologicznego ran chirurgicznych u ludzi nie wykazały korelacji między stężeniami cytokin w ranie i surowicy ani ich profilem uwalniania w czasie (J Pain. 2008; 9(7):650-7). 1 Udokumentowaliśmy również przydatność tej techniki do identyfikacji zmian w zawartości cytokin w ranie, w których pośredniczą leki (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). cyfra arabska

Wprowadzenie

Po chirurgicznym nacięciu, rezydentne i migrujące komórki zapalne uwalniają pro- i przeciwzapalne cytokiny, prostanoidy, neuropeptydy i chemokiny, które są ważne dla inicjowania i utrzymywania bólu. 3,4 Zdolność do zbierania markerów biochemicznych specyficznych dla danego miejsca ma kluczowe znaczenie dla określenia związku między poziomami w surowicy i ranie pooperacyjnej, zrozumienia złożonego związku między uwalnianiem mediatora a bólem chirurgicznym oraz oceny wpływu podawania leków zarówno ogólnoustrojowych, jak i obwodowych na biochemię rany chirurgicznej. Badania koncentrowały się na ogólnoustrojowych pomiarach mediatorów biochemicznych i nie uwzględniały uwalniania specyficznego dla danego miejsca. 5,6 Pomiary cytokin i chemokin w surowicy mogą nie odzwierciedlać miejscowych zdarzeń biochemicznych związanych z raną pooperacyjną, a jedynie wskazywać na globalną odpowiedź ogólnoustrojową na uraz chirurgiczny. Ten artykuł zawiera szczegółowy i unikalny wizualny opis tej metodologii, do której po raz pierwszy odniesiono się w 2008 roku w Journal of Pain. 1 Celem tego artykułu JoVE jest dostarczenie unikalnego i wizualnie ulepszonego opisu metod.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Protokół badania

  • Uzyskanie zgody Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej i pisemnej świadomej zgody.
  • Należy wybrać odpowiednią populację chirurgiczną do przeprowadzenia badania. Ta metodologia została zastosowana tylko do ran porodowych po cesarskim cięciu, ale większość ran chirurgicznych byłaby odpowiednia.
  • Należy wziąć pod uwagę kryteria włączenia i wykluczenia udziału w badaniu. Pacjenci i zabiegi z wysokim wskaźnikiem zakażeń ran chirurgicznych mogą nie być odpowiednie.
  • Standaryzacja znieczulenia i postępowania pooperacyjnego dla wszystkich pacjentów, aby uniknąć potencjalnych czynników zakłócających.

2. Kolekcja nocyceptywnych i zapalnych mediatorów biochemicznych

  • Wprowadzić ON-Q PainBuster z ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) do warstwy podskórnej tuż przed zamknięciem rany (można rozważyć inne warstwy tkanki). System przeciwbólowy ON-Q PainBuster w sposób ciągły dostarcza zwykłą sól fizjologiczną z szybkością 2 ml/h. Nosicielstwo można łączyć lub porównywać z lekami będącymi przedmiotem zainteresowania, takimi jak znieczulenie miejscowe i niesteroidowe leki przeciwzapalne.
  • Do tego systemu należy włączyć standardowy trójdrogowy kran odcinający, aby umożliwić aspirację wysięku z rany w określonych punktach czasowych. Ciągły wlew zapobiega krzepnięciu cewnika i poprawia niezawodność systemu w wytwarzaniu próbek wysięku. Jeśli aspiracja wysięku jest utrudniona (około 5% przypadków), rozważ delikatne przesunięcie się nad ranę, zmianę pozycji pacjenta (np. ułożenie pacjenta w pozycji pionowej lub płasko), użycie 0,5-1 ml zwykłego płukania solą fizjologiczną lub wycofanie cewnika na 1-2 cm.
  • W punktach czasowych określonych w protokole (np. 1, 4, 6, 24 i 48 godzin po cesarskim cięciu) należy odessać i pobrać 1 ml wysięku z rany. Przenieś wysięk do polietylenowego kubka zawierającego 30 μl inhibitora proteinazy. Do naszych celów użyliśmy Complete Proteinase Inhibitor (Roche Bioscience, Palo Alto, CA).
  • W tym samym czasie, w odstępach czasu określonych w protokole badania, należy pobrać 10 ml krwi. Użyliśmy probówki do pobierania krwi zawierającej heparynę litową; W naszej placówce jest to szklana rurka z zielonym nasadą. Dodać dodatkowe 300 μl inhibitora proteinazy do próbek krwi.
  • W ciągu 1 godziny od pobrania umieścić próbki na lodzie i odwirować z prędkością 3 000 obr./min przez 10 minut.
  • Usunąć surowicę i supernację z rany, umieścić w standardowej probówce do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Analiza testu

  • Po zebraniu i przechowywaniu wszystkich próbek wysięku i surowicy z badania, należy rozmrozić i przeanalizować próbki w tym samym czasie.
  • Zmierzyliśmy cytokiny i chemokiny za pomocą multipleksowego testu immunologicznego. Technika multipleksowego testu immunologicznego pozwala nam na oznaczanie wielu analitów z próbek o małej objętości (50 μl). Multipleks daje wyniki porównywalne z wynikami uzyskanymi za pomocą testu ELISA. Do naszej analizy wykorzystaliśmy system 17-plex Bio-PlexTM (BioRad, Hercules, CA). Test ten jest w stanie zmierzyć czynnik martwicy nowotworu α (TNFα), interferon α (INFα), interleukina 1β (IL-1β), interleukina 2 (IL-2), interleukina 4 (IL-4), interleukina 5 (IL-5), interleukina 6 (IL-6), interleukina 7 (IL-7), interleukina 8 (IL-8), interleukina (IL-10), interleukina 12 (IL-12), interleukina 13 (IL-13), interleukina 17 (IL-17), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), białko chemoatraktantu monocytów 1 (MCP-1) i białko zapalne makrofagów 1 (MIP-1β). Czynnik wzrostu nerwów mierzono za pomocą przeciwciała NGF DY256, dodając go do płytki 17-plex za pomocą zestawu sprzęgającego aminy Bio-Plex.
  • Aby zapewnić dobrą jakość analizy, każdy pomiar powinien być wykonany w dwóch egzemplarzach. Krzywe wzorcowe dla każdego analitu są generowane przy użyciu analitów referencyjnych dostarczonych przez producenta (przy stężeniach 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3,200 pg/ml plus wzorzec zerowy dla normalnej soli fizjologicznej). Standardowe krzywe są uwzględniane w każdym przebiegu, a stężenia próbek są obliczane za pomocą oprogramowania Bio-Plex Manager.
  • Substancję P i prostaglandynę E2 mierzono za pomocą zestawów ELISA o wysokiej czułości. Do tej analizy wykorzystaliśmy Assay Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan). Wykonaj analizę w dwóch egzemplarzach zgodnie ze specyfikacją producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując tę metodologię, byliśmy w stanie wykryć wszystkie opisane powyżej mediatory biochemiczne z wyjątkiem IL-5 w wysięku z rany i w osoczu.1,2 Niektóre dodatkowe cytokiny nie zostały wykryte w osoczu (IL-4, IL-17, TNFα, INFγ, GM-CSF).1 Przebieg czasowy pomiarów cytokin i chemokin w raportowanych badaniach był spójny – osiągnęły one plateau w ciągu pierwszych kilku godzin, które utrzymywało się przez 24-godzinny okres obserwacji.1,2 Jednakże poziom NGF wzrostył stale w ciągu 24-godzinn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana powyżej metodologia okazała się wystarczająco czuła, aby wykryć biochemiczne mediatory stanu zapalnego i nocyceptywnego w wysięku z rany. Pobieranie próbek w różnych punktach czasowych pozwoliło nam również zaobserwować zmiany tych mediatorów w czasie. 1,2 Nie znamy żadnego innego testu na ranę chirurgiczną u ludzi, który mógłby seryjnie mierzyć profil uwalniania mediatorów stanu zapalnego i nocyceptywnego w wysięku z rany operacyjnej. Wyniki naszej metodologii pobierania wysięku z rany z miejsca nacię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca dr Carvalho była wspierana przez grant badawczy z Biura Badań nad Zdrowiem Kobiet oraz Narodowego Instytutu Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka Narodowych Instytutów Zdrowia (5K12 HD043452). Dr Angst otrzymał zaopatrzenie (On-Q PainBuster Post-Op Pain Relief System) i fundusze (na testy biochemiczne) od I-Flow (Lake Forest, Kalifornia).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

  1. Carvalho, B., Clark, D. J., Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. J. Pain. 9, 650-657 (2008).
  2. Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D. C., Angst, M. S. Continuous subcutaneous instillation of bupivacaine compared to saline reduces interleukin 10 and increases substance P in surgical wounds after cesarean delivery. Anesth. Analg. 111, 1452-1459 (2010).
  3. Verri, W. A., Cunha, T. M., Parada, C. A., Poole, S., Cunha, F. Q., Ferreira, S. H. Hypernociceptive role of cytokines and chemokines: targets for analgesic drug development. Pharmacol. Ther. 112, 116-138 (2006).
  4. Watkins, L. R., Maier, S. F. Immune regulation of central nervous system functions: from sickness responses to pathological pain. J. Intern. Med. 257, 139-155 (2005).
  5. Beilin, B., Bessler, H., Mayburd, E., Smirnov, G., Dekel, A., Yardeni, I., Shavit, Y. Effects of preemptive analgesia on pain and cytokine production in the postoperative period. Anesthesiology. 98, 151-155 (2003).
  6. Wu, C. T., Jao, S. W., Borel, C. O., Yeh, C. C., Li, C. Y., Lu, C. H., Wong, C. S. The effect of epidural clonidine on perioperative cytokine response, postoperative pain, and bowel function in patients undergoing colorectal surgery. Anesth. Analg. 99, 502-509 (2004).
  7. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2006).
  8. Kristiansson, M., Soop, M., Sundqvist, K. G., Soop, A., Suontaka, A. M., Blomback, M. Local vs. systemic immune and haemostatic response to hip arthroplasty. Eur. J. Anaesthesiol. 15, 260-270 (1998).
  9. Liu, S. S., Richman, J. M., Thirlby, R. C., Wu, C. L. Efficacy of continuous wound catheters delivering local anesthetic for postoperative analgesia: a quantitative and qualitative systematic review of randomized controlled trials. J. Am. Coll. Surg. 203, 914-932 (2006).
  10. Eriksson, A. S., Sinclair, R., Cassuto, J., Thomsen, P. Influence of lidocaine on leukocyte function in the surgical wound. Anesthesiology. 77, 74-78 (1992).
  11. Clark, J. D., Shi, X., Li, X., Qiao, Y., Liang, D., Angst, M. S., Yeomans, D. C. Morphine reduces local cytokine expression and neutrophil infiltration after incision. Mol. Pain. 3, 28(2007).
  12. Webb, S. T., Ghosh, S. Intra-articular bupivacaine: potentially chondrotoxic. Br. J. Anaesth. 102, 439-441 (2009).
  13. Scott, N. B. Wound infiltration for surgery. Anaesthesia. 65, Suppl . 1. 67(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pobieranie wysi ku z ranyanaliza mediator w biochemicznychpobieranie wymaz w z rany chirurgicznejsystem On Q Pain Busterpomiar cytokinczynnik wzrostu nerw wprostaglandyna E2substancja Pdetekcja IL 6analiza TNF alfa
Zbieranie i pomiar biochemicznych mediatorów wysięku z rany w ranach chirurgicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.