Identyfikacja insercji transpozonów Śpiącej Królewny w guzach litych za pomocą PCR za pośrednictwem łącznikera

Podsumowanie

Opisano metodę identyfikacji nieznanych czynników powodujących kancerogenezę przy użyciu bezstronnego podejścia. Metoda wykorzystuje transpozon Śpiącej Królewny jako losowy mutagen skierowany do określonych tkanek. Mapowanie genomowe insercji transpozonów, które napędzają powstawanie nowotworów, identyfikuje nowe onkogeny i geny supresorowe nowotworów

Streszczenie

Analizy genomiczne, proteomiczne, transkryptomiczne i epigenomiczne ludzkich nowotworów wskazują, że w każdym genomie nowotworu występują tysiące anomalii w porównaniu z dopasowaną normalną tkanką. Na podstawie tych analiz oczywiste jest, że istnieje wiele nieodkrytych genetycznych czynników powodujących raka¹. Niestety, czynniki te są ukryte w znacznie większej liczbie anomalii pasażerów w genomie, które nie przyczyniają się bezpośrednio do powstawania nowotworu. Innym aspektem genomu raka jest to, że istnieje znaczna heterogeniczność genetyczna w podobnych typach nowotworów. Każdy guz może zawierać różne mutacje, które zapewniają selektywną przewagę w tworzeniu guza². Przeprowadzenie bezstronnego badania genetycznego u myszy dostarcza narzędzi do generowania guzów i analizy ich składu genetycznego, przy jednoczesnym zmniejszeniu tła mutacji pasażerów. System transpozonów Śpiącej Królewny (SB) jest jedną z takich metod³. System SB wykorzystuje wektory ruchome (transpozony), które mogą być wprowadzane do całego genomu przez enzym transpozazy. Mutacje są ograniczone do określonego typu komórki poprzez zastosowanie warunkowego allelu transpozazy, który jest aktywowany przez rekombinazę Cre. Istnieje wiele linii myszy, które wyrażają rekombinazę Cre w określonych tkankach. Poprzez przekroczenie jednej z tych linii do warunkowego allelu transpozazy (np. Lox-stop-Lox-SB11), układ SB jest aktywowany tylko w komórkach, które wyrażają rekombinazę Cre. Rekombinaza Cre wytnie kasetę zatrzymania, która blokuje ekspresję allelu transpozazy, aktywując w ten sposób mutagenezę transpozonów w obrębie wyznaczonego typu komórki. Badanie przesiewowe SB jest inicjowane przez hodowlę trzech szczepów myszy transgenicznych, tak aby myszy eksperymentalne były nosicielami warunkowego allelu transpozazy, konkatameru transpozonów i specyficznego tkankowo allelu rekombinazy Cre. Myszom tym pozwala się starzeć, dopóki nie utworzą się guzy i nie staną się w stanie agonalnym. Myszy są następnie poddawane sekcji zwłok, a genomowe DNA jest izolowane z guzów. Następnie genomowe DNA poddaje się procesowi PCR Z POŚREDNICTWEM ŁĄCZNIKA (LM-PCR), w wyniku którego dochodzi do amplifikacji loci genomowych zawierających transpozon SB. LM-PCR przeprowadzony na pojedynczym guzie spowoduje powstanie setek odrębnych amplikonów reprezentujących setki loci genomowych zawierających inserpozycje transpozonów w pojedynczym guzie⁴. Insercje transpozonów we wszystkich nowotworach są analizowane, a wspólne miejsca insercji (CIS) są identyfikowane przy użyciu odpowiedniej metody statystycznej⁵. Geny w WNP z dużym prawdopodobieństwem są onkogenami lub genami supresorowymi nowotworów i są uważane za geny kandydujące na raka. Zalety stosowania systemu SB do identyfikacji genów kandydujących na raka to: 1) transpozon można łatwo zlokalizować w genomie, ponieważ jego sekwencja jest znana, 2) transpozycja może być skierowana do prawie każdego typu komórki oraz 3) transpozon jest zdolny do wprowadzania mutacji zarówno zyskujących, jak i tracących funkcję⁶. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób opracować i przeprowadzić przesiewowe badanie genetyczne przy użyciu systemu transpozonów SB w celu identyfikacji potencjalnych genów raka (ryc. 1).

Protokół

1. Hodowla i starzenie się zwierząt transgenicznych

1. Wybierz szczepy myszy transgenicznych odpowiednie do swojego eksperymentu. W typowym eksperymencie wykorzystane zostaną trzy linie transgeniczne; mysz z warunkową transpozazą, mysz z konkatamerem transpozonów i mysz wykazująca ekspresję rekombinazy Cre w komórkach uważanych za komórki pochodzenia pożądanego nowotworu. Jeśli modelowany nowotwór ma znaną mutację u dużego odsetka pacjentów, pożądane może być uwzględnienie tej mutacji na początku. Przykładami tych "predysponujących" mutacji są aktywowany Kras, dominujący ujemny Tp53 lub floksowany allel Pten. Dodając mutację predysponującą, model może lepiej reprezentować ludzki nowotwór (patrz 1.3). Kilka myszy transpozazowych i transpozonów Śpiącej Królewny jest dostępnych w repozytorium myszy National Cancer Institute (http://mouse.ncifcrf.gov/).
2. Hoduj myszy z warunkową transpozazą z myszami zawierającymi transpozony, aby ostatecznie uzyskać myszy homozygotyczne pod względem obu alleli, jeśli to możliwe. Wyhoduj homozygotyczne potomstwo z myszami wykazującymi ekspresję rekombinazy Cre, aby wygenerować potrójne transgeniczne myszy eksperymentalne (ryc. 2). Uwaga: Uzyskanie myszy homozygotycznych nie zawsze jest możliwe lub idealne. Na przykład homozygotyczne myszy z dominacją p53 są znacznie trudniejsze do rozmnażania niż myszy heterozygotyczne. Ponadto pomocne jest upewnienie się, że mioty są zgodne z genetyką mendlowską, aby potwierdzić, że schemat hodowlany jest udany.
3. Jeśli używasz predysponowanego tła, najpierw wyhoduj myszy z transpozazą z myszami z predysponującym allelem. Jednocześnie hoduj myszy wykazujące ekspresję rekombinazy Cre z myszami przenoszącymi transpozony. Jeśli to możliwe, stwórz myszy homozygotyczne dla każdego allelu. Na koniec wyhoduj homozygotyczne potomstwo z poprzednich dwóch schematów hodowlanych, aby wygenerować poczwórne transgeniczne zwierzęta doświadczalne.
4. Oprócz zwierząt doświadczalnych należy wygenerować kohorty kontrolne myszy. Grupa kontrolna zwykle składa się z rodzeństwa z miotu z hodowli eksperymentalnej, które dziedziczą tylko dwa z trzech alleli (ryc. 2). W przypadku predysponowanego tła konieczne będą również myszy zawierające trzy z czterech alleli.
5. Codziennie monitoruj myszy eksperymentalne i kontrolne pod kątem rozwoju guza i/lub umierania. Postępuj zgodnie z wymaganiami instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC) w zakresie hodowli zwierząt. Typowe jest również określenie wieku, w którym złoży się zwierzę w ofierze, jeśli jeszcze nie stało się w stanie agonalnym. Osiemnaście miesięcy to typowy wiek, w którym myszy są poddawane eutanazji.

2. Sekcja zwłok zwierząt transgenicznych

Nazwa odczynnika firma Numer katalogowy Komora indukcyjna Sure-Seal Drzewo mózgu Naukowe EZ-177 Kriowialny Ekspres biologiczny Silnik C-3355-2 10% buforowana formalina Sigma Aldrich HT501128-4L

Tabela 1. Wymagane odczynniki.

1. Kiedy mysz jest w stanie agonalnym lub osiągnęła koniec ustalonego okresu życia, należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą komory CO₂ zgodnie z wytycznymi IACUC. Ogólnie rzecz biorąc, umieść zwierzę w komorze czystego gazu, otwórz zbiornik gazu i wyreguluj regulator tak, aby wskazywał nie więcej niż 5 funtów na cal kwadratowy. Napełniaj powoli, aby zminimalizować podrażnienie nosa i oczu oraz niechęć do CO₂ . Upewnij się, że serce zwierzęcia już nie bije i nie reaguje na dotyk w oko.
2. Spryskaj zewnętrzną część poświęconej myszy 70% etanolem.
3. Umieść mysz na tablicy do sekcji zwłok i zabezpiecz szpilkami preparacyjnymi. Użyj nożyczek i pęsety, aby otworzyć mysz i usunąć narządy. Określenie, które narządy powinny zostać pobrane, zależy od projektu. Zaleca się jednak, aby zawsze zbierać śledzionę i wątrobę, ponieważ narządy te często dają ważny wgląd w to, dlaczego mysz była w stanie agonalnym. Zbierz również mostek do potencjalnej analizy szpiku kostnego. Ponadto zawsze korzystne jest pobranie wszelkich narządów lub tkanek, które wydają się nieprawidłowe.
4. Tkanki i guzy, które są pobierane, należy podzielić na cztery sekcje. Jedna sekcja jest utrwalana w 10% buforowanej formalinie przez 18 godzin, a następnie 70% etanolu. Ta sekcja może być używana do barwienia H&E i/lub IHC. Pozostałe trzy sekcje, które mają zwykle wielkość od 50 do 100 mg, są zamrażane w ciekłym azocie. Można je wykorzystać do izolacji DNA, RNA i białek.
5. Tuszę i pozostałe tkanki należy usunąć zgodnie z wytycznymi IACUC.

3. Izolowanie genomowego DNA z nowotworów

Nazwa odczynnika firma Numer katalogowy Roztwór do wytrącania białek Qiagen powiedział: Numer katalogowy: 158910 Bufor do lizy komórek Qiagen powiedział: 158906 Proteinaza K Qiagen powiedział: Numer katalogowy: 158920 RNaza A Qiagen powiedział: 158924 Bufor TE Preparat Promega Zobacz materiał V6232

Tabela 2. Wymagane odczynniki.

1. Drobno zmielić zamrożoną próbkę guza (50 do 100 mg) za pomocą czystej żyletki.
2. Umieścić tkankę mieloną w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i dodać 1 ml buforu do lizy komórek zawierającego 5 μl roztworu proteinazy K (20 mg/ml).
3. Dokładnie wymieszaj.
4. Inkubować w wytrząsarce o temperaturze 55 °C ustawionej na 250 obr./min przez co najmniej 4 godziny, najlepiej przez noc.
5. Dodać 1 μl roztworu RNazy A (10 mg/ml) i odwrócić probówkę 25 razy.
6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
7. Schłodzić do temperatury pokojowej, umieszczając na lodzie na 3 minuty.
8. Dodać 333 μl roztworu do wytrącania białek i energicznie wirować.
9. Wirować z prędkością 14 000 obr./min 10 min. Białka powinny się osadzać. Jeśli osad jest bardzo mały, ponownie przeprowadź wir, inkubuj na lodzie przez 5 minut, a następnie ponownie odwiruj.
10. Odlać supernatant zawierający DNA do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
11. Dodaj równą objętość 100% izopropanolu i wymieszaj, delikatnie odwracając 50 razy.
12. Wirować z prędkością 3 500 obr./min przez 3 min.
13. Odrzucić supernatant.
14. Dodaj 1 ml 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć probówkę, aby umyć osad.
15. Przenieś umyty granulat wraz z etanolem do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
16. Wirować z prędkością 14 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
17. Odlej etanol i odwróć rurkę do wyschnięcia na powietrzu (około 5 do 30 minut).
18. Zawiesić osad DNA w 50 do 500 μl TE, w zależności od wielkości osadu DNA.
19. Fakultatywna inkubacja w temperaturze 37 °C w celu ponownego zawieszenia DNA.
20. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do długotrwałego przechowywania.

4. PCR za pośrednictwem łącznika z wykorzystaniem genomowego DNA z nowotworów

Nazwa odczynnika firma Numer katalogowy BfaI powiedział: Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii Przekaźnik R0568S Liga NlaIII Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii Czynnik R0125S Płytki 96-dołkowe MinElute Qiagen powiedział: Numer katalogowy 28051 QIAvac 96 Kolektor próżniowy Qiagen powiedział: Rocznik 19504 Multi-MicroPlate Genie, 120V Przemysł naukowy, Inc. SI-4000 powiedział: Ligaza DNA T4 z 5-krotnym buforem ligacyjnym Invitrogen Numer katalogowy: 15224-041 BamHI powiedział: Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii Czynnik R0136S 25 mM dNTP Ekspres biologiczny Silnik C-5014-200 Platynowy Taq Invitrogen Numer katalogowy: 10966-034 Polimeraza DNA FastStart Taq Roche 12032929001 Agarozy Preparat Promega Zobacz materiał V3121 Bufor TAE Preparat Promega Zobacz materiał V4271 Bufor TE Preparat Promega Zobacz materiał V6232 Bromek etydyny Preparat Promega Zobacz materiał H5041

Tabela 3. Wymagane odczynniki.

Sekwencje linkera

Łącznik BfaI + 5' GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3'

Łącznik BfaI- 5' Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3'NH2

Łącznik NlaIII+ 5'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGATG 3'

Łącznik NlaIII- 5' Phos-GTCCCTTAAGCGGAGCC 3'

Sekwencje starterów

Primary PCR forward right side (NlaIII): Spl IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTCTCGAAATGTTTGACCC

Primary PCR forward left side (BfaI): Spl IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC

Główny odwrócony PCR zarówno dla prawej, jak i lewej strony: Spl Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC

Wtórny prawy PCR do przodu: Przykład wtórnego startera Illumina z kodem kreskowym 5' AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACACGACCCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttccgacttcaa (N reprezentują kod kreskowy 12 pz, sekwencja pisana wielkimi literami jest wymagana dla platformy Illumina, a sekwencja pisana małymi literami wiąże się z transpozonem.)

Wtórny PCR z przodu po lewej stronie: Przykład wtórnego startera Illumina z kodem kreskowym 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAAgtgtatgtaaacttccgacttcaa (N reprezentują kod kreskowy 12 pz, sekwencja pisana wielkimi literami jest wymagana dla platformy Illumina, a sekwencja pisana małymi literami wiąże się z transpozonem.)

Wtórny odwrócony PCR zarówno dla prawej, jak i lewej strony: linker zagnieżdżony odwrotny starter 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC

1. Wyżarzać łączniki + i - zarówno dla łączników BfaI, jak i łączników NlaII, mieszając 50 μl łącznika+ (100 μM) z 50 μl łącznika- (100 μM) i dodając 2 μl NaCl (5 M) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umieść w bloku grzewczym o temperaturze 95 ° C na 5 min. Wyłącz blok grzewczy i pozwól powoli ostygnąć do temperatury pokojowej (trwa to godzinę lub dłużej). Po schłodzeniu, wyżarzane łączniki można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
2. Przygotuj dwie porcje DNA guza, z których każda zawiera 1 μg DNA. Jedna porcja zostanie strawiona przez enzym restrykcyjny, który przetnie się blisko "prawego" końca transpozonu. Druga porcja zostanie strawiona przez enzym restrykcyjny, który przecina blisko "lewego" końca transpozonu. Ma to na celu maksymalizację szans na wzmocnienie każdego miejsca wprowadzenia transpozonu.
3. Trawić DNA guza w jednej podwielokrotności za pomocą enzymu "po prawej" stronie NlaII i trawić DNA guza w drugiej podwielokrotności za pomocą enzymu "po lewej" stronie BfaI: połączyć 1 μl enzymu, 5 μl 10x bufor NEB #4, DNA (1 μg) i ddH₂O do całkowitej objętości 50 μl. Trawić DNA przez noc w temperaturze 37 ° C w łaźni wodnej lub inkubatorze.
4. Ogrzewać enzymy dezaktywujące (BfaI = 80 °C przez 20 min, NlaIII = 65 °C przez 20 min).
5. Oczyścić strawione próbki, umieszczając je w płytce MinElute 96 dołków, umieścić płytkę w kolektorze próżniowym i odkurzać przez około 15 minut, aż studzienki będą wyglądać na suche.
6. Wyjmij płytkę z kolektora próżniowego i osusz dno płytki 96-dołkowej ręcznikiem papierowym, aby usunąć cały płyn
7. Dodać 30 μl ddH₂O do każdego dołka i wstrząsnąć na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na wysokim poziomie przez 2 minuty lub pipetować w górę i w dół 20 do 40 razy.
8. Przenieść całą objętość do studzienek (30 μl) z płytki MinElute 96-dołkowej do czystych płytek 96-dołkowych.
9. Wykonaj reakcje ligacji łączników z strawionym DNA z kroku 4.8 i łącznikami z kroku 4.1. Wymieszać 10 μl strawionego DNA, 4 μl 5x buforu ligacyjnego, 5,5 μl wyżarzonych łączników (950 μg/μl), 0,5 μl ligazy T4 (5 U/μl).
10. Inkubować przez 4 godziny do nocy w temperaturze 16 °C.
11. Podgrzewać inaktywację ligazy DNA T4 w temperaturze 65 °C przez 10 min.
12. Oczyść ligację za pomocą płytek MinElute 96 dołków i kolektora próżniowego, jak opisano w krokach 4.5 - 4.6.
13. Zawiesić ponownie w 30 μl H₂O i przenieść na czystą płytkę 96-dołkową.
14. Wykonaj drugie trawienie DNA w celu zniszczenia pozostałych transpozonów konkatameru. Osiąga się to poprzez przecięcie DNA po raz drugi za pomocą enzymu, który przecina wektor plazmidowy DNA, który został użyty do stworzenia transgenicznych myszy zawierających konkatamer transpozonowy.
15. Trawienie DNA za pomocą BamHI (zarówno po lewej, jak i po prawej stronie): Wymieszaj 25 μl DNA ligowanego łącznikiem z kroku 4.13, 5 μl 10x bufor NEB #3, 0,5 μl BamHI (20 U/μl), 0,5 μl BSA (10 mg/ml) i 19 μl ddH₂O.
16. Trawić 3-6 godzin lub przez noc w temperaturze 37 °C.
17. Wykonaj pierwotną PCR przy użyciu startera specyficznego dla transpozonu i startera specyficznego dla łącznika. Będą się one różnić w zależności od używanego transpozonu i konsolidatora. Startery wymienione w powyższej tabeli starterów działają dla transpozonów T2/Onc i T2/Onc2.
18. Primary PCR: 5 μl 10x bufor, 2,0 μl MgCl2 (50 mM), 4 μl dNTPs (2,5 nM), 1 μl Primer 1 (20 μM), 1 μl Primer 2 (20 μM), 0,25 μl Platinum Taq (5 U/μl), 3 μl Strawione DNA z łącznikami (ilość może się różnić), do 50 μl ddH₂O.
19. Program PCR: 94 °C przez 5 min, 30 cykli 94 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 90 sekund. Końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min.
20. Oczyść produkt PCR za pomocą 96-dołkowych płytek MinElute i kolektora próżniowego, jak opisano powyżej.
21. Zawiesić ponownie w 30 μl H₂O i przenieść na czystą płytkę 96-dołkową.
22. Wykonać rozcieńczenie 1 ° PCR w stosunku 1:75, rozcieńczając 2 μl DNA z kroku 4.21 do 148 μl ddH₂O
23. Wykonaj wtórny PCR przy użyciu zagnieżdżonych wersji starterów, które mają również wymaganą sekwencję dla maszyny Illumina GAIIx, a także kod kreskowy z 12 parami zasad, który jest unikalny dla każdej przetwarzanej próbki guza (patrz tabela starterów powyżej, aby zapoznać się z przykładami tych starterów).
24. Wtórny PCR: 10 μl 10x bufor z MgCl2, 8 μl dNTP (2,5 mM), 1 μl wtórnego startera Illumina z kodem kreskowym (20 μM), 1 μl startera wtórnego Illumina Nest 1 (20 μM), 0,25 μl FastStart Taq (5 U/μl), 2 μl DNA z pierwotnego PCR rozcieńczone 1:75, do 100 μl ddH₂O.
25. Program PCR: 94 °C przez 2 min, 30 cykli po 94 °C przez 30 sekund, 53 °C przez 45 sekund, 72 °C przez 90 sekund. Końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min.
26. Przeprowadzić 45 μl tej reakcji PCR na 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny (0,5 μg/ml). Powinien być "rozmaz" produktów PCR reprezentujących amplikony wielu różnych insercji transpozonów w guzie (ryc. 3).
27. Oczyść pozostałe 50 μl produktu PCR za pomocą 96-dołkowych płytek MinElute i kolektora próżniowego, jak opisano powyżej. Umyć jeden raz, umieszczając 50 μl ddH₂O w studzienkach i ponownie odkurzając.
28. Zawiesić ponownie w 30 μl TE i przenieść na czystą płytkę 96-dołkową.
29. Określić stężenie DNA w każdej próbce. Połącz równe ilości DNA w jednej probówce o pojemności 1,5 ml do mikrofuge. Będzie to biblioteka, która jest sekwencjonowana w jednym pasie maszyny Illumina HiSeq 2000. Możliwe jest sekwencjonowanie kilkuset guzów na jednym pasie biegu Illumina.
30. Prześlij pojedynczą probówkę zawierającą równe ilości DNA ze wszystkich guzów do sekwencjonowania. Może to być zrobione przez Twoją instytucję lub komercyjnie.

5. Analiza insercji transpozonów

1. Oprogramowanie do analizy danych dotyczących wstawiania transpozonów jest dostępne do bezpłatnego pobrania za pośrednictwem SourceForge (http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/). Program o nazwie TapDance wymaga pliku sekwencji z platformy Illumina oraz pliku tekstowego z kodem kreskowym do biblioteki mapy.

Wyniki

Po ustaleniu schematu hodowlanego, hodowcy powinni produkować miot co 19-21 dni. Wielkość miotu waha się od 5 do 12 szczeniąt, w zależności od wieku hodowców i tła genetycznego. Ponadto upewnij się, że genotyp miotu jest zgodny z genetyką mendlowską, aby potwierdzić, że schemat hodowlany jest zarówno poprawny, jak i udany.

Aby eksperyment zakończył się sukcesem, częstość występowania nowotworów u zwierząt doświadczalnych powinna być znacznie większa niż częstość występowania nowotworów u zwie...

Dyskusja

Przesiewowe badanie genetyczne z wykorzystaniem systemu transpozonów Śpiącej Królewny zapewnia metodę identyfikacji mutacji powodujących raka. Wybierając odpowiedni promotor do kontrolowania rekombinazy Cre oprócz wszelkich mutacji predysponujących, badanie przesiewowe SB pozwoli zidentyfikować znane i nowe geny kandydujące na raka.

Sukces ekranu SB zależy w dużej mierze od myszy wybranych do stworzenia ekranu. Do transpozonu zalecamy użycie dwóch różnych szczepów myszy prze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komora indukcyjna Sure-Seal	Brain Tree Scientific	EZ-177
Cryovial	Bioexpress	C-3355-2
10% buforowana formalina	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Roztwór do wytrącania białek	Qiagen	158910
Bufor do lizy komórek	Qiagen	158906
Proteinaza K	Qiagen	158920
RNaza A	Qiagen	158924
TE Buffer	Promega	V6232
BfaI	New England Biolabs	R0568S
NlaIII	New England Biolabs	R0125S
MinElute 96 dołków	Qiagen	28051
QIAvac 96 Kolektor próżniowy	Qiagen	19504
Multi-MicroPlate Genie, 120V	Scientific Industries, Inc.	SI-4000
Ligaza DNA T4 z 5-krotnym buforem ligacyjnym	Invitrogen	15224-041
BamHI	New England Biolabs	R0136S
25mM dNTPs	Bioexpress	C-5014-200
Platinum Taq	Invitrogen	10966-034
FastStart Taq DNA Polimeraza Roche		12032929001
Agaroza	Bufor Promega	V3121
TAE	Bufor Promega	V4271
TE Bufor	Promega	V6232
Bromek etydyny	Promega	H5041