Artykuł metodologiczny

Ustanowienie pokrytej cieczą hodowli spolaryzowanych ludzkich komórek nabłonka nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w celu zbadania odpowiedzi komórek gospodarza na patogeny układu oddechowego in vitro

23.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50157

⸱

7 lutego 2013

 , 
1National Center for Immunization and Respiratory Diseases, Division of Viral Diseases, Gastroenteritis and Respiratory Viruses Laboratory Branch, Centers for Disease Control and Prevention (CDC)

W tym artykule

Podsumowanie

Wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Streszczenie

Wierzchołkowe i podstawno-boczne powierzchnie komórek nabłonka dróg oddechowych wykazują kierunkowe reakcje na ekspozycję na patogeny in vivo. W ten sposób idealne modele in vitro do badania odpowiedzi komórkowych na patogeny układu oddechowego polaryzują się, tworząc powierzchnie wierzchołkowe i podstawno-boczne. Jednym z takich modeli są zróżnicowane normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE). Jednak system ten wymaga próbek tkanki płucnej, wiedzy specjalistycznej w izolowaniu i hodowli komórek nabłonka z tkanek oraz czasu na wygenerowanie kultury granicy faz powietrze-ciecz.

Komórki Calu-3, pochodzące z ludzkiego gruczolakoraka oskrzeli, są alternatywnym modelem do badania odpowiedzi komórek nabłonka proksymalnych dróg oddechowych na urazę układu oddechowego1, związki farmakologiczne2-6 oraz bakteryjne7-9 i patogeny wirusowe, w tym wirus grypy, rinowirus i zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej - powiązany koronawirus10-14. Niedawno wykazaliśmy, że komórki Calu-3 są podatne na zakażenie syncytialnym wirusem oddechowym (RSV) w sposób zgodny z NHBE15,16 . W tym miejscu szczegółowo opisujemy ustanowienie spolaryzowanej, pokrytej cieczą hodowli (LCC) komórek Calu-3, koncentrując się na szczegółach technicznych uprawy i hodowli komórek Calu-3, utrzymania komórek, które zostały wyhodowane w LCC, oraz przedstawiamy metodę przeprowadzania infekcji wirusem układu oddechowego spolaryzowanych komórek Calu-3.

Aby konsekwentnie uzyskiwać spolaryzowane LCC Calu-3, komórki Calu-3 muszą być starannie hodowane przed hodowlą we wkładkach Transwell. Kultury jednowarstwowe Calu-3 powinny pozostawać poniżej 90% konfluencji, powinny być hodowane rzadziej niż 10 razy z zamrożonego materiału i powinny być regularnie zaopatrywane w świeżą pożywkę. Po wyhodowaniu w Transwells, Calu-3 LCC musi być traktowany z ostrożnością. Nieregularne zmiany pożywki oraz mechaniczne lub fizyczne rozerwanie warstw lub płytek komórkowych negatywnie wpływają na polaryzację przez kilka godzin lub dni. Polaryzacja jest monitorowana przez ocenę przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i jest weryfikowana przez ocenę biernej równowagi fluoresceiny sodu między przedziałami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi17,18 . Gdy TEER osiągnie poziom 1000 Ω×cm2 lub wyższy, Calu-3 LCC są gotowe do użycia do badania odpowiedzi komórkowych na patogeny układu oddechowego.

Protokół

1. Hodowla komórek Calu-3 do wykorzystania w hodowlach Transwell

Środki bezpieczeństwa: Wykonuj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając techniki sterylnej hodowli.

  1. Aby rozmrozić komórki z zamrożonego przechowywania:
    1. Przygotuj Minimum Niezbędne Pożywki Eagle's zawierające 20% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,1 mM aminokwasów endogennych, 2 mM L-glutaminy i 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20%+S). Przygotowane podłoże należy sterylnie przefiltrować za pomocą filtra o wielkości porów 0,2 μm i ogrzać w łaźni wodnej do temperatury 37 °C. Aby lepiej odzwierciedlać środowisko nabłonka dróg oddechowych in situ, pożywka nie jest uzupełniana antybiotykami ani lekami przeciwgrzybiczymi.
    2. Szybko (< 1 min) rozmrozić zamrożony kriowial komórek Calu-3 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Przenieś rozmrożone komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 30 ml podgrzanego EMEM-20%+S.
    4. Granulować komórki przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 1 000-1 200 × g, bez chłodzenia i przy niskiej prędkości hamowania.
    5. Delikatnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml ogrzanego EMEM-20%+S, delikatnie pipetując w górę i w dół. Wysiewaj od 2 do 5 × 106 komórek na studzienkę na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i inkubuj w temperaturze 37 °C, 7% CO2 w atmosferze powietrza, aż komórki zlewają się w 75% - 80%. Sprawdzaj codziennie; Może być wymagane do 7 dni. Co 3-4 dni odsysaj pożywkę z komórek i zastępuj ją świeżym EMEM-20%+S.
  2. Do komórek subkulturowych:
    1. Ciepła 0,05% trypsyna - 0,02% EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Odessać pożywkę z komórek i raz umyć komórki podgrzaną 0,05% trypsyną - 0,02% EDTA, aby usunąć nadmiar pożywki i surowicy. Usuń płukanie i dodaj 1 ml podgrzanej trypsyny na studzienkę do komórek.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C i 7% CO2 i monitorować pod mikroskopem co 5 minut, aż co najmniej 75 % komórek oderwie się od studzienki (studzienek) płytki do hodowli tkankowej. Może to potrwać od 5 do 30 minut.
    3. Umyj komórki w EMEM-20%+S, aby usunąć nadmiar trypsyny. Przenieś trypsynizowane komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wiele dołków komórek z jednej 6-dołkowej płytki hodowlanej można połączyć w jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 50 ml. Dodać 30 ml EMEM-20%+S i zagnieździć komórki przez odwirowanie w stężeniu 1,000-1,200 × g, bez chłodzenia i przy niskiej prędkości hamowania.
    4. Delikatnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżym EMEM-20%+S, delikatnie pipetując w górę i w dół. Korzystając z kroków od 1.2.1 do 1.2.3 powyżej, aby trypsynizować komórki, kontynuuj subhodowlę komórek na szalkach do hodowli tkankowej, jak opisano w krokach od 1.2.5 do 1.2.7, gdy zlewają się one w 75 - 80%.
    5. Subhodowla z jednego dołka płytki 6-dołkowej do jednej kolby T-25 cm2 w końcowej objętości 5 ml EMEM-20%+S, wysiewając od 0,5 do 1 × 106 komórek/kolbę.
    6. Używając 5 ml podgrzanej trypsyny na kolbę T-25 cm2 w celu odłączenia komórek, subkulturuj z jednej kolby T-25 cm2 do jednej kolby T-75 cm2 w końcowej objętości 10 ml EMEM-20%+S, wysiewając od 1 do 5 × 106 komórek/kolbę.
    7. Używając 8 ml podgrzanej trypsyny na kolbę T-75 cm2 w celu odłączenia komórek, subkulturuj z jednej kolby T-75 cm2 do 2 kolb T-75 cm2. W celu optymalnego wzrostu komórek nie należy hodować komórek w kolbach większych niż T-75 cm2 lub subkulturach w stosunku większym niż 1 kolba macierzysta: 3 nowe kolby.
  3. Po subhodowli komórek całkowicie usuwaj i wymieniaj pożywkę co 2 do 3 dni, aż osiągną 75-90% konfluencji. Komórki mogą potrzebować do 3 tygodni, aby osiągnąć 75-90% konfluencji. Aby uzyskać optymalne generowanie spolaryzowanych kultur, subkulturuj komórki, zanim osiągną ponad 90% konfluencji, jako monowarstwa.
  4. Kontynuuj subhodowlę komórek, aż wyrośnie wystarczająca liczba komórek, aby zasiać pożądaną liczbę wkładek Transwell. Każda wkładka Transwell wymaga 2 × 105 komórek. Aby uzyskać optymalną wydajność generowania kultur spolaryzowanych, użyj komórek, które przeszły nie więcej niż 10 subkultur.

2. Uprawa spolaryzowanych kultur pokrytych płynem Calu-3 (LCC)

Środki bezpieczeństwa: Wykonuj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając techniki sterylnej hodowli.

  1. Przygotować EMEM zawierający 10% FBS (EMEM-10%) i ogrzać w łaźni wodnej do temperatury 37 °C.
  2. Przygotuj 24-dołkową płytkę Transwell do wysiewu. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś wkładki Transwell z wnętrza do zewnętrznych rzędów płytki bez dotykania membrany wkładki. Komórki powinny być hodowane tylko w studzienkach na zewnętrznych rzędach płytki. Aby zapobiec wprowadzaniu się pęcherzyków powietrza do komór podstawno-bocznych, należy dodać 600 μl EMEM-10% do każdej z nich, ustawiając pipetę pod kątem przy ściance każdej komory i powoli uwalniając pożywkę do studzienki.
  3. Odłącz komórki od tkanki T-75 cm2. Kolby do subkultury przy użyciu podgrzanej trypsyny i przemyć w 30 ml EMEM-20%+S na każde 2 kolby komórek trypsynizowanych, jak opisano w kroku 1.2.
  4. Dokładnie zawiesić umyte komórki w 5 ml EMEM-10%, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  5. Określić żywotną i całkowitą liczbę komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego. Kontynuuj tylko wtedy, gdy 80% - 90% jest wykonalne.
  6. W sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml rozcieńczyć komórki do stężenia 2 × 106 żywotnych komórek/ml za pomocą EMEM-10%.
  7. Dodaj komórki do komory wierzchołkowej każdego Transwella. Do studzienek A1 i D1, które będą studzienkami kontrolnymi bezkomórkowymi, czyli ślepymi próbami, dodaj 100 μl EMEM-10% bez komórek. Do każdej z pozostałych studzienek dodać 100 μl ponownie zawieszonych komórek Calu-3, delikatnie ustawiając pipetę pod kątem względem wewnętrznego kanału prowadzącego ścianki wkładu i powoli uwalniając komórki. Nie dotykaj pipety do membrany wkładu. Aby utrzymać jednorodną zawiesinę komórek Calu-3, delikatnie mieszaj zawiesinę komórkową podczas tego etapu wysiewu.
  8. Inkubować płytkę Transwell w temperaturze 37 °C i 7% CO2 w atmosferze powietrza. Umieścić płytkę w inkubatorze, w którym zakłócenia fizyczne będą minimalne. Aby poprawić wydajność polaryzacji, nie należy układać płytek jedna na drugiej.
  9. Aby utrzymać kultury do czasu polaryzacji i gotowości do użycia w eksperymentach, należy całkowicie zastąpić pożywkę w Transwells, jak opisano w krokach od 2.10 do 2.13 poniżej. Pożywka powinna być całkowicie wymieniona trzy dni po subhodowli do Transwells, a następnie w cyklu na przemian od czwartego do trzeciego dnia po poprzednim karmieniu, aż komórki będą w pełni spolaryzowane.
  10. Ogrzej EMEM-10% w łaźni wodnej do temperatury 37 °C.
  11. Delikatnie zassać podłoże z wkładów Transwell. Za pomocą pipety kapilarnej podłączonej do pułapki próżniowej z delikatnym podciśnieniem lub za pomocą standardowej pipety o pojemności 1 ml, odessać pożywkę z bezkomórkowych studzienek A1 i D1, a następnie z dołków z nasionami, najpierw usuwając pożywkę wierzchołkową ze wszystkich studzienek, a następnie usuwając podłoże podstawno-boczne ze wszystkich studzienek. Nie dotykać membran wkładek podczas zasysania medium.
  12. Dodać 200 μl EMEM-10% do komory wierzchołkowej studzienek bezkomórkowych A1 i D1, a następnie do dołków z nasionami, kierując pożywkę do komory wierzchołkowej, używając boku wkładki do prowadzenia końcówki pipety. Nie dodawaj pożywki bezpośrednio na komórki i nie dotykaj membrany wkładki.
  13. Dodać 600 μl EMEM-10% do komór podstawno-bocznych. Aby zapobiec wprowadzaniu się pęcherzyków powietrza do komór podstawno-bocznych, dodaj pożywkę do każdej z nich, ustawiając pipetę pod kątem przy ściance każdej komory i powoli uwalniając pożywkę do studzienki.

3. Ocena rozwoju odporności Calu-3 LCC

Środki bezpieczeństwa: Wykonuj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając techniki sterylnej hodowli.

  1. Oceń przeznabłonkową rezystancję elektryczną (TEER) Calu-3 LCC 30 min po zmianie podłoża; w razie potrzeby ocenę można przeprowadzić po każdej zmianie podłoża. Wykonuj pomiary w sterylnych warunkach. Rozpocznij pomiary od bezkomórkowych studzienek kontrolnych A1 i D1 (ślepe próby), aby uzyskać pomiary podstawowe, i kontynuuj pomiary dla każdej studzienki.
    1. W sterylnych warunkach przenieś elektrodę STX2 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 70% etanolu w sterylnej wodzie i sterylizuj przez 15 minut.
    2. Skalibruj i przetestuj woltoomomierz pod kątem użytkowania zgodnie ze wskazówkami producenta.
    3. Wyjmij elektrodę z etanolu, wysusz na powietrzu 5-10 sekund i przepłucz elektrodę sterylnym EMEM-10%.
    4. Ustaw przełącznik trybu woltoomomierza na ustawienie REZYSTANCJA i włącz zasilanie.
    5. Delikatnie umieść elektrodę w jednym z 3 portów, które umożliwiają dostęp do podstawno-bocznej komory jednej hodowli Transwell. Umieść elektrodę tak, aby dłuższy przewód tylko lekko dotykał dna zewnętrznej studzienki i pozostawał pionowy, a krótszy przewód znajdował się w pożywce do hodowli tkankowej komory wierzchołkowej, nie dotykając membrany wkładki.
    6. Naciśnij przycisk "Zmierz R" i poczekaj, aż odczyt się ustabilizuje. Powtórz dla pozostałych 2 portów dla każdej studzienki i zapisz pomiary ze wszystkich trzech portów, co daje w sumie trzy pomiary na studzienkę. Kontynuuj pomiar rezystancji dla wszystkich studzienek komórek.
    7. Wyczyść elektrodę, mocząc 5-10 minut w 70% etanolu, spłukując w sterylnymdH2Oi dokładnie wysuszając. Przechowywać w oryginalnym opakowaniu.
    8. Oblicz rezystancję każdej studzienki, korzystając z równania 1.
      Ω rzeczywista = próbka Ω - Ω ślepa , Równanie 1
      gdzie próbka Ω jest średnim pomiarem z dołka z nasionami, a Ω ślepa próba jest średnim pomiarem z 2 studzienek, A1 i D1, zawierających wstawki i pożywkę, ale bez komórek.
    9. Oblicz jednostkę oporu powierzchniowego, korzystając z równania 2.
      Ω rzeczywista× efektywna powierzchnia membrany = Ω × cm2, równanie 2
      gdzie efektywna powierzchnia membrany wynosi 0,33cm2 dla 24-dołkowych wkładów Transwell.
  2. Sprawdź, czy polaryzacja jest kompletna, wykonując test wtórny, mierzący pasywną dyfuzję fluoresceiny sodu między przedziałami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi, na jednej do trzech kultur Transwell. Studzienki użyte do oznaczania fluoresceiny sodu należy wyrzucić natychmiast po zakończeniu testu.
    1. Przygotować bufor niefluorescencyjny (118 mM NaCl; 4,75 mM KCl; 2,53 mM CaCl2,2H 2O; 2,44 mMMgSO4; 1,19 mM KH2PO4; 25 mMNaHCO3 w sterylnej wodzie; sterylny filtr z urządzeniem filtrującym 0,45 μm). Przygotować fluoresceinę sodu w stężeniu 1 mg/ml w niefluorescencyjnym buforze, sterylnym filtrze, zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej.
    2. Po zakończeniu pomiarów rezystancji ostrożnie usuń pożywkę zarówno z przedziałów podstawno-bocznych, jak i wierzchołkowych od jednej do trzech indywidualnych kultur Transwell.
    3. Płukać kultury Transwell. Delikatnie dodać 600 μl sterylnego PBS (D-PBS) firmy Dulbecco w temperaturze pokojowej do komór podstawno-bocznych i 100 μl sterylnego D-PBS w temperaturze pokojowej do komór wierzchołkowych.
    4. Delikatnie usuń D-PBS ze studzienek. Dodać 600 μl sterylnego buforu niefluorescencyjnego do komór podstawno-bocznych. Dodać 100 μl sterylnej 1 mg/ml fluoresceiny sodu do komór wierzchołkowych.
    5. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. CO2 nie jest wymagany podczas tej inkubacji.
    6. Podczas inkubacji należy przygotować wzorcową krzywą fluoresceiny sodu w zakresie od 20 μg/ml do 0 μg/ml, używając niefluorescencyjnego buforu do rozcieńczenia fluoresceiny sodu. Przygotować co najmniej 8 różnych stężeń fluoresceiny sodu, każde w końcowej objętości co najmniej 600 μl. Rozcieńczenia krzywej wzorcowej należy chronić przed światłem do czasu, gdy będą gotowe do pomiaru absorbancji.
    7. Przenieść niefluorescencyjną próbkę buforową z podstawno-bocznego przedziału każdego testu Transwell do oddzielnej czystej probówki w celu analizy. Usunąć z płytki test Transwells używany do badania biernej dyfuzji fluoresceiny sodu i wyrzucić. Włożyć płytkę z pozostałymi Transwellami do inkubatora.
    8. Umieścić 100 μl każdego roztworu wzorcowego w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
    9. Przygotować trzy rozcieńczenia każdej próbki podstawno-bocznej (1:2, 1:20 i 1:50) w buforze niefluorescencyjnym i dodać 100 μl każdej nierozcieńczonej próbki i każdego rozcieńczenia, dwukrotnie, do 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.
    10. Zmierzyć absorbancję próbki na czytniku płytek ELISA przy długości fali 486 nm lub 490 nm.
    11. Oznaczyć stężenie fluoresceiny sodu w kompartmencie podstawno-bocznym, porównując absorbancję próbek z wartościami absorbancji dla krzywej wzorcowej fluoresceiny sodu.

4. Zakażenie spolaryzowanego Calu-3 LCC wirusem układu oddechowego

Środki bezpieczeństwa: Wykonuj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając techniki sterylnej hodowli, na poziomie bezpieczeństwa biologicznego odpowiednim dla używanego wirusa.

  1. Rozcieńczyć wirusa w EMEM bez surowicy, tak aby pożądana inokulkulacja znajdowała się w 100 μl.
  2. Umyj komórki w EMEM bez surowicy. Delikatnie odessać pożywkę ze wszystkich studzienek, usuwając podłoże wierzchołkowe, a następnie podłoże podstawno-boczne. Za pomocą pipety kapilarnej podłączonej do pułapki próżniowej z delikatnym podciśnieniem lub za pomocą standardowej pipety o pojemności 1 ml odessać pożywkę z bezkomórkowych studzienek A1 i D1, a następnie z dołków z nasionami, najpierw usuwając pożywkę wierzchołkową ze wszystkich studzienek, a następnie usuwając podłoże podstawno-boczne ze wszystkich studzienek. Nie dotykać membran wkładek podczas zasysania medium.
    1. Dodać 100 μl EMEM bez surowicy do komory wierzchołkowej studzienek bezkomórkowych A1 i D1, a następnie do studzienek z nasionami, kierując pożywkę do komory wierzchołkowej za pomocą boku wkładki do prowadzenia końcówki pipety. Nie dodawaj pożywki bezpośrednio na komórki i nie dotykaj membrany wkładki.
    2. Dodać 600 μl EMEM bez surowicy do przegródek podstawno-bocznych. Dodaj pożywkę do każdego Transwell, ustawiając pipetę pod kątem przy ściance komory i powoli uwalniając pożywkę do studzienki.
    3. Delikatnie odessać pożywkę bez surowicy z dołków.
  3. Zaczynając od studni niezainfekowanych lub pozorowanych zainfekowanych, dodaj odpowiednie rozcieńczenia wirusa do komory wierzchołkowej Transwells. Dla studzienek niezakażonych, dodać 100 μl EMEM wolnego od surowicy do komory wierzchołkowej odpowiednich baselitów Transwell, dla studzienek pozorowanych dodać 100 μl preparatu wolnego od wirusów rozcieńczonego w EMEM bez surowicy do komory wierzchołkowej odpowiedniego Transwell, a w przypadku infekcji wirusowej, rozcieńczyć wirusa w EMEM bez surowicy i dodać 100 μl do komór wierzchołkowych odpowiednich Transwells.
  4. Dodać 600 μl EMEM bez surowicy do wszystkich komór podstawno-bocznych.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C i 7% CO2 przez 2 godziny.
  6. Odessać pożywkę ze studni, najpierw z studni niezainfekowanych i pozorowanych, a następnie z zainfekowanych studni. Najpierw usuń supernatanty wierzchołkowe, a następnie supernatanty podstawno-boczne.
  7. Zastąp pożywkę 200 μl EMEM-10% w komorach wierzchołkowych i 600 μl EMEM-10% w komorach podstawno-bocznych.

Wyniki

W przypadku hodowli w formie kultur pokrytych cieczą (LCC) w systemach hodowlanych Transwell, jak zilustrowano na Rysunku 1, komórki Calu-3 ulegają polaryzacji, tworząc wyraźne powierzchnie apikalną i bazolateralną. Zastosowanie opisanej tutaj metody sprawia, że transepitelna oporność elektryczna (TEER) Calu-3 LCC osiąga plateau na poziomie 1 000 Ω×cm2 lub wyżej w ciągu 3 tygodni od wysiania, czego przykład przedstawiono na Rysunku 2. Tight junctions (zczelne połączenia) utworzone między spolaryzowanymi komórkami zapobiegają pasywnej ekwilibracji małych cząsteczek między przedziałem apikalnym a bazolateralnym. W związku z tym, w celu potwierdzenia polaryzacji Calu-3 LCC stosuje się zmodyfikowany test ekwilibracji fluoresceiny sodowej 15,17,18. Wraz ze wzrostem TEER monowarstw komórek Calu-3 w LCC, ilość fluoresceiny, która pasywnie przenika do przedziału bazolateralnego, maleje. Gdy TEER osiągnie wartość 1 000 Ω×cm2, ilość fluoresceiny ekwilibrującej do przedziału bazolateralnego wynosi ≤ 1%, co pokazano na Rysunku 3; zatem Calu-3 LCC uznaje się za w pełni spolaryzowane, gdy TEER wynosi ≥ 1 000 Ω×cm2. Maksymalny pomiar TEER dla Calu-3 LCC może różnić się w zależności od eksperymentu. Jednakże, po osiągnięciu poziomu plateau wartości TEER w danym doświadczeniu, w pełni spolaryzowane, niezakażone Calu-3 LCC mogą pozostawać stabilne od 5 do 12 tygodni po wysianiu. Brak wzrostu oporności w hodowlach Calu-3 w Transwell może być spowodowany kilkoma czynnikami, które wyszczególniono w Tabeli 1. Gdy TEER dla Calu-3 LCC osiągnie plateau na poziomie 1 000 Ω×cm2 lub wyżej, model jest gotowy do badania odpowiedzi komórek nabłonka dróg oddechowych na patogeny układu oddechowego, w tym wirusa RSV (respiratory syncytial virus). Ekspozycja na RSV skutkuje szybszym spadkiem integralności spolaryzowanej hodowli w porównaniu do komórek poddanych infekcji pozorowanej (Rysunek 4).

Schemat wkładki do hodowli komórkowej; przedziały apikalny i bazolateralny; układ błony do badań przepuszczalności.
Rycina 1. Przekrój poprzeczny komórek hodowanych w systemie Transwell. Komórki są hodowane na powierzchni apikalnej membrany wkładki.

Wykres oporu w funkcji dni po wysiewie; analiza danych dotycząca wpływu wzrostu na opór.
Rycina 2. Rozwój transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) i polaryzacja komórek Calu-3 po wysianiu do wkładów Transwell. W każdym punkcie czasowym TEER przedstawiono jako medianę Ω x cm2 ± SEM dla 32 niezależnych studni z jednego reprezentatywnego eksperymentu.

Wykres równowagi statycznej; % przecieku w funkcji oporu; wynik analizy danych w pomiarze elektrycznym.
Rycina 3. Pasywna równowaga fluoresceiny sodowej w przedziale bazolateralnym monowarstw komórek Calu-3 jest hamowana w miarę polaryzacji komórek. Przedstawiono skumulowane dane z czterech niezależnych eksperymentów. Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczy pomiar.

Wykres oporu w funkcji dni po infekcji; RSV-A2 w stosunku do infekcji pozorowanej; analiza trendu.
Rycina 4. Infekcja RSV spolaryzowanych komórek Calu-3 LCC przyspiesza spadek integralności monowarstwy. Spolaryzowane komórki Calu-3 zainfekowano wirusem RSV-A2 przy MOI=1 w dniu 0, a polaryzację monitorowano przez 8 tygodni po infekcji. Przedstawiono jeden reprezentatywny eksperyment. Dane przedstawiono jako medianę oporu z 8 niezależnych studni na infekcję ± SEM dla każdego punktu czasowego. *p<0.05 pomiędzy kulturami z infekcją pozorowaną a zainfekowanymi RSV-A2, wyznaczone za pomocą testu t Studenta.

ProblemRozwiązanie(ia)
Opór nie jest mierzalny
  • Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z dołków
  • Używaj komórek Calu-3, które zostały podpasażowane z zamrożonego banku mniej niż 10 razy
  • Nie dopuszczaj do osiągnięcia przez komórki Calu-3 100% konfluencji w hodowli monowarstwy
  • Sprawdź, czy komórki nie rosną na plastikowym dnie dołka poniżej wkładki (co może wskazywać, że komórki przrosły przez pory wkładki)
  • Odczekaj 2-3 tygodnie po wysianiu do pełnego rozwoju oporu
  • Sprawdź skład i wielkość porów stosowanych wkładek, w razie potrzeby je zmień (zalecana wkładka poliestrowa, wielkość porów 0.3 μm, bez powłok, szczegóły w sekcji materiały)
  • Sprawdź jakość elektrody, delikatnie szlifując końcówkę w celu usunięcia nagromadzonych białek, i w razie potrzeby wymień ją
  • Sprawdź, czy w pożywce nie rozwinął się wzrost bakterii
Opór narasta, ale pełna polaryzacja (≥1,000 Ω×cm2) nie zostaje osiągnięta
  • Odczekaj dodatkowy czas na rozwój polaryzacji (sporadycznie może to zająć do 4 tygodni)
  • Używaj komórek Calu-3, które zostały podpasażowane z zamrożonego banku mniej niż 10 razy
  • Nie dopuszczaj do osiągnięcia przez komórki Calu-3 100% konfluencji w hodowli monowarstwy
  • Regularnie wymieniaj pożywkę w hodowlach Transwell, naprzemiennie w trzecim, a następnie czwartym dniu po poprzednim karmieniu
  • Hoduj komórki wyłącznie na wkładkach umieszczonych w zewnętrznych rzędach płytek
  • Użyj innej partii wkładek Transwell
Komórki są w pełni spolaryzowane, ale opór nie jest spójny między kolejnymi pomiarami
  • Nie przesuwaj i nie układaj płytek w stosy w inkubatorze
  • Unikaj powodowania wibracji w komorze z laminarnym przepływem powietrza podczas pracy z płytkami Transwell
  • Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z dołków
  • Nie naruszaj warstwy komórek końcówkami pipet podczas wymiany pożywek lub pomiarów TEER
  • Używaj 200 μl pożywki w komorze apikalnej; mniejsza objętość może prowadzić do niestabilnych odczytów TEER
  • Sprawdź jakość elektrody, delikatnie szlifując końcówkę w celu usunięcia nagromadzonych białek, i w razie potrzeby wymień ją

Tabela 1. Rozwiązywanie problemów, które mogą wystąpić podczas hodowli komórek Calu-3 w Transwellach. Na pełną polaryzację komórek Calu-3 w hodowlach pokrytych cieczą wpływa wiele czynników, z których najbardziej prawdopodobne zostały wyróżnione w tej tabeli.

Dyskusja

Podczas ustanawiania Calu-3 LCC we wkładkach Transwell, komórki mogą w ogóle nie polaryzować się lub mogą nie być w pełni polaryzowane, zgodnie z definicją TEER ≥ równowagi barwnika fluoresceiny 1,000 Ω×cm2 i ≤ 1% sodu między przedziałami wierzchołkowymi i podstawnymi. Ponadto komórki Calu-3 w LCC mogą być w pełni spolaryzowane, ale TEER może być niespójny między pomiarami. Chociaż wahania w pomiarach TEER Calu-3 LCC są normalne z dnia na dzień, po pełnej polaryzacji nie oczekuje się dramatycznych wahań TEER, dopóki kultura nie zaniknie naturalnie wraz z wiekiem, co może wynosić zaledwie 5 tygodni lub nawet 12 tygodni po wysiewie.

Zdolność Calu-3 LCC do polaryzacji zależy częściowo od tego, w jaki sposób komórki są utrzymywane i subhodowane przed użyciem w systemie Transwell. Komórki, które urosły powyżej 90% konfluencji jako monowarstwa podczas subhodowli, które były subhodowane więcej niż 10 razy z zamrożonego materiału lub które nie były regularnie dostarczane ze świeżą pożywką, mają mniejsze szanse na pełną polaryzację, a każda polaryzacja prawdopodobnie szybko spadnie. Niepełny lub całkowity brak polaryzacji może być również przypisany różnicom w materiale i wielkości porów Transwelli stosowanych do Calu-3 LCC, a zmienność między partiami Transwelli o podobnym składzie i wielkości porów może również wpływać na polaryzację. Większe rozmiary porów mogą pozwolić Calu-3 na przerost przez błonę Transwell do przedziału podstawno-bocznego, zapobiegając polaryzacji kultury. Brak polaryzacji może być również spowodowany wzrostem bakterii, na co wskazuje mętna pożywka hodowlana, co prowadzi do późniejszego rozpadu ścisłych połączeń między komórkami Calu-3.

Zmienne pomiary TEER Calu-3 LCC mogą być spowodowane mechanicznymi zakłóceniami monowarstw ogniw Calu-3 LCC, wkładek lub samych płytek. Zmiany podłoża i pomiary TEER powinny być wykonywane tak, aby końcówki pipet lub przewody elektrod nie stykały się z celami. Podczas wykonywania tych czynności należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do przedziałów wierzchołkowych i podstawno-bocznych, co zakłóci zdolność woltoomomierza do wykrywania oporu. Zdolność woltoomomierza do wykrywania rezystancji w kulturze, która jest faktycznie spolaryzowana, może być również ograniczona przez gromadzenie się białka na przewodach elektrod. Nalot ten można usunąć za pomocą delikatnego szlifowania lub skorygować poprzez wymianę elektrody.

Gdy Calu-3 LCC całkowicie się spolaryzuje, a TEER przestanie rosnąć, Calu-3 LCC są gotowe do użycia jako model in vitro do charakteryzowania odpowiedzi komórek nabłonka płuc gospodarza na infekcję dróg oddechowych. System ten pozwala na lepszą charakterystykę kierunkowych odpowiedzi na patogeny w porównaniu z jednowarstwowymi liniami komórkowymi płuc tradycyjnie stosowanymi do badania patogenów układu oddechowego, takich jak komórki A549 i HEp-2, przy czym dodatkowymi zaletami Calu-3 LCC jest szybszy rozwój, łatwiejszy do uzyskania i tańszy w generowaniu niż pierwotny, spolaryzowany, zróżnicowany NHBE. Podobnie jak NHBE, spolaryzowane Calu-3 wykazują tworzenie ścisłych połączeń i wytwarzają mucyny. Jednak w przeciwieństwie do NHBE, spolaryzowane komórki Calu-3 nie różnicują się w warstwy komórek podstawnych i rzęskowych komórek nabłonka walcowego, a niewiele spolaryzowanych komórek Calu-3 rozwija projekcje podobne do rzęsek19. Tak więc, chociaż przydatne do badania spolaryzowanych odpowiedzi komórek nabłonka dróg oddechowych na urazę układu oddechowego, spolaryzowane Calu-3 LCC nie są idealnym modelem do badania rozwoju lub przebudowy dróg oddechowych w odpowiedzi na uraz lub uraz układu oddechowego. Produkcja śluzu przez hodowane komórki in vitro może wpływać na zakaźność komórkową, a także na uwalnianie zakaźnego wirusa i rozprzestrzenianie się wirusa w modelu spolaryzowanym, a bezpośrednie porównanie produkcji śluzu między spolaryzowanym Calu-3 LCC a spolaryzowanym, zróżnicowanym NHBE nie zostało zgłoszone. Komórki A549 i HEp-2 są łatwiejsze do hodowli niż komórki Calu-3, jednak w przeciwieństwie do Calu-3 LCC, nie tworzą spolaryzowanych kultur podczas hodowli na wkładkach Transwell, a zatem nie są idealnymi modelami do badania in vitro odpowiedzi spolaryzowanych komórek nabłonka na infekcję wirusem układu oddechowego.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Elisabeth Blanchard za jej pomoc techniczną. Ustalenia i wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
Calu-3ATCCHTB-55
0.05% Trypsyna - 0.02% EDTAGibco/Invitrogen25300
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)Gibco/Invitrogen07-00100DK
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyCloneSH30070.03Inaktywacja termiczna, 56 ° C, 30 min
Aminokwasy endogenne 100X (10 mM)Gibco/Invitrogen11140Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C w ciemności
L-glutaminaGibco/Invitrogen25030
HEPESGibco/Invitrogen15630
EMEM-10% FBS (EMEM-10%)Uzupełnij EMEM o inaktywowany termicznie FBS do 10% surowicy, sterylny-filtr
EMEM-20% FBS + suplementy (EMEM-20%+S)Suplement EMEM do stężeń końcowych: FBS inaktywowany termicznie, 20%; 1X aminokwasy; 2 mM L-glutamina; 10 mM HEPES; sterylne płytki
Transwell 24-dołkoweCorning Costar34723 μ m wielkość porów, poliester
Trypan niebieskiGibco/Invitrogen15250
EtanolSigmaE7023Przygotować do 70% przy użyciu sterylnego dH2O
Dulbecco's PBS (D-PBS)Invitrogen14040
Buforniefluorescencyjny118 mM NaCl; 4,75 mM KCl; 2,53 mM CaCl2× H2O; 2,44 mM MgSO4; 1,19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 w sterylnej wodzie; filtr sterylny
Fluoresceina soduSigma63771 mg/ml w sterylnym buforze niefluorescencyjnym; sterylny filtr, chronić przed światłem; przechowywać w temperaturze 4 &; C do 6 miesięcy
EQUIPMENT
VoltohmmeterWorld Precision Instruments
STX2 electrodeWorld Precision Instruments
CzytnikMożliwość pomiaru A486 lub A490
płytek ELISA

Bibliografia

  1. Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical care research and practice. 2010, (2010).
  2. Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro. International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).
  3. Baginski, L., et al. Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier. Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).
  4. Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).
  5. Vinhas, R., et al. Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides. Allergy. 66, 1088-1098 (2011).
  6. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).
  7. Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells. Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).
  8. Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR). The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).
  9. Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium. Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).
  10. Grantham, M. L., et al. Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence. Journal of. 83, 8655-8661 (2009).
  11. Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide. The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).
  12. Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells. Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).
  13. Yoshikawa, T., et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PloS one. 5, e8729(2010).
  14. Hsu, A. C., et al. Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection. PloS one. 7, e32947(2012).
  15. Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).
  16. Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology. Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).
  17. Geys, J., et al. In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study. Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).
  18. Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).
  19. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System Transwellspolaryzowane komórki nabłonkatransepithelialny opór elektrycznytest z fluoresceiną sodowąinfekcja wirusem oddechowymmodel nabłonka dróg oddechowychtechnika hodowli komórkowychkomora bezpieczna (kabina z laminarnym przepływem powietrza)
Ustanowienie pokrytej cieczą hodowli spolaryzowanych ludzkich komórek nabłonka nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w celu zbadania odpowiedzi komórek gospodarza na patogeny układu oddechowego in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.