Wykorzystanie tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji trójwymiarowej struktury i funkcji naczyń krwionośnych roślin

Podsumowanie

Rentgenowska tomografia komputerowa (HRCT) o wysokiej rozdzielczości to nieniszcząca technika obrazowania diagnostycznego, która może być wykorzystana do badania struktury i funkcji naczyń krwionośnych roślin w 3D. Pokazujemy, w jaki sposób HRCT ułatwia eksplorację sieci ksylemu w szerokim zakresie tkanek i gatunków roślin.

Streszczenie

Rentgenowska tomografia komputerowa o wysokiej rozdzielczości (HRCT) to nieniszcząca technika obrazowania diagnostycznego z możliwością rozdzielczości submikronowej, która jest obecnie używana do oceny struktury i funkcji sieci ksylemu roślinnego w trzech wymiarach (3D) (np. Brodersen i in. 2010; 2011; 2012a,b). Obrazowanie HRCT opiera się na tych samych zasadach, co medyczne systemy tomografii komputerowej, ale synchrotronowe źródło promieniowania rentgenowskiego o wysokiej intensywności skutkuje wyższą rozdzielczością przestrzenną i krótszym czasem akwizycji obrazu. Tutaj pokazujemy szczegółowo, w jaki sposób synchrotron HRCT (wykonywany w Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) w połączeniu z oprogramowaniem Avizo (VSG Inc., Burlington, MA, USA) jest używany do badania ksylemu roślinnego w wyciętych tkankach i żywych roślinach. To nowe narzędzie do obrazowania pozwala użytkownikom wyjść poza tradycyjne statyczne mikrofotografie świetlne 2D lub elektronowe i badać próbki za pomocą wirtualnych przekrojów szeregowych w dowolnej płaszczyźnie. Na tej samej próbce można wykonać nieskończoną liczbę plastrów w dowolnej orientacji, co jest fizycznie niemożliwe przy użyciu tradycyjnych metod mikroskopowych.

Wyniki pokazują, że HRCT może być stosowany zarówno do gatunków roślin zielnych i drzewiastych, jak i do szeregu organów roślinnych (np. liści, ogonków liściowych, łodyg, pni, korzeni). Przedstawione tutaj rysunki pomagają zademonstrować zarówno zakres reprezentatywnej anatomii naczyń krwionośnych roślin, jak i rodzaj szczegółów wyodrębnionych ze zbiorów danych HRCT, w tym skanów sekwoi przybrzeżnej (Sequoia sempervirens), orzecha włoskiego (Juglans spp.), dębu (Quercus spp.) i klonu (Acer spp.), sadzonek drzew słoneczników (Helianthus annuus), winorośli (Vitis spp.) i paproci (Pteridium aquilinum i Woodwardia fimbriata). Wycięte i wysuszone próbki gatunków drzewiastych są najłatwiejsze do zeskanowania i zazwyczaj dają najlepsze obrazy. Jednak ostatnie ulepszenia (tj. szybsze skanowanie i stabilizacja próbki) umożliwiły zastosowanie tej techniki wizualizacji na tkankach zielonych (np. ogonkach liściowych) i na żywych roślinach. Czasami pewne skurczenie się uwodnionych zielonych tkanek roślinnych spowoduje rozmycie obrazów i opisano metody unikania tych problemów. Najnowsze osiągnięcia w zakresie HRCT dostarczają nowych, obiecujących informacji na temat funkcji naczyń krwionośnych roślin.

Wprowadzenie

Woda jest transportowana z korzeni roślin do liści w tkance naczyniowej zwanej ksylemem - sieci połączonych ze sobą przewodów, włókien i żywych, metabolicznie aktywnych komórek. Funkcja transportowa ksylemu roślinnego musi być utrzymana, aby dostarczać składniki odżywcze i wodę do liści w celu fotosyntezy, wzrostu i ostatecznie przetrwania. Transport wody w przewodach ksylemu może zostać zakłócony, gdy sieć ksylemu zostanie naruszona przez organizmy chorobotwórcze. W odpowiedzi na takie infekcje rośliny często wytwarzają żele, gumy i tylozy jako sposób na izolowanie rozprzestrzeniania się patogenów (np. McElrone i in. 2008; 2010). Stres związany z suszą może również ograniczać transport wody w ksylemie. Gdy rośliny tracą wodę podczas długotrwałej suszy, w soku ksylemowym narasta napięcie. Woda pod napięciem jest metastabilna (tzn. przy pewnym progu napięcie staje się na tyle duże, że kawitacja słupów wody zawartych w przewodach ksylemu). Po wystąpieniu kawitacji może powstać pęcherzyk gazu (zator żołądkowy), który wypełni przewód, skutecznie blokując ruch wody (Tyree i Sperry 1989), zjawisko analogiczne do choroby dekompresyjnej (tj. "zakrętów") u nurków głębinowych.

Pomimo znaczenia transportu wody ksylemu dla optymalnego funkcjonowania roślin, jak wykazano w obszernej historycznej i współczesnej literaturze na ten temat (Tyree & Zimmermann, 2002; Holbrook i wsp., 2005), nadal istnieją aspekty sieci ksylemowych, które pozostają nieuchwytne. Kilka grup badawczych zaczęło ostatnio wykorzystywać rentgenowską mikrotomografię komputerową (HRCT) o wysokiej rozdzielczości do oceny drobniejszych szczegółów anatomii drewna i tkanki naczyniowej (np. Mayo i wsp.; 2010, 2008; Mannes i in. 2010; Brodersen i in. 2010, 2011, 2012a,b; Maeda i Miyake, 2009; Steppe i in. 2004). HRCT jest techniką nieniszczącą stosowaną do wizualizacji cech we wnętrzu obiektów bryłowych oraz do uzyskiwania cyfrowych informacji na temat ich właściwości strukturalnych 3D. HRCT różni się od konwencjonalnego medycznego skanowania CAT zdolnością do rozpoznawania szczegółów o rozmiarach nawet mikrona, nawet w przypadku obiektów o dużej gęstości. Ostatnie postępy w technologii synchrotronowej HRCT poprawiły rozdzielczość obrazu i stosunek sygnału do szumu na tyle, że można wizualizować sieci statków roślinnych i połączenia między statkami, przypisywać współrzędne 3D i eksportować do symulacji modeli hydraulicznych. Brodersen i in. (2011) niedawno rozwinęli tę technikę, łącząc rekonstrukcje 3D generowane przez synchrotron HRCT z modelem Fortran, który automatycznie wydobywa dane z sieci ksylemu w znacznie wyższej rozdzielczości niż było to kiedykolwiek możliwe przy użyciu tradycyjnych metod anatomicznych (tj. seryjne cięcie za pomocą mikrotomu i przechwytywanie obrazu za pomocą mikroskopii świetlnej, np. Zimmermann 1971). Prace te zostały również wykorzystane do optymalizacji modeli hydraulicznych systemu ksylemu i zidentyfikowania unikalnych cech transportu (tj. przepływu wstecznego w niektórych naczyniach w okresach szczytowej transpiracji) (Lee i wsp., w przeglądzie).

Synchrotron HRCT może być teraz używany do wizualizacji funkcjonalności ksylemu, podatności na kawitację i zdolności roślin do naprawy zatorowych przewodów. Brak przywrócenia przepływu w embolizowanych przewodach zmniejsza wydajność hydrauliczną, ogranicza fotosyntezę, a w skrajnych przypadkach prowadzi do śmierci roślin (McDowell i in. 2008). Rośliny mogą radzić sobie z zatorami, kierując wodę wokół zatorów przez doły łączące sąsiednie funkcjonalne przewody oraz hodując nowy ksylem w celu zastąpienia utraconej wydajności hydraulicznej. Niektóre rośliny mają zdolność naprawiania pęknięć w słupach wody, ale szczegóły tego procesu w ksylemie pod napięciem pozostają niejasne od dziesięcioleci. Brodersen i in. (2010) niedawno zwizualizowali i określili ilościowo proces napełniania żywych winorośli za pomocą HRCT. Udane napełnianie naczyń zależało od napływu wody z żywych komórek otaczających przewody ksylemowe, w których pojedyncze kropelki wody rozszerzały się z czasem, napełniały naczynia i wymuszały rozpuszczenie uwięzionego gazu. Zdolność różnych zakładów do naprawy uszkodzonych naczyń ksylemu oraz mechanizmy kontrolujące te naprawy są obecnie badane.

Opis obiektu ALS Beamline 8.3.2

Nasza dotychczasowa praca została przeprowadzona na linii badawczej Hard X-ray Micro-Tomography 8.3.2 w Advanced Light Source w Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley, CA, USA). Próbki roślin umieszcza się w wyłożonej ołowiem klatce umieszczonej 20 m od źródła promieniowania rentgenowskiego, generowanego przez nadprzewodzący dipol magnesu o natężeniu 6 Tesli w pierścieniu magazynującym elektrony Advanced Light Source działającym przy energii krytycznej 11,5 KeV. Schemat stacji końcowej pokazano na rysunku 1. Promienie rentgenowskie wchodzą do klatki z wiązką o rozmiarze 40x ~ 4,6 mm i przechodzą przez próbkę, która jest zamontowana na zmotoryzowanym stoliku obrotowym. Przesyłane promienie rentgenowskie padają na scyntylator krystaliczny (dwa powszechnie stosowane materiały to LuAG lub CdWO₄), który przekształca promienie rentgenowskie w światło widzialne, które jest przekazywane przez soczewki do matrycy CCD w celu zebrania obrazu. Kamera, scyntylator i układ optyczny są umieszczone w lekkiej, szczelnej obudowie, która znajduje się na szynach, co pozwala na optymalizację odległości od próbki do scyntylatora pod kątem obrazowania z kontrastem fazowym.

Wszystkie próbki są zamontowane na stoliku obrotowym o średnicy 10 cm, który z kolei jest montowany na poziomych i pionowych stopniach translacji do pozycjonowania próbek. Żywą próbkę rośliny, z systemem korzeniowym zamontowanym w specjalnie zbudowanym uchwycie na doniczkę i liśćmi zawartymi w akrylowej tubie, można zobaczyć na rysunku 2. Typowe czasy naświetlania mogą wynosić od 0,1 do 1 sekundy przy użyciu 10-18 KeV, a czas skanowania będzie wynosił od 5 do 40 minut, w zależności od ustawień zoptymalizowanych dla konkretnej próbki. W przypadku wysokich próbek (typowych dla sieci ksylemowych roślin) skany danych można układać kafelkowo, powtarzając pomiar z próbką na różnych wysokościach, co jest kontrolowane automatycznie, umożliwiając bezszwowe odcinki szeregowe wzdłuż maksymalnej wysokości próbki ~ 10 cm. Maksymalna szerokość próbki podczas obrazowania z rozdzielczością 4,5 μm wynosi ~1 cm dla próbek, które są prawie idealne w orientacji pionowej. Generowanie i przetwarzanie danych odbywa się przy użyciu protokołu wymienionego poniżej. Ze względu na różnicę w tłumieniu promieniowania rentgenowskiego pomiędzy powietrzem a wodą, w roślinach można uzyskać doskonały kontrast obrazu bez stosowania roztworów kontrastowych typowych dla medycznych systemów tomografii komputerowej. Światło naczynia wypełnione powietrzem można łatwo odróżnić od otaczającej tkanki wypełnionej wodą w uwodnionych roślinach.

Protokół

Szczegóły protokołu opisane poniżej zostały napisane specjalnie do pracy na linii badawczej Advanced Light Source 8.3.2. Adaptacje mogą być wymagane do pracy w innych obiektach synchrotronowych. Do korzystania z tych obiektów wymagane jest odpowiednie szkolenie w zakresie bezpieczeństwa i promieniowania.

1. Przygotowanie próbki dla żywych roślin

1. Uprawiaj rośliny w doniczkach o średnicy ~10 cm i upewnij się, że główna łodyga (lub część rośliny, która ma być skanowana) jest jak najbardziej wyśrodkowana i zorientowana pionowo w doniczce. Fizyczne wymiary klatki instrumentu HRCT w Zaawansowanym Źródle Światła ograniczają żywe rośliny do ~1 m wysokości. W związku z tym obrazowanie żywych roślin najlepiej wykonywać na sadzonkach/sadzonkach uprawianych w małych doniczkach. W zależności od doświadczenia, różne rodzaje gleby mogą być używane do kontrolowania wilgotności gleby (np. w doświadczeniach z suszą), a w przypadku niektórych roślin o elastycznych pędach (np. winorośli) dłuższe pędy można ostrożnie schować w akrylowej rurce opisanej poniżej (patrz rysunki 1 i 2).
2. Zamontuj żywe rośliny doniczkowe w specjalnie wykonanym sztywnym aluminiowym uchwycie na doniczkę. Wysokość górnej płyty można regulować, aby dostosować ją do różnych wysokości doniczek. Górna część płyty jest zaprojektowana tak, aby wyrównywała się z górną częścią powierzchni gleby, a roślina wystaje ze środka dwuczęściowej płyty. Celem uchwytu doniczki jest upewnienie się, że łodyga rośliny jest mocno trzymana na miejscu, aby zminimalizować wibracje lub ruch próbki. Minimalizacja ruchu próbki podczas skanowania jest niezbędna.
3. Po zamontowaniu w uchwycie zmierz potencjał wodny łodygi lub transpirację liści za pomocą odpowiednio komory ciśnieniowej typu Scholander lub przypinanego porometru do liści, aby określić stan fizjologiczny rośliny przed skanowaniem.
4. Umieść cienkościenny akrylowy cylinder nad rośliną i na aluminiowym uchwycie na roślinę i zabezpiecz go na miejscu glinianą szpachlą, aby ustabilizować próbkę (rysunek 2). Wszelkie wibracje lub ruchy górnych liści będą przenoszone w dół łodygi i spowodują ruch tkanki roślinnej w skanowanym obszarze, co ostatecznie doprowadzi do zniekształcenia obrazu. Cylinder służy do zatrzymywania liści roślin i zapobiegania ocieraniu się liści roślin o inne elementy wyposażenia w klatce, co mogłoby powodować wibracje podczas skanowania. Należy użyć dodatkowej folii plastikowej, ręczników papierowych i taśmy, aby jeszcze bardziej zminimalizować wibracje i ruch części rośliny (patrz problemy związane z ruchem próbki na rysunku 4). Aby zmniejszyć absorpcję promieniowania rentgenowskiego (co może obniżyć jakość obrazu w danym czasie ekspozycji), cylinder zawierający powinien mieć jak najcieńsze ścianki, zachowując jednocześnie wystarczającą sztywność, aby spełniać swoją funkcję.
5. Przymocuj niestandardowy uchwyt garnka do stage z łożyskiem powietrznym i zablokuj go (przykręć) na miejscu między źródłem promieniowania rentgenowskiego a czujnikiem obrazowania i sprzętem fotograficznym. Ustaw trzpień tak pionowo, jak to możliwe i wyśrodkuj na podstawie uchwytu magnetycznego, aby upewnić się, że próbka pozostaje w polu view podczas obrotu.

2. Przygotowanie próbki do świeżej, wyciętej tkanki roślinnej

1. Świeży materiał roślinny, zazwyczaj łodygi lub ogonki liściowe, można zeskanować po natychmiastowym usunięciu z żywej rośliny. Jeśli celem eksperymentu jest wizualizacja całej sieci ksylemu, woda w naczyniach musi zostać opróżniona i zastąpiona powietrzem. W tym celu należy zamontować próbkę w komorze ciśnieniowej typu Scholandera i przepychać przez nią sprężone powietrze lub azot pod niskim ciśnieniem (< 0,05 MPa) przez około 5 minut. Gatunki będą się różnić pod względem czasu potrzebnego na ewakuację z sieci statków. Jeśli celem jest ocena stopnia powstawania zatoru w świeżej tkance roślinnej, należy pobrać próbki z rośliny za pomocą świeżej żyletki i wykonać cięcia pod wodą.
2. Owiń próbkę warstwą Parafilmu, aby zapobiec wysuszeniu podczas skanowania.
3. Zamontuj próbkę w uchwycie wiertarskim przymocowanym do metalowej płytki, która jest wkręcona w stopień łożyska powietrznego. Wyśrodkuj i ustaw próbkę pionowo zgodnie z powyższym opisem, aby upewnić się, że próbka pozostaje w polu widzenia.

3. Przygotowanie próbki do suszonych tkanek drzewnych

1. W celu optymalnej wizualizacji próbki tkanki i kontrastu obrazu konieczne jest powolne odwadnianie całej próbki tkanki drzewnej. Pociąć próbki do około 6 cm długości. Wybierz próbki, które są jak najbardziej proste w docelowym obszarze skanowania i mają średnicę ≤1 cm.
2. Umieść próbkę tkanki drzewnej w piecu do suszenia w niskiej temperaturze, aby powoli wysuszyć próbkę, nie powodując pękania lub pękania tkanki. Proces ten może się różnić w zależności od gatunku i tkanki. W przypadku zdrewniałych łodyg 12 godzin w piecu o temperaturze 40 °C jest zazwyczaj wystarczające, aby zapewnić doskonały kontrast bez powodowania znaczących zmian w strukturze fizycznej łodygi (patrz problemy z szybkim suszeniem pokazane na rysunku 3).
3. W niektórych sytuacjach pożądane jest posiadanie markera powierniczego w próbce, tak aby późniejsza sekcja i wizualizacja za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej mogła być zorientowana na określone punkty na obrazie HRCT. Aby to zrobić, przymocuj metalowy lub szklany koralik lub drut na zewnątrz łodygi za pomocą Parafilm. Inną metodą jest użycie żywicy silikonowej (np. RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ), którą można wstrzyknąć do pojedynczego przewodu ksylemu (patrz przykłady w Brodersen i in. 2010). Po utwardzeniu żywica silikonowa jest wyraźnie widoczna w próbce i łatwo ją odróżnić od innych naczyń wypełnionych powietrzem. Użyj tego znacznika, aby precyzyjnie zlokalizować określone obszary próbki.
4. Zamontuj próbkę w uchwycie wiertarskim i wyśrodkuj, jak opisano powyżej.

4. Przygotowanie próbki do tkanki liścia do dwuwymiarowych (2D) radiogramów

1. Aby zobrazować zawartość naczyń w liściach w czasie zbliżonym do rzeczywistego, liście można zeskanować w celu uzyskania radiogramu 2D, podobnego do zdjęcia rentgenowskiego zębów. Zamontuj skrzydło między dwoma arkuszami cienkiego tworzywa akrylowego i zabezpiecz krawędzie klipsami. Następnie przymocuj zamontowaną próbkę do systemu słupkowego i umieść płytkę stykową optyczną obok systemu obrazowania i źródła promieniowania rentgenowskiego.

5. Skanowanie próbki w klatce 8.3.2

1. Zdecyduj o powiększeniu, które najlepiej sprawdzi się w Twoim zastosowaniu. ALS Beamline 8.3.2 posiada możliwość skanowania za pomocą obiektywów o powiększeniach 2x, 5x i 10x. Dają one rozmiary pikseli obrazu wynoszące odpowiednio 4,5, 2,25 i 0,9 μm. W zależności od powiększenia, próbka musi mieć odpowiednią wielkość, ponieważ pole widzenia zmniejsza się wraz ze wzrostem powiększenia. Szczegółowe informacje na temat wyboru aparatu i obiektywu oraz wynikowych parametrów obrazu znajdują się w tabeli 1.

PCO.4000 (4008x2672) PCO. Krawędź (2560x2160) (Optique Peter) soczewka piksel (μm) Pole widzenia (mm) piksel (μm) Pole widzenia (mm) 10x 0,9 3.6 0,65 (0,69) 1,7 (1,7) 5x (4x) 1.8 7.2 1,3 (1,72) 3,3 (4,4) 2x Rozdział 4.5 Rozdział 18 3,25 (3,44) 8,3 (8,8) 1x 9 36 6,5 (-) 16,6 (-)

Tabela 1. Szczegółowe informacje na temat dostępnych aparatów i obiektywów w ALS 8.3.2.

2. Ustaw energię promieniowania rentgenowskiego na 15 keV. Wykazano, że zapewnia to doskonały kontrast obrazu w większości zastosowań roślinnych (patrz Brodersen i in. 2010, 2011, 2012a,b). Czasy naświetlania są na ogół zależne od grubości i gęstości próbki (a tym samym zastosowanego powiększenia) i wynoszą od 100 do 1000 ms. Dłuższe czasy naświetlania (o ile piksele detektora nie są nasycone) zazwyczaj prowadzą do wyższego stosunku sygnału do szumu, ale kosztem wydłużonego czasu skanowania.
3. Wybierz przyrost kątowy, który jest odpowiedni dla Twojej aplikacji. Próbki są obracane o 180° podczas skanowania, a liczba obrazów wykonanych podczas obrotu może mieć znaczący wpływ na rozmiar zestawu danych, długość interwału skanowania i końcową jakość obrazu, ale generalnie następuje spadek jakości. Typowe skany są wykonywane z dokładnością do 0,25°, co daje 721 obrazów na skan. Zmniejszenie przyrostu do 0,125° skutkuje lepszymi obrazami do wizualizacji drobnych szczegółów, ale daje 1 440 obrazów, a tym samym znacznie większy zestaw danych (dla typowego regionu zainteresowania oznacza to ~10-30 GB danych w porównaniu z 5 GB). Jednak stosunek sygnału do szumu jest często poprawiany i wart zarówno wydłużonego czasu skanowania, jak i rozmiaru danych. Suche łodygi, które prawdopodobnie nie odkształcą się/nie skurczą podczas skanowania, mogą być poddawane dłuższym odstępom czasu (mniejszy przyrost kątowy) bez szkody. W przypadku obrazowania żywych roślin, gdzie procesy biologiczne (np. naprawa zatoru) zachodzą w krótkich skalach czasowych, preferowane jest wybieranie krótszych interwałów skanowania, aby ograniczyć potencjalny szkodliwy wpływ promieniowania rentgenowskiego na tę tkankę - chociaż wiąże się to z potencjalną utratą jakości obrazu. Krótsze interwały skanowania można osiągnąć przy użyciu ustawienia tomografii ciągłej, podczas którego próbka obraca się w sposób ciągły podczas rejestrowania obrazów.
4. Dla każdego skanowania obrazy "jasnego pola" i "ciemnego pola" muszą zostać skorygowane. Obrazy w jasnym polu to obrazy bez próbki w wiązce. Są one często zbierane przed i po zeskanowaniu próbki poprzez poziome przesunięcie próbki. Ciemne pola są zbierane przez zamknięcie migawki rentgenowskiej - mierzy to ilość sygnału, który kamera pokazuje bez promieniowania rentgenowskiego.

6. Przetwarzanie danych

1. Przenieś "surowy" obraz 2D . Obrazy TIF, które zostały wyeksportowane z komputera akwizycji na serwer plików do komputera przetwarzającego dane. Jeśli komputer ma wystarczającą ilość pamięci RAM, dane można skopiować na tak zwany "dysk RAM" (część pamięci RAM pojawia się jako dysk twardy w komputerze). W ten sposób oprogramowanie nie musi uzyskiwać dostępu do obracającego się dysku twardego, który jest stosunkowo wolny w porównaniu z dyskiem SSD lub pamięcią flash. Ten krok znacznie skraca czas wymagany do przetwarzania zestawów danych.
2. Obrazy muszą być przekonwertowane na procentową skalę transmisji. Beamline 8.3.2 posiada niestandardową wtyczkę normalizującą tło, którą można pobrać i używać z darmowymi pakietami oprogramowania ImageJ lub Fiji (http://fiji.sc/). Odejmuje ciemne liczby od obrazów i normalizuje przykładowe obrazy przez jasne pola, aby uzyskać obrazy, które pokazują procentową transmisję. Załaduj znormalizowane obrazy do pakietu oprogramowania Octopus (http://www.inct.be/en/software/octopus) i "zrekonstruuj" zestaw danych 3D z RAW 2D. TIF przy użyciu wyznaczonych etapów przetwarzania (Normalizacja obrazów, Usuwanie pierścienia, Tworzenie Sinogramu, Rekonstrukcja belki równoległej). W wyniku tego procesu powstaje seria . Obrazy poprzeczne (przekroju poprzecznego) TIF składające się z "wokseli" (wolumetrycznych elementów pikselowych), z których każdy ma współrzędne x, y, z i wartości intensywności reprezentujące liniowy współczynnik absorpcji promieniowania rentgenowskiego.

7. Wizualizacja

1. Wizualizuj stos obrazów w jednym z różnych pakietów oprogramowania. Darmowe oprogramowanie (np. Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml) może być używane do wizualizacji objętości lub pojedynczych obrazów lub stosów obrazów (np. ImageJ lub FIJI). Do wizualizacji 3D można wykorzystać inne pakiety oprogramowania. Nasza grupa badawcza korzysta z pakietu oprogramowania Avizo (http://www.vsg3d.com/avizo/overview), ale powszechnie używane są również inne, takie jak Amira (http://www.amira.com/) i VGStudioMax (http://www.volumegraphics.com/).
2. Załaduj zestawy danych do pamięci systemowej i wyświetl próbkę w wirtualnej orientacji poprzecznej, podłużnej lub promieniowej. Ze względu na atrybuty 3D zestawu danych, wirtualne przekroje przez próbkę można obracać w dowolnej płaszczyźnie, aby wyrównać się z obszarami zainteresowania, co stanowi znaczną poprawę w porównaniu z tradycyjną seryjną mikroskopią świetlną (szczegółowe przykłady można znaleźć w filmach 1-3).
3. Aby zobrazować próbkę zgodnie z potrzebami w 3D, "podziel próbkę na segmenty" za pomocą różnych półautomatycznych i ręcznych procedur w Avizo, aby oddzielić światła naczyń lub inne struktury od otaczającej tkanki. Segmentacja odnosi się do definiowania granic między obiektami zainteresowania, a tym samym rozdzielania lub segmentowania ich na oddzielne obszary. Renderowanie objętości w 3D jest wykonywane przez oprogramowanie do wizualizacji. Jedną z metod, aby to zrobić, jest bezpośrednie renderowanie objętościowe, w którym zakłada się, że każdy punkt w objętości emituje i pochłania światło; Ilość i barwę emisji i absorpcji można zdefiniować za pomocą "mapy kolorów", a wynikowa projekcja w danym kierunku jest wyświetlana na ekranie. Alternatywnie konstruowany jest model szkieletowy lub powierzchnia siatki 3D reprezentująca segmentowe obwiednie, aby pokazać model 3D interesującej nas struktury. Siatka 3D składa się z elementów wielokątnych, a całkowita liczba elementów będzie miała wpływ zarówno na wierność odwzorowania struktury, jak i na rozmiar powiązanego pliku danych (tj. więcej elementów prowadzi do większej wierności, ale większego rozmiaru pliku). W oprogramowaniu do wizualizacji dostępnych jest wiele modułów przetwarzania obrazu, które umożliwiają sterowanie wyjściem renderowania głośności, a także sterowanie jasnością obrazu, kontrastem, przezroczystością, redukcją szumów itp.

8. Kwantyfikacja

1. Po dokonaniu segmentacji możliwe jest ilościowe określenie docelowych struktur roślin lub zmian funkcjonalnych w objętości, długości, szerokości, obecności lub braku wody, powietrza itp. Na przykład Brodersen i in. (2010) wykorzystali oprogramowanie Avizo do ilościowego określenia zmiany objętości kropelek wody w naczyniach do napełniania winorośli. Rośliny skanowano co 30 minut przez cztery do ośmiu godzin, tworząc poklatkową sekwencję napełniania naczyń. Każdy skan został zrekonstruowany i załadowany do Avizo, gdzie poszczególne kropelki były mierzone w czasie wraz ze wzrostem ich objętości.

Wyniki

Skany HRCT Synchotron zostały z powodzeniem wdrożone na szerokiej gamie tkanek i gatunków roślin za pomocą linii badawczej 8.3.2 (Rysunek 5) i dostarczyły nowych informacji na temat struktury i funkcji ksylemu roślinnego w niespotykanej dotąd rozdzielczości w 3D. Możliwości wizualizacji i eksploracji zapewniane przez rekonstrukcje 3D (jak pokazano na rysunkach 6-8 i filmach 1-3) pozwalają na precyzyjne określenie lokalizacji i orientacji struktur z sieciami ksylemu zarówno na wyciętych ...

Dyskusja

Synchotron HRCT zapewnia biologom roślin potężne, nieniszczące narzędzie do badania wewnętrznego funkcjonowania naczyń krwionośnych roślin w niewiarygodnych szczegółach. Technologia ta została ostatnio wykorzystana do identyfikacji wcześniej nieopisanych struktur anatomicznych w ksylemie winorośli, które w różny sposób zmieniają łączność sieci ksylemu u różnych gatunków winorośli (Brodersen i in. 2012b, w druku) - ta łączność może drastycznie zmienić zdolność patogenów naczyniowych i zatorów do destrukcyjnego ro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zobacz szczegóły wymienione powyżej dotyczące sprzętu na linii badawczej Zaawansowanego Źródła Światła 8.3.2