Kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

Podsumowanie

Mechaniczne cechy glikokaliksu śródbłonka zostały zmierzone za pomocą wgłębień za pomocą kulek o rozmiarach mikronowych na wspornikach AFM. Komórki śródbłonka hodowano w niestandardowej komorze w fizjologicznych warunkach przepływu w celu wywołania ekspresji glikokaliksu. Dane analizowano przy użyciu modelu cienkowarstwowego w celu określenia grubości i modułu glikokaliksu.

Streszczenie

Nasze zrozumienie interakcji leukocytów ze ścianą naczynia podczas wychwytywania leukocytów jest ograniczone przez niepełne zrozumienie właściwości mechanicznych warstwy powierzchniowej śródbłonka. Wiadomo, że cząsteczki adhezyjne na leukocytach są rozmieszczone nierównomiernie względem topografii powierzchni ³, że topografia ogranicza tworzenie się wiązań adhezyjnych z innymi powierzchniami ⁹ oraz że fizjologiczne siły kontaktowe (≈ 5,0 − 10,0 pN na mikrokosmki) mogą ściskać mikrokosmki do zaledwie jednej trzeciej ich długości spoczynkowej, zwiększając dostępność cząsteczek do przeciwległej powierzchni ^{3, 7}. Uważamy, że śródbłonek jest strukturą dwuwarstwową, stosunkowo sztywnym korpusem komórkowym oraz glikokaliksem, miękką ochronną powłoką cukrową na powierzchni światła ⁶. Wykazano, że glikokaliks może działać jako bariera zmniejszająca przyleganie leukocytów do powierzchni śródbłonka ⁴. W tym raporcie zaczynamy zajmować się odkształcalnością powierzchni śródbłonka, aby zrozumieć, w jaki sposób sztywność mechaniczna śródbłonka może wpływać na tworzenie wiązań. Komórki śródbłonka wyhodowane w hodowli statycznej nie wykazują ekspresji silnego glikokaliksu, ale komórki wyhodowane w fizjologicznych warunkach przepływu zaczynają zbliżać się do glikokaliksu obserwowanego in vivo ². Moduł korpusu komórki śródbłonka został zmierzony za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) i wynosi około 5 do 20 kPa ⁵. Grubość i strukturę glikokaliksu badano za pomocą mikroskopii elektronowej ⁸, a moduł glikokaliksu przybliżono metodami pośrednimi, ale według naszej wiedzy nie opublikowano doniesień o bezpośrednim pomiarze modułu glikokaliksu w żywych komórkach. W tym badaniu przedstawiamy eksperymenty z wgłębieniami wykonane za pomocą nowatorskiej sondy AFM na komórkach, które były hodowane w warunkach maksymalizujących ekspresję ich glikokaliksu w celu dokonania bezpośrednich pomiarów modułu i grubości glikokaliksu śródbłonka.

Protokół

1. Metody

1.1 Komora przepływu komórek

Komora przepływowa, pokazana na rysunku 1, została skonstruowana tak, aby komórki mogły być hodowane pod ciśnieniem 1,0 Pa (10 dyn/cm²), a następnie przenoszone bezpośrednio do AFM Asylum MFP3D (Santa Barbara, CA).

1. Komorę przepływową przygotowano do eksperymentu, czyszcząc najpierw szkiełka w roztworze piranii (3:1_H2SO_{, 4}:_H2O2) przez 15 min, a następnie myjąc je wodą destylowaną. Następnie wypalono je do wyschnięcia i pokryto aminopropylotrietoksysilanem (APTES) w komorze osadzania próżniowego.
2. Silikonowa uszczelka została wycięta za pomocą narzędzia tnącego Silhouette SD. Pozwoliło nam to na precyzyjną kontrolę wymiarów komory przepływowej w celu kontroli natężenia przepływu i naprężeń ścinających podczas wzrostu komórek. Zazwyczaj kanał był wycinany o szerokości 6,4 mm i długości 19 mm z arkusza silikonu o grubości 0,4 mm. Natężenie przepływu niezbędne do wytworzenia naprężenia ścinającego 1,0 Pa (10 dyn/cm²) oblicza się przy założeniu przepływu laminarnego w kanale prostokątnym za pomocą równania:

gdzie Q to natężenie przepływu, τ to naprężenie ścinające, μ to lepkość medium, przy założeniu, że wynosi tutaj 1,0 mPa (0,01 dyn*s/cm²), h to wysokość, a w to szerokość komory przepływowej.

3. Górna część komory przepływowej została wyrównana z uszczelką w naczyniu do hodowli komórkowych i zabezpieczona pierścieniem magnetycznym. Zespół został wypełniony alkoholem izopropylowym (IPA) w celu sterylizacji.
4. Zmontowano system pełnego przepływu. Porty przepływowe w naczyniu do hodowli komórkowej zostały podłączone do zaworów trójdrogowych. Zawory były podłączone do otwartych strzykawek o pojemności 30 ml. IPA przepłukano przez system, który następnie przemyto 30 ml pożywki McCoy's z 4% surowicą cielęcą płodu (FCS). System został następnie wypełniony 20 ml pożywki do hodowli komórek firmy Vec Technologies. Na wierzchu strzykawek umieszczono osłony. Nasadka strzykawki ze zbiornikiem wychwytującym miała igłę do przenoszenia pożywki z powrotem do zbiornika paszowego. Sterylne filtry 0,2 μm zostały przymocowane do wlotów powietrza w pokrywach, aby zapobiec zanieczyszczeniu systemu. Komora przepływowa była wtedy gotowa do wysiewu komórek.

1.2 Hodowla komórkowa

1. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i pożywkę wzrostową zakupiono od Vec Technologies (Rensselaer, NY) i wyhodowano do zbiegu w kolbie T25.
2. Pożywkę wzrostową usunięto z kolby, a monowarstwę komórek uwolniono za pomocą 2 ml 2,5% trypsyny. Gdy komórki znalazły się w roztworze, trypsynizację wygaszano przez dodanie 10 ml pożywki do hodowli komórkowej do kolby.
3. Zawiesinę komórkową odwirowywano przez 5 minut, a supernatant usunięto. Komórki zawieszono ponownie w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych (zawierającej surowicę) w celu wstrzyknięcia do komory przepływowej.
4. Zawiesinę komórek (0,5 ml, ~50 000 komórek) załadowano do strzykawki i wstrzyknięto do komory przepływowej przez zawór trójdrogowy.
5. Komórki pozostawiono do osiadania i przylegania do szklanego podłoża przez 2 godziny przed rozpoczęciem przepływu. Komórki hodowano pod przepływem w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 1 do 5 dni aż do zlania.

1.3 Przygotowanie wspornika i wcięcie komórki

1. Bezkońcówkowe wsporniki AFM (NanoWorld, Szwajcaria) czyszczono w kwasie azotowym przez 5 minut i funkcjonalizowano aminopropylotrietoksysilanem (APTES) w komorze osadzania parowego.
2. Przygotowano roztwór 5 mg/ml wagowo NHS-sulfo-LC-biotyny w buforowanym roztworze soli Hanka (HBSS). Wsporniki zanurzono w roztworze na 15 minut w celu sprzężenia silanu z chemią N-hydroksysukcynimidu (NHS).
3. Roztwór pożywki wolnej od biotyny sporządzono przez inkubację 20 ml pożywki do hodowli komórkowych Vec Technologies (w tym surowicy) z 200 μl kulek streptavadyny przez 12 godzin. Kulki usunięto z podłoża za pomocą magnesu, a pożywkę przefiltrowano przez sterylny filtr 0,22 μm.
4. Komorę przepływową wyjęto z naczynia do hodowli komórkowych, a komórki przemyto w pożywce wolnej od biotyny o temperaturze 37 °C.
5. Przygotowano roztwór podstawowy 1 μl kulek o wielkości 2,4 μm pokrytych streptawidyną w 1 ml pożywki wolnej od biotyny, a następnie dodano 100 μl bulionu do naczynia do hodowli komórkowych.
6. Koraliki streptawidyny podniesiono za pomocą wspornika, lądując końcówką na szklanej powierzchni obok koralika, chowając, umieszczając wierzchołek wspornika nad kulką, a następnie dociskając wspornik do koralika i odpoczywając przez kilka sekund.
7. Czułość wspornika mierzono poprzez wcięcie w obszar gołego szkła i wykorzystanie nachylenia krzywej do ustawienia ugięcia końcówki w funkcji napięcia.
8. Stała sprężystości wspornika została następnie obliczona na podstawie kalibracji termicznej w oprogramowaniu MFP3D.
9. Skalibrowany wspornik został następnie użyty do wcięcia próbek, jak pokazano na rysunku 2. Te kulki o wielkości 2,4 μm zapewniają większą powierzchnię kontaktu z powierzchnią komórki, dzięki czemu można wykryć właściwości mechaniczne miękkiej warstwy glikokaliksu. Kantyl umieszczono nad komórką w pobliżu jądra komórkowego, a miękkie podejście końcówki do komórki zastosowano w celu ustawienia wysokości wspornika około 3 μm nad powierzchnią komórki. Oprogramowanie zostało ustawione na 20 powtarzających się wgłębień z szybkością 1 μm/s do maksymalnej siły 7 nN. Pomiędzy kolejnymi kontaktami upłynęło około 6 sekund. Możliwe jest zastosowanie różnych szybkości wgłębień w celu zbadania zależnych od czasu właściwości glikokaliksu, chociaż w tych początkowych eksperymentach zastosowano tylko jedną szybkość wgłębiania (1 μm/s).

2. Teoria wcięć

Wcięcie w elastyczną półprzestrzeń o promieniu R można opisać za pomocą teorii Hertza, gdzie siła wcięcia, F, jest określona równaniem:

Gdzie δ oznacza głębokość wgłębienia, a E* jest zredukowanym modułem badanego materiału (rysunek 3). W przypadku nieskończenie sztywnego wgłębnika uderzającego w jednorodną sprężystą półprzestrzeń, E* jest określone równaniem:

gdzie E jest modułem sprężystości, a ν jest współczynnikiem Poissona materiału. Niedawne prace nad foliami polimerowymi zainspirowały opracowanie dwuwarstwowego modelu do określania modułu i grubości cienkich warstw ¹. Stosujemy ten model do biologii komórki, traktując glikokaliks jako jednolitą cienką miękką warstwę na powierzchni ciała komórki. Korzystając z tego modelu, zredukowany moduł układu staje się:

Gdzie E_GC jest modułem glikokaliksu, komórka E jest modułem ciała komórki, P, Q i n są stałymi, które zostały empirycznie określone na podstawie pasowania polimeru, a z jest określone równaniem:

Gdzie t jest grubością warstwy glikokaliksu. Schemat tych parametrów pokazano na rysunku 3. Wykazano, że model ten jest dokładnym sposobem określania modułu i grubości cienkiej warstwy na sztywniejszym podłożu ¹. Równanie to można wykorzystać do dopasowania krzywych uzyskanych z wgłębienia w komórkach w celu określenia modułu i grubości glikokaliksu śródbłonka, jak pokazano na rysunku 4.

Wyniki

W typowym eksperymencie, uzyskano 20 krzywych siły i odległości z danego obszaru komórki, zazwyczaj w obszarze okołojądrowym, blisko, ale nie na jądrze (w granicach ~2 μm). Krzywe zostały wyrównane w celu uwzględnienia dryfu próbki w czasie trwania pomiaru, a następnie uśrednione w celu usunięcia szumu wspornikowego, jak pokazano na rysunku 4. Krzywe zostały przeanalizowane i dopasowane do modelu dwuwarstwowego, który został opracowany w celu określenia modułu i grubości cienkich warstw polimerowych

Dyskusja

Wykorzystaliśmy wartości obliczone na podstawie modelu dwuwarstwowego i teorii Hertza do modelowania oddziaływania leukocytów krążących we krwi ze ścianą śródbłonka. Obliczyliśmy, że mikrokosmek na leukocycie o średnicy 50 nm pod obciążeniem 10 pN wgniótłby około 150 nm w glikokaliks, czyli tylko ułamek całkowitej grubości. Wskazuje to, że glikokaliks, o właściwościach zmierzonych w tym eksperymencie, jest istotną barierą dla interakcji komórka-komórka i może być dużą przeszkodą steryczną, którą komórki muszą pokonać pod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Płodowa surowica cielęca	Hyclon	SH30070
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka Vec	Technologies	MCDB-131
Połączone ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Kwas siarkowy	JT Baker	9681-02
Nadtlenek wodoru	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropylo)trietoksysilan	Aldrich	440140-100ML
Alkohol izopropylowy	VWR	BDH8999-4
Trypsyna	Cellgro	25-054-C1
Buforowany roztwór soli Hanka	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotyna	Thermo Scientific	21335
Koraliki Streptavadin	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Azyl Research
Wsporniki bez końcówek	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Sylwetka SD	Quickutz	Silhouette-SD
Guma silikonowa	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Strzykawki	Benton Dickinson	309650
18 igieł Benton	Dickinson	305196
Zestawy przedłużające	Hospira	4429-48
Zawory 4-drogowe	Teleflex	W21372
Męskie/żeńskie nasadki portowe	Smith’ s Medyczna	MX491B
	Watson-Marlow	401U/D
Rurka perystaltyczna	Watson-Marlow	903.0016.016
sterylne filtry	Pall Life Science	4652