Kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

Graham Marsh; Richard E. Waugh

doi:10.3791/50163

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50163

⸱

21 lutego 2013

Graham Marsh¹ , Richard E. Waugh¹

¹Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

W tym artykule

Podsumowanie

Mechaniczne cechy glikokaliksu śródbłonka zostały zmierzone za pomocą wgłębień za pomocą kulek o rozmiarach mikronowych na wspornikach AFM. Komórki śródbłonka hodowano w niestandardowej komorze w fizjologicznych warunkach przepływu w celu wywołania ekspresji glikokaliksu. Dane analizowano przy użyciu modelu cienkowarstwowego w celu określenia grubości i modułu glikokaliksu.

Streszczenie

Nasze zrozumienie interakcji leukocytów ze ścianą naczynia podczas wychwytywania leukocytów jest ograniczone przez niepełne zrozumienie właściwości mechanicznych warstwy powierzchniowej śródbłonka. Wiadomo, że cząsteczki adhezyjne na leukocytach są rozmieszczone nierównomiernie względem topografii powierzchni ³, że topografia ogranicza tworzenie się wiązań adhezyjnych z innymi powierzchniami ⁹ oraz że fizjologiczne siły kontaktowe (≈ 5,0 − 10,0 pN na mikrokosmki) mogą ściskać mikrokosmki do zaledwie jednej trzeciej ich długości spoczynkowej, zwiększając dostępność cząsteczek do przeciwległej powierzchni ^{3, 7}. Uważamy, że śródbłonek jest strukturą dwuwarstwową, stosunkowo sztywnym korpusem komórkowym oraz glikokaliksem, miękką ochronną powłoką cukrową na powierzchni światła ⁶. Wykazano, że glikokaliks może działać jako bariera zmniejszająca przyleganie leukocytów do powierzchni śródbłonka ⁴. W tym raporcie zaczynamy zajmować się odkształcalnością powierzchni śródbłonka, aby zrozumieć, w jaki sposób sztywność mechaniczna śródbłonka może wpływać na tworzenie wiązań. Komórki śródbłonka wyhodowane w hodowli statycznej nie wykazują ekspresji silnego glikokaliksu, ale komórki wyhodowane w fizjologicznych warunkach przepływu zaczynają zbliżać się do glikokaliksu obserwowanego in vivo ². Moduł korpusu komórki śródbłonka został zmierzony za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) i wynosi około 5 do 20 kPa ⁵. Grubość i strukturę glikokaliksu badano za pomocą mikroskopii elektronowej ⁸, a moduł glikokaliksu przybliżono metodami pośrednimi, ale według naszej wiedzy nie opublikowano doniesień o bezpośrednim pomiarze modułu glikokaliksu w żywych komórkach. W tym badaniu przedstawiamy eksperymenty z wgłębieniami wykonane za pomocą nowatorskiej sondy AFM na komórkach, które były hodowane w warunkach maksymalizujących ekspresję ich glikokaliksu w celu dokonania bezpośrednich pomiarów modułu i grubości glikokaliksu śródbłonka.

Protokół

1. Metody

1.1 Komora przepływowa dla komórek

Komora przepływowa, przedstawiona na Rysunku 1, została skonstruowana w taki sposób, aby komórki mogły być hodowane przy naprężeniu ścinającym 1,0 Pa (10 dyn/cm²), a następnie przeniesione bezpośrednio do AFM Asylum MFP3D (Santa Barbara, CA).

Komorę przepływową przygotowano do eksperymentu, najpierw czyszcząc szkiełka przedmiotowe w roztworze pirania (3:1 H₂SO₄:H₂O₂) przez 15 min, a następnie płucząc je wodą destylowaną. Następnie wysuszono je w piecu i pokryto aminopropylotrietoksysilanem (APTES) w komorze do osadzania próżniowego.
Uszczelkę silikonową wycięto za pomocą plotera Silhouette SD. Pozwoliło to na precyzyjną kontrolę wymiarów komory przepływowej w celu regulacji natężenia przepływu i naprężenia ścinającego podczas wzrostu komórek. Typowo z arkusza silikonu o grubości 0.4 mm wycinano kanał o szerokości 6,4 mm i długości 19 mm. Natężenie przepływu niezbędne do wygenerowania naprężenia ścinającego wynoszącego 1,0 Pa (10 dyn/cm²) oblicza się, zakładając przepływ laminarny w kanale prostokątnym, korzystając z równania:

Równanie dynamiki płynów, Q=(1/6)(τ/μ)h²w, ilustrujące naprężenie ścinające i przepływ, formuła.
gdzie Q to natężenie przepływu, τ to naprężenie ścinające, μ to lepkość medium, przyjęta tutaj jako 1.0 mPa (0.01 dyn*sec/cm²), h to wysokość, a w to szerokość komory przepływowej.

Górną część komory przepływowej wyrównano z uszczelką w naczyniu do hodowli komórkowej i zabezpieczono pierścieniem magnetycznym. Zespół wypełniono alkoholem izopropylowym (IPA) w celu sterylizacji.
Zmontowano cały system przepływowy. Porty przepływowe w naczyniu do hodowli komórkowej podłączono do zaworów trójdrożnych. Zawory podłączono do otwartych strzykawek o pojemności 30 ml. Przez system przepłukano IPA, a następnie przemyto go 30 ml pożywki McCoy's z dodatkiem 4% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Następnie system wypełniono 20 ml pożywki do wzrostu komórek firmy Vec Technologies. Na górnych częściach strzykawek umieszczono osłonki. Nakrętka strzykawki zbiornika odbiorczego posiadała igłę umożliwiającą przesunięcie pożywki z powrotem do zbiornika podającego. Do wlotów powietrza w osłonkach przymocowano sterylne filtry 0,2 μm, aby zapobiec kontaminacji systemu. Komora przepływowa była następnie gotowa do wysiewu komórek.

1.2 Hodowla komórkowa

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) oraz pożywka wzrostowa zostały zakupione od Vec Technologies (Rensselaer, NY) i hodowane do osiągnięcia konfluencji w kolbie T25.
Z kolby usunięto pożywkę wzrostową, a monowarstwę komórek odczepiono za pomocą 2 ml 2,5% trypsyny. Po zawieszeniu komórek proces trypsynizacji przerwano poprzez dodanie do kolby 10 ml pożywki do hodowli komórkowej.
Zawiesinę komórkową odwirowano przez 5 min i usunięto naddestylat. Komórki resuspenderowano w 1 ml pożywki do hodowli komórkowej (zawierającej serum) w celu wstrzyknięcia do komory przepływowej.
Zawiesinę komórkową (0,5 ml, ~50 000 komórek) nabrano do strzykawki i wstrzyknięto do komory przepływowej poprzez zawór trójdrożny.
Pozwolono komórkom opaść i przywrzeć do szklanego podłoża przez 2 hr przed rozpoczęciem przepływu. Komórki hodowano w warunkach przepływu w inkubatorze w temperaturze 37 °C od 1 do 5 dni, aż do osiągnięcia konfluencji.

1.3 Przygotowanie wspornika i indentacja komórki

Wygładzone igły AFM (NanoWorld, Szwajcaria) oczyszczono w kwasie azotowym przez 5 min, a następnie funkcjonalizowano aminopropylotrietoksysilanem (APTES) w komorze do osadzania z fazy gazowej.
Przygotowano roztwór NHS-sulfo-LC-biotyny w zbuforowanym roztworze soli Hanksa (HBSS) o stężeniu 5 mg/ml. Igły zanurzono w roztworze na 15 min w celu sprzężenia silanu z wykorzystaniem chemii N-hydroksysukcynimidu (NHS).
Medium wolne od biotyny przygotowano poprzez inkubację 20 ml pożywki do hodowli komórkowej Vec Technologies (zawierającej surowicę) z 200 μl kulek streptawidynowych przez 12 h. Kulki usunięto z pożywki za pomocą magnesu, a następnie pożywkę przefiltrowano przez sterylny filtr 0,22 μm.
Komorę przepływową wyjęto z naczynia do hodowli komórkowej, a komórki przemyto w temperaturze 37 °C medium wolnym od biotyny.
Przygotowano roztwór zapasowy składający się z 1 μl kulek o średnicy 2,4 μm pokrytych streptawidyną w 1 ml medium wolnego od biotyny, a następnie 100 μl tego roztworu dodano do naczynia z hodowlą komórkową.
Kulki streptawidynowe pobierano za pomocą igły poprzez opuszczenie wierzchołka na powierzchnię szkła obok kulki, wycofanie go, ustawienie szczytu igły nad kulką, a następnie dociśnięcie igły do kulki i odczekanie kilku sekund.
Czułość igły zmierzono poprzez wciskanie w obszar czystego szkła, wykorzystując nachylenie krzywej do ustawienia ugięcia wierzchołka jako funkcji napięcia.
Stałą sprężystości igły obliczono następnie na podstawie kalibracji termicznej w oprogramowaniu MFP3D.
Skalibrowaną igłę wykorzystano do wciskania w próbki, jak pokazano na Rysunku 2. Kulki o średnicy 2,4 μm zapewniają większą powierzchnię kontaktu z powierzchnią komórki, co pozwala na wykrycie właściwości mechanicznych miękkiej warstwy glikokaliksu. Igłę ustawiono nad komórką w pobliżu jądra komórkowego, a następnie zastosowano miękkie podejście wierzchołka do komórki, aby ustawić wysokość igły na około 3 μm powyżej powierzchni komórki. Oprogramowanie ustawiono na 20 powtórzeń wciskania z prędkością 1 μm/sec do maksymalnej siły 7 nN. Między kolejnymi kontaktami upływało około 6 s. Możliwe jest zastosowanie różnych prędkości wciskania w celu zbadania właściwości glikokaliksu zależnych od czasu, choć w tych wstępnych eksperymentach zastosowano tylko jedną prędkość wciskania (1 μm/sec).

2. Teoria wgniecania

Wciskanie sfery o promieniu R w elastyczną półprzestrzeń można opisać za pomocą teorii Hertza, w której siła wciskania, F, jest określona równaniem:

równanie równowagi statycznej; F=4/3E*R^(1/2)δ^(3/2); wzór z mechaniki; zastosowanie edukacyjne
Gdzie δ to głębokość wcięcia, a E* to zredukowany moduł materiału badanego (Rysunek 3). W przypadku nieskończenie sztywnego wgłębienia wnikającego w jednorodną elastyczną półprzestrzeń, E* jest określone przez równanie:

Wzór na moduł sprężystości, E*=E/(1-ν²), schemat, obliczanie właściwości materiału.
gdzie E to moduł sprężystości, a ν to współczynnik Poissona materiału. Niedawne prace nad filmami polimerowymi zainspirowały opracowanie modelu dwuwarstwowego do wyznaczania modułu i grubości cienkich warstw ¹. Stosujemy ten model w biologii komórki, traktując glikokaliks jako jednorodną cienką miękką warstwę na powierzchni ciała komórki. Przy użyciu tego modelu zredukowany moduł układu przyjmuje postać:

Równanie potencjału elektrochemicznego; E*=EGC+(Ecell-EGC)(Pzn/(1+Pzn+Qz)); opis formuły.
Gdzie E_GC to moduł glikokaliksu, E_cell to moduł ciała komórki, P, Q i n to stałe wyznaczone empirycznie z dopasowań polimerowych, a z jest określone przez równanie:

Równanie dla z w elektrolizie chemicznej, zawierające symbole EGC, Ecell.
Gdzie t jest grubością warstwy glikokaliksu. Schemat tych parametrów przedstawiono na Rysunku 3. Wykazano, że model ten jest dokładną metodą wyznaczania modułu i grubości cienkiej warstwy na sztywniejszym podłożu ¹. Równanie to można wykorzystać do dopasowania krzywych uzyskanych z wklucia w komórki w celu wyznaczenia modułu i grubości śródbłonkowego glikokaliksu, jak pokazano na Rysunku 4.