Wiązka molekularna sprzężona z przestrajalnym próżniowym spektrometrem masowym fotojonizacji ultrafioletowej w synchrotronie dostarcza wygodnego narzędzia do badania struktury elektronowej izolowanych cząsteczek i klastrów fazy gazowej. Za pomocą tej techniki wyjaśniono mechanizmy transferu protonów w dimerach zasad DNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Spektrometria mas wiązki molekularnej z przestrajalnym próżniowym promieniowaniem synchrotronowym ultrafioletowym (VUV)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przestrajalna miękka jonizacja połączona ze spektroskopią mas to potężna metoda badania izolowanych molekuł, kompleksów i klastrów oraz ich spektroskopii i dynamiki1-4. Podstawowe badania procesów fotojonizacji biomolekuł dostarczają informacji o strukturze elektronowej tych układów. Co więcej, wyznaczenia energii jonizacji i innych właściwości biomolekuł w fazie gazowej nie są trywialne, a eksperymenty te stanowią platformę do generowania tych danych. Opracowaliśmy technikę waporyzacji termicznej w połączeniu z naddźwiękowymi wiązkami molekularnymi, która zapewnia delikatny sposób transportu tych gatunków do fazy gazowej. Rozsądne połączenie gazu źródłowego i temperatury pozwala na tworzenie dimerów i wyższych klastrów zasad DNA. Niniejsza praca koncentruje się na wpływie oddziaływań niekowalencyjnych, tj. wiązań wodorowych, kumulowania i oddziaływań elektrostatycznych, na energie jonizacji i przenoszenie protonów poszczególnych biomolekuł, ich kompleksów oraz na mikrohydratację przez wodę1, 5-9.
Przeprowadziliśmy eksperymentalną i teoretyczną charakterystykę dynamiki fotojonizacji dimerów uracylu i 1,3-dimetyluracylu w fazie gazowej za pomocą wiązek molekularnych sprzężonych z promieniowaniem synchrotronowym na linii10 Dynamiki Chemicznej znajdującej się w Zaawansowanym Źródle Światła, a szczegóły eksperymentalne są tutaj wizualizowane. Pozwoliło nam to zaobserwować transfer protonów w dimerach 1,3-dimetyluracylu, układzie o geometrii stosu pi i bez wiązań wodorowych1. Wiązki molekularne zapewniają bardzo wygodny i skuteczny sposób izolowania próbki będącej przedmiotem zainteresowania od zaburzeń środowiskowych, co z kolei pozwala na dokładne porównanie z obliczeniami struktury elektronowej11, 12. Dostrajając energię fotonów z synchrotronu, można wykreślić krzywą wydajności fotojonizacji (PIE), która informuje nas o kationowych stanach elektronowych. Wartości te można następnie porównać z modelami teoretycznymi i obliczeniami, a to z kolei szczegółowo wyjaśnić strukturę elektronową i dynamikę badanych gatunków 1, 3.
Protokół
1. Nakładanie próbki
- Zdejmij tylną flanszę i zdemontuj rurkę dyszy ze stali nierdzewnej o średnicy 3/8" z urządzenia (Patrz Rycina 1 i Rysunek 2) i upewnij się, że jest czysta, a otwór o średnicy 100 mm jest drożny (można to sprawdzić, patrząc przez niego na źródło światła). W celu czyszczenia należy wypełnić rurkę około 1 ml etanolu i wyszorować wnętrze za pomocą patyczków z watą. Alternatywnie można umieścić dyszę w kąpieli ultradźwiękowej wypełnionej wodą z mydłem lub etanolem na około 20 min. Następnie osuszyć sprężonym powietrzem.
- Używając małej, czystej szpatułki, umieść około 250 mg próbki w przedniej części dyszy, blisko otworu, ale go nie blokując. Dobrą metodą zapobiegającą zablokowaniu otworu jest umieszczenie przed nim małej kulki z folii aluminiowej lub wełny szklanej, a następnie dodanie proszku z próbką. Za pomocą patyczka bawełnianego przesunij próbkę do wnętrza rurki, aby upewnić się, że znajduje się ona w pierwszych 25 mm rurki. Ta przednia część będzie stanowiła strefę grzewczą.
- Ostrożnie przymocuj dyszę do urządzenia, aby uniknąć przemieszczenia proszku z próbką wewnątrz. Następnie zamocuj adapter w kształcie klatki dla ptaków (patrz Rycina 2), blok grzewczy i termopara (Patrz Rysunek 3).
- Przed zamknięciem komory próżniowej należy zmierzyć odległość od powierzchni kołnierza do końcówki dyszy, tak aby wynosiła ona 22,5 cala; zapewni to odstęp 0,5 cala pomiędzy dyszą a skimmerem.
- Po zamknięciu komory próżniowej należy sprawdzić połączenia wkładu grzejnego i termopary, aby upewnić się, że są one prawidłowo podłączone do złączy przejścia.
- Upewnij się, że zawór wlotowy gazu nośnego jest zamknięty.
- Zamknij zawór odpowietrzający (jeśli był używany).
- Powoli rozpocząć pompowanie komory za pomocą pomp wstępnych (4 zawory); gdy ciśnienie w komorze osiągnie <1 torr, uruchomić pompy turbomolekularne (5 pomp).
- Kiedy ciśnienie w komorze jest <10-6 torr, przyłóż napięcia do optyki jonowej spektrometru mas czasu przelotu oraz do detektora z płytką mikrokanalikową (napięcie na detektorze należy zwiększać stopniowo) (Zobacz Rysunek 1 (dla różnych napięć).
- Otwórz migawkę VUV, aby wpuścić wiązkę fotonów do komory.
- Otwórz zawór wlotowy gazu nośnego i ustaw regulator ciśnienia powrotnego na 460 (jest to regulator próżniowy, mierzący w skali ujemnej od 0 do -760 torr, zatem przy ustawieniu na 460 będzie on regulował ciśnienie w przewodzie do poziomu 300 torr).
- W tych warunkach ciśnienie w komorach źródła i spektrometru mas powinno wynosić ok. 1 x 10-6 torr i ~1 x 10-6 odpowiednio torr.
2. Pozyskiwanie widma masowego
- Uruchom na komputerze oprogramowanie karty FAST (numer modelu P7889, 100 ps/bin) i pozostaw je w działaniu w tle.
- Otwórz program Labview do akwizycji danych: „General Interface.vi”* (Rysunek 4)
(*Niniejsze oprogramowanie oraz pozostałe kody Labview zostały opracowane na linii wiązki i są udostępniane bezpłatnie przez autora korespondencyjnego)
- W karcie ALS Control w oprogramowaniu Labview ustaw energię fotonów na pożądaną długość fali.
- W karcie scaler ustaw liczbę jednostek czasu do zgrupowania (zazwyczaj 32), zakres (liczbę binów) oraz liczbę sweepów (liczbę widm mas nakładanych na siebie w celu utworzenia końcowego widma mas), a następnie kliknij accept, aby wartości zostały zapisane i zastosowane.
- Następnie kliknij get data, aby rozpocząć akwizycję danych. Po zakończeniu akwizycji na ekranie pojawi się widmo mas.
- Zapisz widmo mas, klikając przycisk save. (Oś X otrzymanego widma odpowiada czasowi przelotu jonów w jednostkach 100 ps)
3. Pozyskanie krzywej wydajności fotojonizacji (PIE)
- Korzystając z karty ALS Scan (Rycina 5) w oprogramowaniu Labview, możliwe jest pozyskiwanie danych podczas strojenia jednego z silników linii wiązki. W tym przypadku należy wybrać silnik „Mono T3 energy”, aby dostroić urządzenie do różnych energii fotonów (undulator wewnątrz synchrotronu przesunie się automatycznie, aby dopasować żądaną długość fali). Ustaw energię fotonów na pożądaną wartość (w eV).
- Wprowadź energie początkową (Start) i końcową (Stop) (w eV) oraz wielkość kroku.
- Nie wprowadzaj liczby przejść (sweeps) – zostanie ona zaktualizowana automatycznie na podstawie wartości wprowadzonej w kroku 2.4.
- Kliknij Read current from K486, aby odczytać prąd fotoelektryczny mierzony przez fotodiodę.
- Następnie kliknij Start, aby rozpocząć skanowanie. Pojawi się prośba o wybranie nazwy pliku, w którym dane zostaną zapisane po zakończeniu pomiaru.
- Pierwsza kolumna w pliku danych zawiera numer kanału (Bin#) i musi zostać przeliczona na jednostki masy13. Typowe wartości to: Mass = 0,6 + 1xE-3 (Bin#) + 5xE-7 (Bin#)^2 (Bardziej precyzyjną kalibrację masy można przeprowadzić, używając znanej mieszaniny gazów lub nawet powietrza pokojowego, t.j. mieszaniny głównie O2, N2 i H2O, i dopasowując czas ich przylotu do wielomianu drugiego stopnia).
- Zapisz plik danych z pierwszą kolumną przeliczoną na masę.
- Aby wykreślić krzywą PIE, jednym z łatwych sposobów jest użycie drugiego programu Labview o nazwie „ALS energy scan.vi”, który służy do analizy danych skanowania i generowania PIE.
4. Wykreślanie krzywej wydajności fotojonizacji (PIE)
- Jak wspomniano powyżej, analiza może zostać przeprowadzona przy użyciu programu „ALS energy scan.vi” (patrz Rysunek 6), jednak w tej sekcji opiszemy również kroki niezbędne do analizy danych bez jego użycia.
- Po uruchomieniu programu pojawi się prośba o wybranie pliku zawierającego dane. Jest to plik zapisany w kroku 3.7, który zawiera masy w pierwszej kolumnie oraz liczbę jonów przy różnych energiach fotonów w kolejnych kolumnach. Należy zwrócić uwagę, że pierwszy i drugi wiersz w pliku wskazują odpowiednio energię fotonu i prąd fotowy dla danych w danej kolumnie.
- W górnym panelu znajduje się dwuwymiarowy wykres danych; przesuwanie czerwonego poziomego znacznika pozwala wybrać widma masowe dla konkretnej energii fotonów, które zostaną wyświetlone w dolnym panelu.
- Kolejnym krokiem jest całkowanie liczby jonów dla konkretnej masy przy każdej energii fotonów przy jednoczesnym odjęciu sygnału tła. W dolnym panelu dwa czerwone znaczniki pionowe powinny zostać ustawione wokół piku masy do całkowania, natomiast dwa niebieskie znaczniki wokół pobliskiego obszaru pozbawionego danych, który może służyć jako wartość tła. Oprogramowanie wyświetli zintegrowane dane pomniejszone o tło w panelu po prawej stronie.
- Aby przedstawić rzeczywistą krzywą PIE, należy skorygować liczbę jonów o zmienny strumień fotonów na każdym etapie. Jest to wykonywane automatycznie przez oprogramowanie. Jeśli zdecydujesz się pominąć tę korektę, kliknij przycisk current correction po prawej stronie górnego panelu, aby go wyłączyć. W przypadku chęci wykonania tego kroku ręcznie, należy uwzględnić również wydajność kwantową fotodiody w zależności od energii fotonów (uzyskaną od producenta fotodiody i dostępną u autora korespondyjnego), patrz równanie 1. W przeciwnym razie wszystkie te operacje są wykonywane automatycznie przez oprogramowanie.
- Kliknij save spectrum w prawym dolnym rogu, aby zapisać skorygowaną krzywą PIE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 7 przedstawia typowe widmo masowe naddźwiękowej ekspansji par 1,3-dimetylouracylu (A) oraz krzywe PIE trzech głównych sygnałów (monomeru przy m/z 140, protonowanego monomeru przy m/z 141 i dimeru 1,3-dimetylouracylu przy m/z 280) wyodrębnione z pomiaru VUV w zakresie od 8 eV do 10 eV (B). Szary cień oznacza odchylenie standardowe z trzech kolejnych pomiarów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Monomery i dimery są generowane w wyniku naddźwiękowego rozszerzania się strumienia, w wyniku którego powstaje wiązka molekularna. Niewielką próbkę zasady DNA umieszcza się w termicznym źródle parowania i podgrzewa w celu wytworzenia wystarczającej prężności pary. Gaz argon przenosi opary przez otwór o średnicy 100 μm i przechodzi przez odpieniacz o średnicy 2 mm w celu wytworzenia zimnej wiązki molekularnej14. Alternatywnie można zastosować źródło wiązki wylewnej, w którym próbkę umieszcza się w rozgrzanym pi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Eksperymenty zostały przeprowadzone na linii badawczej Dynamiki Chemicznej w Zaawansowanym Źródle Światła, Lawrence Berkeley National Laboratory i wspierane przez Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych Departamentu Energii USA na podstawie umowy nr. DE-AC02-05CH11231, za pośrednictwem Wydziału Nauk Chemicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| 1,3-dimetyluracyl | Aldrich | 349801 |
Bibliografia
- Golan, A. Ionization of dimethyluracil dimers leads to facile proton transfer in the absence of hydrogen bonds. Nat. Chem. 4, 323-329 (2012).
- Belau, L. Vacuum-Ultraviolet Photoionization Studies of the Microhydration of DNA Bases (Guanine, Cytosine, Adenine, and Thymine). The Journal of Physical Chemistry A. 111, 7562-7568 (2007).
- Golan, A., Ahmed, M. Ionization of Water Clusters Mediated by Exciton Energy Transfer from Argon Clusters. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3, 458-462 (2012).
- Nicolas, C. Vacuum Ultraviolet Photoionization of C3. Journal of the American Chemical Society. 128, 220-226 (2005).
- Kamarchik, E. Spectroscopic signatures of proton transfer dynamics in the water dimer cation. Journal of Chemical Physics. 132, (2010).
- Khistyaev, K. The effect of microhydration on ionization energies of thymine. Faraday Discussions. 150, 313-330 (2011).
- Bravaya, K. B. The effect of pi-stacking, H-bonding, and electrostatic interactions on the ionization energies of nucleic acid bases: adenine-adenine, thymine-thymine and adenine-thymine dimers. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 2292-2307 (2010).
- Kostko, O. Ionization of cytosine monomer and dimer studied by VUV photoionization and electronic structure calculations. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 2860-2872 (2010).
- Bravaya, K. B. Electronic Structure and Spectroscopy of Nucleic Acid Bases: Ionization Energies, Ionization-Induced Structural Changes, and Photoelectron Spectra. Journal of Physical Chemistry A. 114, 12305-12317 (2010).
- Leone, S. R., Ahmed, M., Wilson, K. R. Chemical dynamics, molecular energetics, and kinetics at the synchrotron. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 6564-6578 (2010).
- Scoles, G., Bassi, D., Buck, U. Atomic and Molecular Beam Methods. 1, (1988).
- Pauly, H. Atom, Molecule and Cluster Beams I. , Springer-Verlag. Berlin. (2000).
- Wiley, W. C., McLaren, I. H. Time-of-Flight Mass Spectrometer with Improved Resolution. Review of Scientific Instruments. 26, 1150-1157 (1955).
- Levy, D. H. The Spectroscopy of Very Cold Gases. Science. 214, 263-269 (1981).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
