Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analizy transportu retinolu w czasie rzeczywistym przez receptor błonowy białka wiążącego retinol w osoczu

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50169

⸱

28 stycznia 2013

 ,  , 
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną technikę produkcji wysokiej jakości kompleksu witaminy A/RBP oraz dwie techniki monitorowania w czasie rzeczywistym do badania transportu witaminy A przez STRA6, receptor RBP.

Streszczenie

Witamina A jest niezbędna dla widzenia i wzrostu/różnicowania prawie wszystkich ludzkich organów. Białko wiążące retinol w osoczu (RBP) jest podstawowym i swoistym nośnikiem witaminy A we krwi. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną technikę produkcji i oczyszczania holo-RBP oraz dwie techniki monitorowania w czasie rzeczywistym w celu zbadania transportu witaminy A przez receptor RBP o wysokim powinowactwie STRA6. Pierwsza technika umożliwia wyprodukowanie dużej ilości wysokiej jakości holo-RBP (w 100% naładowanego retinolem) do testów transportu witaminy A. Wysokiej jakości RBP jest niezbędna do testów funkcjonalnych, ponieważ nieprawidłowo sfałdowany RBP łatwo uwalnia witaminę A, a zanieczyszczenie bakteryjne w preparacie RBP może powodować artefakty. Techniki monitorowania w czasie rzeczywistym, takie jak elektrofizjologia, wniosły istotny wkład w badania nad transportem błonowym. Transport retinolu za pośrednictwem receptora RBP do niedawna nie był analizowany w czasie rzeczywistym. Drugą opisaną tutaj techniką jest analiza w czasie rzeczywistym uwalniania lub ładowania retinolu katalizowanego przez STRA6. Trzecią techniką jest analiza w czasie rzeczywistym katalizowanego przez STRA6 transportu retinolu z holo-RBP do komórkowego białka wiążącego retinol I (CRBP-I). Techniki te zapewniają wysoką czułość i rozdzielczość w ujawnianiu mechanizmu wychwytu witaminy A przez receptor RBP.

Wprowadzenie

Witamina A to organiczna cząsteczka, która jest niezbędna do przetrwania człowieka i prawidłowego funkcjonowania prawie wszystkich ludzkich organów. Pochodne witaminy A (retinoidy) uczestniczą w różnych zdarzeniach biochemicznych i komórkowych, w tym w wykrywaniu światła dla widzenia 1,2 oraz regulacji ekspresji genów i translacji białek podczas rozwoju embrionalnego i w tkankach dorosłych 3-6. Chociaż retinol ma zdolność dyfuzji ogólnoustrojowej, ewolucja wymyśliła białko wiążące retinol w osoczu, specyficzne białko nośnikowe do transportu witaminy A we krwi, aby osiągnąć wysoką wydajność i specyficzność oraz uniknąć toksyczności związanej z losową dyfuzją 7-10. Receptor o wysokim powinowactwie, który wiąże się z RBP i pobiera witaminę A, został wysunięty w latach siedemdziesiątych XX wieku 11-13. Pomimo zgromadzonych w ciągu trzech dekad dowodów na istnienie receptora RBP 14-31, hipoteza receptora była dyskutowana przez wiele lat ze względu na istnienie nieprawidłowej definicji holo-RBP. Prawidłowa definicja holo-RBP jest taka, że jest to kompleks o wysokim powinowactwie 1:1 między retinolem a RBP. Wielokrotna ekstrakcja holo-RBP za pomocą rozpuszczalnika organicznego jest niezbędna do wytworzenia apo-RBP. Definicja ta jest używana przez prawie wszystkie laboratoria badające RBP 7,9,32-35 lub receptor RBP 14-31,36-42. Nieprawidłowa definicja holo-RBP, która została użyta do obalenia istnienia receptora RBP, to ostra mieszanina wolnego retinolu z apo-RBP. Ponieważ funkcją receptora RBP w wychwytywaniu witaminy A z holo-RBP jest uwalnianie retinolu z holo-RBP, receptor RBP nie odgrywałby żadnej roli w wychwytywaniu retinolu, gdyby retinol był wolny na początku (jak sugeruje błędna definicja holo-RBP).

Niedawna identyfikacja receptora RBP jako wielobłonowego białka domenie o nazwie STRA636 i jego funkcji w wychwytywaniu witaminy A z holo-RBP 36-43 zdecydowanie sprzeciwia się hipotezie, że RBP nie potrzebuje receptora do dostarczania witaminy A. Szczegółowe analizy wykazały, że STRA6 ma 9 domen transbłonowych, z N-końcem zlokalizowanym zewnątrzkomórkowo i C-końcem zlokalizowanym wewnątrzkomórkowo 40. Pomiędzy transbłonowymi 6 i 7 znajduje się niezbędna domena wiążąca RBP 39. STRA6 jest sprzężony zarówno z LRAT, jak i CRBP-I w wychwytywaniu witaminy A z holo-RBP, ale ani LRAT, ani CRBP-I nie są absolutnie wymagane do zwiększonej aktywności STRA6 41. Zdolność STRA6 do katalizowania uwalniania retinolu z holo-RBP jest kluczem do jego aktywności wychwytu witaminy A 41. Opierając się na STRA6 w celu uwolnienia retinolu, dostarczanie witaminy A przez RBP może transportować witaminę A do komórek docelowych w tkankach obwodowych z wysoką specyficznością i wydajnością.

Krytyczne znaczenie definicji i przygotowania holo-RBP ilustruje nie tylko historyczna debata na temat istnienia receptora RBP, ale także trzy powiązane ostatnio prace oparte na definicjach holo-RBP różniących się od oryginalnej i poprawnej definicji 44-46. W pierwszym artykule wykorzystano definicję holo-RBP, która została użyta do odrzucenia istnienia receptora RBP w celu zbadania receptora RBP 44. W drugim i trzecim artykule przedstawiono trzecią definicję holo-RBP, która jeszcze mniej prawdopodobna, aby retinol był badany, tworząc właściwy kompleks z RBP 45,46. W badaniach tych otrzymano 3H-retinol/RBP poprzez zmieszanie holo-RBP (nawet nie apo-RBP) z 3H-retinolem. Ponieważ ten test nie miał utworzonego 3H-retinolu / RBP i nie usunął nadmiaru wolnego 3H-retinolu 45,46, nie jest to test na wychwyt 3H-retinolu z 3H-retinolu / RBP, ale jest testem dyfuzji wolnego 3H-retinolu. Wcześniej wykazano, że STRA6 nie zwiększa wychwytu komórkowego wolnego retinolu przez LRAT 38 lub CRBP-I 41. Praktycznie cały retinol jest związany z RBP we krwi i nie ma wykrywalnego wolnego retinolu. Główną funkcją receptora RBP jest katalizowanie uwalniania retinolu z holo-RBP podczas wychwytu retinolu z holo-RBP 41. Jeśli retinol jest sztucznie uwalniany lub jest w wolnej postaci na początku od 45,46, receptor RBP nie jest potrzebny. Radykalnie odmienne wyniki uzyskane z testu wolnej dyfuzji retinolu w porównaniu z testami opartymi na prawidłowo przygotowanym holo-RBP ilustrują, że prawidłowe przygotowanie RBP ma kluczowe znaczenie dla jego testów funkcjonalnych.

RBP można oczyścić z ludzkiej surowicy 41, ale procedura jest skomplikowana, a wydajność niska. Alternatywnym podejściem jest produkcja RBP w E. coli. Ponieważ E. coli nie ma zdolności do prawidłowego fałdowania białek wydzielanych przez ssaki z więcej niż jedną parą wiązań dwusiarczkowych, takich jak RBP, konieczne jest ponowne złożenie RBP i oczyszczenie prawidłowo pofałdowanego białka. Nieprawidłowo sfałdowane białka nie tylko zachowują się inaczej niż skorygowane pofałdowane RBP w różnych testach, ale także powodują agregację białek podczas przechowywania. Z tego samego powodu apo-RBP jest produkowany wyłącznie z wysokiej jakości holo-RBP. Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół produkcji wysokiej jakości RBP w 100% naładowanego retinolem poprzez ekspresję bakterii, ponowne fałdowanie i oczyszczanie HPLC. Oczyszczanie HPLC nie tylko usuwa nieprawidłowo pofałdowane RBP, ale także znaczne zanieczyszczenie bakteryjne, które może powodować poważne artefakty, jeśli RBP jest używany w testach transdukcji sygnału. Opisujemy również dwie czułe techniki monitorowania w czasie rzeczywistym w celu zbadania transportu retinolu przez STRA6. Obie techniki opierają się na wysokiej jakości RBP. Ze względu na ograniczoną przestrzeń, klasyczne techniki oznaczania wychwytu witaminy A na bazie radioaktywnych retinoidów i HPLC nie są tutaj opisane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja, ponowne składanie i oczyszczanie Holo-RBP metodą HPLC

  1. Przekształć komórki BL-21 z wektorem pET3a zawierającym cDNA dla ludzkiego RBP z 6-krotnym znacznikiem He na N-końcu. Hodować przekształcone komórki BL-21 w wytrząsarce w temperaturze 37 °C w 40 ml pożywki LB z karbenicyliną, aż do osiągnięcia średnicy zewnętrznej przy 600 nm 0,5. Indukuj ekspresję białka RBP, dodając IPTG do 1mM. Hoduj bakterie w temperaturze 37 °C przez kolejne 5 godzin.
  2. RBP wytwarzany w E. coli jest głównie obecny w nierozpuszczalnych ciałach inkluzyjnych. Aby wzbogacić ciała inkluzyjne, osadzaj komórki w granulkach o masie 10 000 x g przez 20 minut. Następnie sonikować komórki na lodzie w 5 ml PBS z inhibitorami proteazy, a następnie 2 cykle zamrażania i rozmrażania. Osadzać inkluzje w roztworach 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i trzymać osad na lodzie.
  3. Rozpuścić osad z inkluzją przez sonikację w 10 ml 7,5 M chlorowodorku guanidyny. Dodać połowę objętości (5 ml) 25 mM buforu Tris, pH 9,0 i naziemnej telewizji cyfrowej (DTT) do końcowego stężenia 10 mM. Energicznie wymieszaj roztwór w mieszalniku wirowym przez noc w temperaturze pokojowej, aby całkowicie zredukować i zdenaturować białka.
  4. Odwirować roztwór białkowy w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału o stężeniu 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu przenieś supernatant do nowej probówki i umieść probówkę na lodzie.
  5. Przygotować cztery objętości (60 ml) buforu do ponownego składania (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cystyny, 3,0 mM cysteiny, 1 mM EDTA). Odgazowuje bufor do ponownego składania. Przygotuj również 600 μl 10 mM retinolu w etanolu w przyćmionym czerwonym świetle. Trzymaj go w ciemności na lodzie. Zarówno bufor do ponownego składania, jak i roztwór retinolu muszą być świeżo przygotowane.
  6. Schłodzić zarówno roztwór białkowy, jak i bufor do ponownego fałdowania na lodzie przez co najmniej 30 minut. Wyższa temperatura prawdopodobnie obniży jakość ponownie złożonego RBP. Dodać kroplami 1 ml buforu do ponownego składania i 10 μl roztworu retinolu, podczas gdy roztwór białkowy energicznie miesza się w zlewce na lodzie. Powtarzaj ten krok, aż zostanie dodany cały bufor do ponownego składania i retinol. Mieszaj reakcję na lodzie w ciemności przez 5 godzin.
  7. Odwirować reakcję ponownego fałdowania przy 24 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Konieczne jest usunięcie kruszyw zaraz po reakcji ponownego fałdowania.
  8. Roztwór sklarowanego osadu należy zagęścić za pomocą koncentratora Amicon Ultra 15 (MWCO 10 K) do objętości około 10 ml. Nie należy koncentrować ponownie złożonego roztworu powyżej tego poziomu. Zbyt duża koncentracja doprowadzi do agregacji białek i obniży ostateczną wydajność i jakość prawidłowo sfałdowanych RBP. Rozcieńczyć zagęszczoną próbkę zimnym PBS do objętości 100 ml. Celem tego etapu jest usunięcie składników w reakcji ponownego fałdowania, które zakłócają oczyszczanie niklu.
  9. Wirować roztwór jeszcze raz w temperaturze 24 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ważne jest, aby usunąć wszelkie osady. Przenieść sklarowany osad do dwóch probówek o pojemności 50 ml, z których każda zawiera 1 ml zawiesiny Ni-NTA, która została przemyta PBS. Obracać probówki w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. Inkubacja rozcieńczonego roztworu przez 1 godzinę może spowodować wytrącanie się nieprawidłowo sfałdowanych białek, które należy usunąć.
  10. Wirować probówki o masie 500 x g przez 3 minuty. Ostrożnie usunąć supernatant. Wszystko, co unosi się na wodzie, powinno zostać usunięte. Dodać zimny PBS do 30 ml na każdą probówkę. Ponownie odwirować i usunąć supernatant. Powtarzaj ten proces, aż nie zobaczysz nic poza koralikami w tubie.
  11. Przenieś żywicę Ni-NTA do pustej kolumny. Przepłucz żywicę z 20 objętościami kolumny zawierającą 10 mM imidazolu, 500 mM NaCl w PBS. Eluować His-RBP w 5 objętościach kolumn po 100 mM imidazolu w PBS. Nie przechowuj tego roztworu przez dłuższy czas, a zamrożenie zmniejsza ostateczną wydajność i jakość. Aby uzyskać najlepszy wynik, należy natychmiast oczyścić RBP za pomocą HPLC.
  12. Dializować His-RBP oczyszczony z żywicy Ni-NTA w stosunku do 25 mM Tris, pH 8,4 i 120 mM NaCl. Koncentrator może być również używany do wymiany. Klarowne próbki do HPLC należy pobrać przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C bezpośrednio przed każdym cyklem.
  13. Oczyść holo-RBP na HPLC za pomocą kolumny jonowymiennej AX-300 za pomocą gradientu krokowego NaCl (220 mM 12 min, 360 mM 15 min i 1,000 mM 15 min) przy użyciu 25 mM Tris, pH 8,4 jako faza ruchoma przy 1 ml / min. Wraz ze wzrostem stężenia NaCl holo-His-RBP jest uwalniany, podczas gdy apo-RBP i nieprawidłowo sfałdowany RBP pozostają związane z kolumną (ryc. 1). Jeśli ponowne fałdowanie RBP nie zostanie wykonane optymalnie, nieprawidłowo złożony RBP (np. źle złożony RBP-I na rysunku 1) może zdominować cały preparat
    14. .
  14. Odzyskać prawidłowo złożony holo-RBP z frakcji pikowych przy 360 mM NaCl. Uważnie monitoruj profil elucji prawidłowo złożonego i źle złożonego His-RBP. Przy 1,000 mM NaCl większość nieprawidłowo sfałdowanych His-RBP powinna zostać uwolniona.
  15. Frakcje zawierające holo-RBP są łączone, zagęszczane i dializowane z PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Sprawdź końcową wydajność i jakość (330 nm/280 nm) za pomocą spektrofotometru. Prawidłowo złożony produkt powinien mieć stosunek 330 nm/280 nm nieco większy niż 1 (rysunek 1).
  16. Aby wytworzyć apo-RBP, dodać równą objętość heptanu do oczyszczonego holo-RBP i delikatnie wymieszać, obracając przez noc w temperaturze 4 °C. Wirować przy 16 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie przenieść dolną fazę wodną do nowej probówki (unikając osadu na granicy faz). Powtórz proces trzy razy z 3-godzinną inkubacją dla każdego. Sprawdź absorpcję na spektrofotometrze Nanodrop, aby upewnić się, że pik 330 nm zmniejszył się do poziomu tła.

2. Monitorowanie w czasie rzeczywistym uwalniania i ładowania retinolu katalizowanego przez STRA6

  1. Zablokuj czarną 96-dołkową płytkę Microfluor-2 (Thermo Scientific) 200 μl kazeiny blokującej (Pierce) przez noc w temperaturze 4 °C, aby zapobiec niespecyficznemu przywieraniu holo-RBP do plastiku. Kazeina blokująca daje najlepszy efekt blokowania ze wszystkich testowanych przez nas rozwiązań blokujących.
  2. Błony świeżo przygotowane z komórek wykazujących ekspresję STRA6 lub komórek kontrolnych są myte za pomocą PBS i przepuszczane przez strzykawkę Hamiltona (Gastight #1710) 6 razy w celu wytworzenia jednolitej zawiesiny w PBS. Zazwyczaj używamy błon pochodzących z 1/100 do 1/20 komórek wyhodowanych na szalce o średnicy 100 mm na reakcję.
  3. Umyć powleczone studzienki płytki Microfluor-2 jednorazowo 200 μl PBS. Schłodzić płytkę na lodzie przed dodaniem zawiesiny membranowej (50 μl na studzienkę).
  4. Monitorowanie fluorescencji retinolu w czasie rzeczywistym jest mierzone za pomocą optyki fluorescencyjnej POLARstar Omega (BMG Labtech) z filtrem wzbudzenia 320ex i filtrem emisyjnym 460-10. Program jest ustawiony na tryb odczytu punktu końcowego. Tryb płyty może być również używany do pomiaru przebiegu czasu, jeśli przedziały czasowe nie są zmieniane. Sygnał z każdego punktu czasowego jest średnią z 10 pomiarów (uśrednianie orbitalne o średnicy 2 mm), a wzmocnienie jest ustawione na 1,800. Płytka jest wytrząsana przez 10 sekund przy 500 obr./min przy użyciu podwójnego wytrząsania orbitalnego przed każdym pomiarem.
  5. Aby rozpocząć test uwalniania retinolu, studzienki są odczytywane raz w trybie odczytu punktu końcowego przed dodaniem holo-RBP (zwykle 1 μM stężenia końcowego) po 0 minutach. Po dodaniu holo-RBP reakcja jest monitorowana w sposób ciągły co 5-10 minut przez 1-3 godziny. Aby rozpocząć test obciążenia retinolem, retinol all-trans (zwykle końcowe stężenie 1 μM) dodaje się do studzienek w przyćmionym czerwonym świetle. Płytkę odczytuje się raz przed dodaniem apo-RBP po 0 min. Po dodaniu apo-RBP reakcja jest monitorowana w sposób ciągły co 5-10 minut przez 1-3 godziny.
  6. Po wykonaniu wszystkich pomiarów pobierz surowe dane (przykład pokazany na rysunku 2) z oprogramowania Omega Data Analysis (BMG Labtech) do programu Microsoft Excel w celu analizy danych. Każdy punkt czasowy generuje plik, który zawiera odczyty wszystkich warunków eksperymentalnych. Na przykład, jeśli istnieje 20 punktów czasowych, skonsoliduj 20 plików w jeden plik programu Excel w celu analizy danych.
  7. Do analizy danych sygnały fluorescencyjne przed dodaniem retinolu lub holo-RBP po 0 minutach są traktowane jako sygnały tła i odejmowane od końcowych sygnałów fluorescencyjnych we wszystkich punktach czasowych. Chociaż sygnały tła są niskie w porównaniu z fluorescencją retinolu w holo-RBP, odjęcie tła eliminuje niespecyficzny wpływ rozpraszania światła przez błony i umożliwia skupienie się na fluorescencji retinolu holo-RBP lub retinolu dodanego po 0 min.

3. Monitorowanie w czasie rzeczywistym katalizowanego przez STRA6 transportu retinolu z Holo-RBP do CRBP-I

  1. Retinol-EGFP to nowa para transferu rezonansu fluorescencyjnego (FRET), która została niedawno ustalona 41. Katalizowany przez STRA6 transport retinolu z holo-RBP do EGFP-CRBP-I jest monitorowany w czasie rzeczywistym poprzez pomiar fret retinolu-EGFP. Białko fuzyjne EGFP-CRBP-I ze znacznikiem 6XHis (EGFP-CRBP-I) jest wytwarzane w komórkach ssaków i przed eksperymentem jest oczyszczane na żywicy Ni-NTA. EGFP-CRBP-I może być przechowywany w PBS z inhibitorami proteazy przez krótki okres czasu w temperaturze 4 °C. Alternatywnie białko fuzyjne zamraża się w temperaturze -80 °C w małych podwielokrotnościach.
  2. Przed reakcjami należy przygotować zablokowaną płytkę Microfluor-2 i membrany, jak opisano powyżej. Powleczone studzienki płytki Microfluor-2 przemyć raz 200 μl PBS przed dodaniem zawiesiny membranowej (50 μl na studzienkę).
  3. Retinol-EGFP FRET w czasie rzeczywistym jest mierzony za pomocą POLARstar Omega z filtrem wzbudzenia 320ex oraz filtrów emisyjnych 460-10 i 510-10 przy użyciu jednoczesnej optyki fluorescencji emisyjnej podwójnej. Program jest ustawiony na tryb odczytu punktu końcowego. Tryb płyty może być również używany do pomiaru przebiegu czasu, jeśli przedziały czasowe nie są zmieniane. Sygnał z każdego punktu czasowego jest średnią z 10 pomiarów (uśrednianie orbitalne o średnicy 2 mm), a wzmocnienie jest ustawione na 1 800 na kanał. Płytka jest wytrząsana przez 10 sekund przy 500 obr./min przy użyciu podwójnego wytrząsania orbitalnego przed każdym pomiarem.
  4. Aby rozpocząć reakcje, do studzienek dodaje się EGFP-CRBP-I (zwykle 1 μM stężenie końcowe). Tabliczka jest odczytywana raz w trybie odczytu punktu końcowego przed dodaniem holo-RBP po 0 min. Po dodaniu holo-RBP reakcja jest monitorowana w sposób ciągły poprzez pomiar co 5-10 minut przez 1-2 godziny.
  5. Po wykonaniu wszystkich pomiarów pobierz surowe dane (przykład pokazany na rysunku 3) z oprogramowania Omega Data Analysis do programu Microsoft Excel w celu analizy danych, jak opisano powyżej.
  6. Retinol-EGFP FRET oblicza się na podstawie dynamicznej zmiany stosunku pików emisji akceptor/donor47. Równanie41 do obliczenia tego stosunku to [(510 t-510b)/(460t-460 b)], gdzie 510t, 510b, 460t i 460b reprezentują emisje przy 510 nm po rozpoczęciu reakcji (t = punkt czasowy), przy 510 nm przed dodaniem retinolu lub holo-RBP (b = tło), przy 460 nm po rozpoczęciu reakcji (t = punkt czasowy), i przy 460 nm przed dodaniem odpowiednio retinolu lub holo-RBP (b = tło).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki produkcji i oczyszczania holo-RBP za pomocą HPLC (Rycina 1), analizę w czasie rzeczywistym uwalniania retinolu z holo-RBP katalizowanego przez STRA6 oraz ładowania retinolu do apo-RBP (Rycina 2) oraz analizę w czasie rzeczywistym transportu retinolu z holo-RBP do EGFP-CRBP-I katalizowanego przez STRA6 (Rycina 3).

Bez refoldingu białko RBP produkowane w bakteriach jest niemal całkowicie błędnie sfałdow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dzielimy się tutaj zoptymalizowanym protokołem produkcji RBP, ponieważ procedury produkcji i oczyszczania RBP mają kluczowe znaczenie dla generowania prawidłowo złożonych RBP. Biorąc pod uwagę możliwość nieprawidłowego sfałdowania gatunków RBP i obecność śladowych ilości białek bakteryjnych nawet w oczyszczonych przez HPLC RBP wytwarzanych przez bakterie, pomocne jest użycie natywnego RBP z surowicy w celu potwierdzenia wniosku związanego z RBP. RBP z moczem, który jest dostępny w handlu, jest złożoną mieszaniną wielu ga...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Wspierane przez R01EY018144 grantowe National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
chlorowodorek guanidynyEMD5010
cystynaSigmaC8755
cysteinaSigmaC7352
EDTAFisherBP118-500
TrisFisher7786-1
DTTEMD3860
retinolSigmaR7632
karbenicylinaFisherBP2648-5
IPTGEMD5810
PBSEMD6508
NaClFisherBP358-10
Ni-NTAQiagen1018244
imidazolEMD5720
heptanEMDHX0295-1
Bloker KazeinaPierce37528
Koncentrator Amicon Ultra 15 (MWCO 10 K)Płytka MilliporeUFC901024
Microfluor-2 Fisher14-245-177
Strzykawka Hamilton Gazoszczelna #1710Fisher14-824-655

Bibliografia

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10(2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Receptor STRA6oczyszczanie holo-RBPfluorescencja w czasie rzeczywistymtest uwalniania retinolutesty obciążania retinolemanaliza FREToczyszczanie metodą HPLCrenaturacja białek
Analizy transportu retinolu w czasie rzeczywistym przez receptor błonowy białka wiążącego retinol w osoczu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.