W tym protokole pokazujemy, jak kondycjonować zaprzęgnięte pszczoły miodne do bodźców dotykowych i wprowadzamy technikę przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki wzorca próbkowania anteny na małą skalę.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pszczoły miodne (Apis mellifera L.) są owadami euspołecznymi i dobrze znane ze swojego złożonego podziału pracy i zdolności do asocjacyjnego uczenia się1, 2. Pszczoły robotnice spędzają pierwszą połowę swojego życia w ciemnym ulu, gdzie karmią larwy lub budują regularne sześciokątne plastry na pożywienie (np. pyłek lub nektar) i czerw3. Anteny są niezwykłymi czujnikami multisensorycznymi i odgrywają kluczową rolę w różnych zadaniach dotykowych4, w tym w budowaniu ula5 i rozpoznawaniu wzorców6. W późniejszym życiu każda pszczoła opuszcza ul, aby szukać pożywienia. Następnie pszczoła musi nauczyć się rozróżniać dochodowe źródła pożywienia, zapamiętywać ich położenie i komunikować je swoim kolegom z gniazda7. Pszczoły wykorzystują różne sygnały kwiatowe, takie jak kolory lub zapachy7, 8, ale także wskazówki dotykowe z powierzchni płatków9, aby tworzyć multisensoryczne wspomnienia źródła pożywienia. W warunkach laboratoryjnych pszczoły mogą być szkolone w paradygmacie uczenia się apetytywnego w celu rozróżniania cech dotykowych obiektów, takich jak krawędzie lub rowki za pomocą czułków10, 11, 12, 13. Ten paradygmat uczenia się jest ściśle związany z klasycznym warunkowaniem węchowym odpowiedzi na przedłużenie trąbki (PER) u pszczół zaprzęgniętych14. Zaletą paradygmatu uczenia się dotykowego w laboratorium jest możliwość łączenia eksperymentów behawioralnych dotyczących uczenia się z różnymi pomiarami fizjologicznymi, w tym analizą wzorca ruchu anteny.
Protokół
1. Przygotowanie pszczół
- Zbieracze nektaru lub pyłku są łapane na polu z karmnika sacharozy lub bezpośrednio z wejścia do ula podczas powrotu z wyprawy na żerowanie. Każda pojedyncza pszczoła jest umieszczana w szklanej fiolce, która jest zamykana piankowym korkiem i natychmiast zabierana do laboratorium w celu dalszej obsługi.
- W laboratorium schwytane pszczoły są krótko schładzane w lodówce w temperaturze 4 °C, aż do momentu, gdy pojawią się pierwsze oznaki bezruchu.
- Każda unieruchomiona pszczoła jest umieszczona w małej metalowej rurce z taśmą klejącą między głową a klatką piersiową oraz nad brzuchem. Należy zadbać o to, aby trąbka i czułki były swobodnie ruchome.
- Pomaluj złożone oczy i oczka utrwalonej pszczoły białą farbą (np. bezrozpuszczalnikową Tipp-Ex), aby zasłonić widzenie.
- Dodaj małą kroplę stopionego wosku za głową pszczoły, aby przymocować ją do taśmy między głową a klatką piersiową, aby zapobiec ruchom głowy podczas nagrań.
- Oznacz każdą pszczołę numerem na taśmie dla lepszej identyfikacji i umieść rurkę ze stałą pszczołą w wilgotnej atmosferze, aby zapobiec odwodnieniu.
- Karm każdą pszczołę przez 5 sekund kropelkami 30% roztworu sacharozy dostarczonymi za pomocą strzykawki i pozwól wszystkim pszczołom dojść do siebie przez 30 minut przed rozpoczęciem protokołu kondycjonowania dotykowego.
2. Kondycjonowanie dotykowe
- Przed kondycjonowaniem każda pszczoła musi zostać przetestowana pod kątem reakcji na rozszerzenie trąbki (PER) na 30% bodziec sacharozowy zastosowany do czułków. W ten sposób końcówka trąbki musi przekroczyć wirtualną linię między otwartymi żuchwami. Wyrzuć wszystkie pszczoły, które nie reagują PER na bodziec sacharozy.
- Do kondycjonowania dotykowego należy użyć mosiężnej kostki (np. 3 x 5 mm) z gładkim lub wygrawerowanym wzorem, np. poziomymi lub pionowymi rowkami tworzącymi siatkę o długości fali 150 μm, jako bodziec kondycjonowany (CS). W przypadku bodźca bezwarunkowego (US) użyj 30% roztworu sacharozy (cukier domowy, rozcieńczony w wodzie).
- Mosiężna kostka (CS) jest umieszczana w uchwycie na mikromanipulatorze (np. Märzhäuser MM33), aby zapewnić dokładne pozycjonowanie podczas procedury kondycjonowania. Stany Zjednoczone są przedstawiane pszczole za pomocą strzykawki wypełnionej 30% roztworem sacharozy.
- Procedura kondycjonowania składa się z pięciu par bodźca dotykowego (CS) i roztworu sacharozy (US) w odstępie międzypróbnym (ITI) wynoszącym 5 minut. Umieść pojedynczą pszczołę przed mikromanipulatorem z zamontowanym bodźcem dotykowym (CS). Ustaw CS powoli, tak aby powierzchnia bodźca dotykowego była równoległa do głowy pszczoły (Rysunek 1 A i B). Odległość między zwierzęciem a obiektem dotykowym powinna mieścić się w zakresie promienia pracy czułka badanej pszczoły, tj. pszczoła powinna być w stanie zeskanować bodziec dotykowy w wygodnej pozycji obiema czułkami. W przykładzie pokazanym na rysunku 1 odległość wynosiła 3 mm. Pozwól pszczole skanować bodziec dotykowy (CS) przez 5 sekund. Po pierwszych 3 sekundach umieścić kroplę 30% roztworu sacharozy (US) za pomocą strzykawki pod trąbką. Za pomocą końcówki strzykawki delikatnie podnieść trąbkę. Stymulacja sacharozy pod trąbką wywoła bezwarunkowy PER15. Pozwól pszczole polizać nagrodę w postaci sacharozy. Użyj stopera z sygnałem alarmowym, aby utrzymać dokładne odstępy czasu podczas kondycjonowania.
- Warunkowy PER jest używany jako miara sukcesu w uczeniu się pszczoły. Po pierwszych nagrodzonych parach pszczoły zaczynają reagować na prezentację CS poprzez wydłużenie trąbki, co wskazuje, że spodziewają się nadchodzącej nagrody. W pełni rozciągnięta trąba obserwowana w dowolnym momencie w ciągu 3-sekundowego okna czasowego prezentacji bodźca dotykowego i przed prezentacją sacharozy jest oceniana jako odpowiedź pozytywna. Żadna odpowiedź nie jest uznawana za negatywną. Występowanie PER musi być odnotowane przez eksperymentatora. Odsetek pszczół wykazujących PER podczas prezentacji CS jest wykreślany dla każdej próby.
3. Nagrania kinematyczne
- Ruchy czułka pojedynczej pszczoły zaprzęgniętej są rejestrowane za pomocą cyfrowej kamery wideo z odpowiednim obiektywem makro (np. Basler A602f-2 wyposażony w TechSpec VZM 200, działający z prędkością 50 kl./s za pomocą połączenia przewodu przeciwpożarowego). Kamera jest umieszczona nad zwierzęciem w widoku z góry na dół (Rysunek 1 A). Na rysunku 1 rozdzielczość przestrzenna nagrań wynosi 0,02 mm/piksel.
- Skalibruj aparat, rejestrując pojedyncze zdjęcia szachownicy o wymiarach 10 x 10 mm z krawędzią o długości 1 mm z różnych orientacji pod obiektywem aparatu. Kalibrację można wykonać za pomocą zestawu narzędzi do kalibracji aparatu Matlab16.
- Umieść pojedynczą stałą pszczołę pod obiektywem aparatu. Przedstaw zwierzęciu bodziec dotykowy, przymocowany do mikromanipulatora. Postępuj w taki sam sposób, jak opisano dla kondycjonowania dotykowego i rejestruj ruch czułka, gdy pszczoła skanuje obiekt. Ważne jest, aby widoczny był pełny zakres pracy anteny oraz bodziec dotykowy. Wybór badanych wzorców bodźców i liczby prób zależą od projektu eksperymentu.
4. Analiza danych
- Obliczanie tła obrazu odbywa się w Matlabie. Po pierwsze, dla każdego piksela należy obliczyć medianę wartości skali szarości w czasie. Statyczne obiekty, takie jak nieruchoma głowa pszczoły i bodziec dotykowy, będą stanowić tło obrazu. Poruszające się obiekty, takie jak dwie anteny, nie będą częścią tła.
- Każda klatka nagranego wideo musi być wczytywana sekwencyjnie, a różnica między bieżącą klatką a tłem obrazu musi zostać obliczona. Wynikiem tego odejmowania jest uwydatnienie tych części obrazu, które poruszają się z klatki na klatkę. Idealnie byłoby, gdyby czułki pszczoły były jedynymi obszarami o wartościach niezerowych (rysunek 1C).
- Do dalszego przetwarzania przyjmuje się, że dwa największe obszary z niezerowymi wartościami pikseli to anteny. Dla obu anten należy wygenerować maskę binarną zawierającą dla każdego piksela wartość 1, jeśli piksel należy do anteny i wartość 0 w przeciwnym razie. Ta maska służy jako podstawa do późniejszego lokalizowania końcówek czułków. Aby uzyskać wstępną maskę dla całego obrazu, wartość szarości każdego piksela obrazu różnicowego jest porównywana ze wstępnie zdefiniowanym progiem. Ponieważ później zajmujemy się hałasem, próg ten jest wybierany jako dość niski. Maska wstępna nadal zawiera dwa rodzaje błędów: Po pierwsze, ze względu na szum obrazu małe obszary są nadal częścią maski. Po drugie, obszary należące do anteny niekoniecznie muszą być w pełni połączone. To ostatnie występuje najczęściej, gdy tło ma w przybliżeniu taką samą luminescencję jak antena. W celu wyeliminowania tych artefaktów stosuje się standardowe operacje morfologiczne przetwarzania obrazu, tj. kombinację erozji i dylatacji obrazu, opierając się na standardowych funkcjach Matlaba imerode i imdilate odpowiednio (patrz17 s. 158-205 w celu dalszego wyjaśnienia). Po procesie odszumiania hipotezy dotyczące czułków są nadal zawarte w tej samej masce. W związku z tym, w następnym kroku, maska binarna jest grupowana dla obszarów rozłącznych za pomocą standardowej funkcji Matlaba bwlabel (patrz17 s. 40-48, aby uzyskać więcej informacji na temat algorytmu segmentacji obrazu).
- Zliczana jest liczba pikseli w klastrze i wybierane są dwa największe klastry. Środek ciężkości jest obliczany w celu rozróżnienia lewej i prawej anteny (rysunek 1D).
- Końcówkę anteny dla każdej anteny można zdefiniować jako piksel w klastrze o najwyższej wartości w kierunku proksymalnym do dystalnego (patrz rysunek 1D).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W poniższym eksperymencie zbadaliśmy, w jaki sposób uczenie się dotykowe wpływa na zachowanie próbkowania antennego u pszczół miodnych. W tym celu monitorowaliśmy ruch końcówki czułka u pszczół naiwnych i uwarunkowanych przed oraz w trakcie prezentacji bodźca dotykowego.
Najpierw zarejestrowano spontaniczne ruchy czułków w grupie pszczół zbieraczek pyłku (N = 42) przez 1 min. Połowa pszczół (N = 21) została następnie poddana warunkowaniu poprzez pięciokrotne parowanie bodźca dotykowego z nagro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przygotowanie pszczół: Zbieranie i naprawianie pszczół powinno odbywać się szybko, aby utrzymać niski poziom stresu zwierzęcia. Stres ma wpływ na reakcję PER, a zatem może mieć pośredni wpływ na wyniki uczenia się u pszczół19, 20. Poziom stresu można zmniejszyć, umieszczając szklane fiolki z pszczołami bezpośrednio na lodzie natychmiast po pobraniu, aby szybko je unieruchomić. Należy wziąć pod uwagę, że pszczoły potrzebują więcej czasu na regenerację, im dłuższy jest okres znieczulenia.
<...Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Joachimowi Erberowi za wprowadzenie nas w paradygmat uczenia się dotykowego u pszczół miodnych. Prace te były wspierane przez Klaster Doskonałości 277 CITEC, finansowany w ramach Niemieckiej Inicjatywy Doskonałości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zbieracze pyłku, Apis mellifera L. | Ule prywatne | ||
| Fiolki szklane (22 x 45 mm) | Carl Roth GmbH Co | X655.1 | |
| Rurki mosiężne, 10 x 30 mm | Własna produkcja | ||
| Kostka mosiężna, 3 x 5 mm | Własna produkcja | ||
| Tipp-Ex (bez rozpuszczalników) | Tipp-Ex GmbH Co KG | ||
| Roztwór sacharozy (30%) | Domowy suger rozcieńczony w wodzie | ||
| Etanol (70%) | Carl Roth GmbH Co | 9065.3 | |
| Strzykawka (1 ml) i igła (0,6 x 25) | Carl Roth GmbH Co | 59.1 | |
| Stup | Carl Roth GmbH Co | L423.1 | |
| Mikromanipulator | Mä RZHä użytkownik MM33 | 00-42-101-0000 | |
| Cyfrowa kamera wideo | Basler A602f-2 | ||
| Obiektyw makro do kamery | TechSpec VZM 200 | ||
| Matlab R2009b | The MathWorks |
Bibliografia
- Page, R. E., Scheiner, R., Erber, J., Amdam, G. V. The development and evolution of division of labor and foraging specialization in a social insect (Apis mellifera L.). Curr. Top. Dev. Biol. 74, 253-286 (2006).
- Menzel, R., Müller, U. Learning and memory in honeybees: From behavior to neural substrates. Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).
- Seeley, T. D. The wisdom of the hive. , Harvard University Press. Cambridge Mass, London. (1995).
- Staudacher, E., Gebhardt, M. J., Dürr, V. Antennal movements and mechanoreception: neurobiology of active tactile sensors. Adv. Insect Physiol. 32, 49-205 (2005).
- Martin, H., Lindauer, M. Sinnesphysiologische Leistungen beim Wabenbau der Honigbiene. Z. Vergl. Physiol. 53, 372-404 (1966).
- Kevan, P. G. Texture sensitivity in the life of honeybees. Neurobiology and behavior of honeybees. Menzel, R., Mercer, A. , Springer Verlag. Berlin, Heidelberg, New York. 96-101 (1987).
- von Frisch, K. Tanzsprache und Orientierung der Bienen. , Springer Verlag. Berlin, Heidelberg, New York. (1965).
- Waser, N. M. Flower constancy: definition, cause, and ceasurement. Am. Nat. 127, 593-603 (1986).
- Kevan, P. G., Lane, M. A. Flower petal microtexture is a tactile cue for bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 4750-4752 (1985).
- Erber, J., Kierzek, S., Sander, E., Grandy, K. Tactile learning in the honeybee. J. Comp. Physiol. A. 183, 737-744 (1998).
- Kisch, J., Erber, J. Operant conditioning of antennal movements in the honey bee. Behav. Brain. Res. 99, 93-102 (1999).
- Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. 185, 1-10 (1999).
- Erber, J., Scheiner, R. Honeybee learning. Encyclopedia of Neuroscience. Adelman, G., Smith, B. , Elsevier. (2004).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Dacher, M., Gauthier, M. Involvement of NO-synthase and nicotinic receptors in learning in the honey bee. Physiol. Behav. 95, 200-207 (2008).
- Camera Calibration Toolbox for Matlab [Internet]. , Available from: http://www.vision.caltech.edu/bouguetj/calib_doc (2004).
- Haralick, R. M., Shapiro, L. G. Computer and Robot Vision. I, Addison-Wesley. Reading, Mass. (1992).
- Erber, J. Tactile antennal learning in the honey bee. Honeybee Neurobiology and Behavior. Galizia, C. G., et al. , Springer Verlag. 439-455 (2012).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. 189, 675-684 (2003).
- Harris, J. W., Woodring, J. Effects of stress, age, season and source colony on levels of octopamine, dopamine and serotonine in the honey bee (Apis mellifera L.) brain. J. Insect. Physiol. 38, 29-35 (1992).
- Scheiner, R., Kuritz-Kaiser, A., Menzel, R., Erber, J. Sensory responsiveness and the effects of equal subjective rewards on tactile learning and memory of honeybees. Learn. Mem. 12, 626-635 (2005).
- Mujagic, S., Sarkander, J., Erber, B., Erber, J. Sucrose acceptance and different forms of associative learning of the honey bee (Apis mellifera L.) in the field and laboratory. Front. Behav. Neurosci. 4, 46(2010).
- Scheiner, R., Barnert, M., Erber, J. Variation in water and sucrose responsiveness during the foraging season affects proboscis extension learning in honey bees. Apidologie. 34, 67-72 (2003).
- Mujagic, S., Erber, J. Sucrose acceptance, discrimination and proboscis responses of honey bees (Apis mellifera L.) in the field and the laboratory. J. Comp. Physiol. A. 195, 325-339 (2009).
- Friedrich, A., Thomas, U., Müller, U. Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory. J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).
- Erber, J., Pribbenow, B., Grandy, K., Kierzek, S. Tactile motor learning in the antennal system of the honeybee (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. 181, 355-365 (1997).
- Lambin, M., Déglise, P., Gauthier, M. Antennal movements as indicators of odor detection by worker honeybees. Apidologie. 36, 119-126 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
