Artykuł metodologiczny

Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite

38.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50191

⸱

28 marca 2013

 ,  , 
1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

W tym artykule

Podsumowanie

Pierwotne białe preadipocyty wyizolowane z białych tkanek tłuszczowych u myszy mogą być różnicowane na komórki beżowe/brite. Przedstawiono niezawodny system modelu komórkowego do badania molekularnej regulacji "brązowienia" białego tłuszczu.

Streszczenie

Brązowe adipocyty mają zdolność do rozprzęgania łańcucha oddechowego w mitochondriach i rozpraszania energii chemicznej w postaci ciepła. Rozwój brązowych adipocytów UCP1-dodatnich w białych tkankach tłuszczowych (tzw. komórkach beżowych lub brite) jest silnie indukowany przez różne sygnały środowiskowe, takie jak przewlekła ekspozycja na zimno lub agoniści PPARγ, dlatego ten typ komórek ma potencjał jako cel terapeutyczny w leczeniu otyłości. Chociaż większość unieśmiertelnionych linii adipocytów nie może podsumować procesu "brązowienia" białego tłuszczu w hodowli, pierwotne adipocyty wyizolowane z frakcji naczyniowej zrębu w podskórnej białej tkance tłuszczowej (WAT) zapewniają niezawodny system komórkowy do badania molekularnej kontroli rozwoju komórek beżowo-brite. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznej izolacji pierwotnych preadipocytów i indukowania różnicowania do komórek beżowo-britych w hodowli. Efekt brązowienia można ocenić na podstawie ekspresji markerów selektywnych dla brązowej tkanki tłuszczowej, takich jak UCP1.

Wprowadzenie

Otyłość dramatycznie wzrasta na całym świecie i jest obecnie uważana za jeden z najpoważniejszych problemów zdrowia publicznego 1. Stan ten jest związany z nierównowagą w poborze energii w stosunku do wydatku i powoduje nadmiar energii zmagazynowanej w postaci lipidów w białej tkance tłuszczowej (WAT). Powiększenie WAT wiąże się ze wzrostem masy i masy ciała, natomiast brunatna tkanka tłuszczowa ma zdolność do rozpraszania nadmiaru energii w celu wytworzenia ciepła. W związku z tym BAT może funkcjonować jako ochrona zarówno przed przeziębieniem, jak i otyłością 2,3 . Osiąga się to poprzez rozprzęgnięcie transportu elektronów w mitochondriach przez rozprzęganie białka 1 (UCP1). Białko to jest uważane za znak rozpoznawczy termogenezy bez dreszczy w BAT3. Kilka badań przeprowadzonych w ostatnich latach wykazało, że dorośli ludzie mają funkcjonalny BAT 4-8, w związku z czym manipulowanie BAT u ludzi może być potencjalną interwencją terapeutyczną w walce z otyłością i chorobami z nią związanymi.

Obecne dowody wskazują, że u gryzoni istnieją dwa rodzaje brązowych adipocytów; "Klasyczny" lub "istniejący" brązowy tłuszcz rozwija się w fazie prenatalnej i tworzy dedykowane brązowe magazyny tłuszczowe w okolicy międzyłopatkowej i innych tkankach obwodowych. Z drugiej strony, "indukowalna" forma brunatnego tłuszczu (tzw. brite lub beżowe komórki) rozwija się w okresie poporodowym i pojawia się przeplatana w białych tkankach tłuszczowych. Te dwa typy brązowych adipocytów są również oddzielone różnym pochodzeniem rozwojowym. Podczas gdy istniejące wcześniej brązowe adipocyty powstają z mioblastycznych prekursorów Myf5, indukowalne komórki brite / beżowe przeplatane WAT powstają z linii innej niż Myf5 9,10 . Ponadto szlaki regulacyjne tego typu komórek prawdopodobnie różnią się od brązowych adipocytów pochodzących z Myf5 11. Rozwój beżowych komórek (tj. "brązowienie" białego tłuszczu) może być aktywowany w odpowiedzi na przewlekłą ekspozycję na zimno i na agonistów receptorów β3-adrenergicznych lub PPARγ agonistów u dorosłychw wieku 12-14 lat. Komórki beżowo-brite mogą być obiecującym celem terapeutycznym do manipulowania ogólnym bilansem energetycznym i mogą potencjalnie stać się częścią leczenia otyłości; Dlatego ważne jest, aby zrozumieć precyzyjne mechanizmy molekularne i szlaki sygnałowe, za pomocą których sygnały środowiskowe kontrolują rozwój beżowych komórek.

Aby zrozumieć molekularną kontrolę brązowienia białego tłuszczu, najlepiej nadają się eksperymenty in vitro, ponieważ różnicowanie preadipocytów odbywa się raczej asynchronicznie i trudno jest wykryć komórki in situ 15. Chociaż badania nad rozwojem adipocytów były do tej pory prowadzone głównie na liniach komórkowych, takich jak 3T3-L1, 3T3-F442A lub HIB1, wydaje się, że te linie komórkowe nie mają sygnatury molekularnej komórek beżowych. Z drugiej strony, pierwotne adipocyty wyizolowane z podskórnego WAT najprawdopodobniej podsumowują proces brązowienia białej tkanki tłuszczowej w sposób autonomiczny dla komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji frakcji zrębowo-naczyniowej z tkanki tłuszczowej oraz indukowania brązowienia białej tkanki tłuszczowej w odpowiedzi na PPARγ agonistów. Wykazano, że rozyglitazon jest szczególnie skutecznym mediatorem brązowienia w tych komórkach. Jak wcześniej sugerowano 16, ten system komórkowy może być używany do służenia niezawodnemu systemowi komórkowemu do badania rozwoju komórek beżowych / brite.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj pożywkę do trawienia

Zrób 5 ml na 5 myszy na tkankę (około 1 ml/1 g tkanki tłuszczowej).

  1. Ważenie enzymów trawiennych:
    -Collaginase D: 1,5 u/ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
    - Dispaza II: 2,4 u/ml (04942078001, 0,980 mg/lyo, Roche, 11466200)
  2. Dodać 25 ml PBS i dobrze wymieszać do rozpuszczenia
  3. Dodać CaCl2 tuż przed trawieniem tkanki w końcowym stężeniu 10 mM

2. Wypreparuj tkankę tłuszczową od myszy

  1. Sekcję należy przeprowadzić ostrożnie i natychmiast po uśmierceniu myszy (w wieku 6-8 tygodni). Pracuj sterylnie z etanolem spryskanym futro myszy przed jego otwarciem. Umieścić tkankę bezpośrednio w czystym PBS, oddzielić BAT międzyłopatkowy i podskórny pachwinowy WAT.
  2. W przypadku BAT międzyłopatkowego: umieść mysz tyłem do góry, rozciąć wzdłuż grzbietu i aż do szyi. Brązowa tkanka tłuszczowa znajduje się tuż pod skórą między ramionami (międzyłopatkowo). BAT można postrzegać jako dwa płaty w kształcie motyla. Należy ostrożnie usunąć cienką warstwę białego tłuszczu pokrywającą BAT.
  3. W przypadku podskórnego WAT (pachwinowego WAT): usunąć skórę. Pachwinowy WAT znajduje się bezpośrednio pod skórą po obu stronach, zaczynając prawie z tyłu i biegnąc wzdłuż, wewnątrz ud i w dół w kierunku jądra.

3. Cięcie i trawienie tkanki tłuszczowej

  1. Szybko usuń wszelkie zanieczyszczenia, takie jak włosy, mięśnie szkieletowe i tkanka łączna z odcinków tkanki.
  2. Szybko wysuszyć chusteczkę na papierze, aby nie rozcieńczać podłoża preparacyjnego PBS i umieścić go na suchej płytce.
  3. Dodaj pożywkę do wytrawiania (dodano CaCl2 przed trawieniem) i zmiel tkankę na małe kawałki. Bardzo dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przenieś zmielone tkanki do probówek o pojemności 50 ml z resztą pożywki wytrawiającej, wymieszaj jeszcze więcej, pipetując w górę i w dół.
  4. Trawić w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu przy 150 obr./min przez 40-50 min. Sprawdzaj co 10-15 minut, aby upewnić się, że trawienie przebiega prawidłowo i zapobiec nadmiernemu trawieniu.

Uwaga: Prawidłowe trawienie podłoża i czas są ważne. Tkanka musi być dobrze strawiona, ale nadmierne trawienie może uszkodzić komórki.

4. Zawieszenie komory filtra

  1. Zatrzymaj trawienie, dodając 5 ml kompletnej pożywki (DMEM/F12 zawierającej 10% FPS i P/S). Komórki powinny być prawie całkowicie jednorodne. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
  2. Wirować przy 700 x g przez 10 min.
  3. SVF może być teraz widziany jako brązowawy granul na dnie tuby. Odessać tłustą, dojrzałą warstwę adipocytów na wierzchu i większość warstwy płynu - zachować osad i rozpuścić go w 10 ml kompletnego podłoża. Dobrze wymieszaj.
  4. Umieścić sitko (o średnicy 50-70 μm) na nowej probówce o pojemności 50 ml i przefiltrować zawiesinę komórek.

5. Komórki płytkowe

  1. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 700 x g przez 10 minut.
  2. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywki. Odpipetować i dobrze wymieszać.
  3. Oszacuj, ile talerzy jest potrzebnych. Może się to różnić i zależy od wielkości granulki. Ogólna zasada to 2 z 10 cm płytki od 5 myszy w przypadku pachwinowego WAT i jedna 10 cm płytki w przypadku BAT.
  4. Komórki płytki na naczyniach pokrytych kolagenem (R&D) w kompletnym podłożu
  5. 1-2 godziny po posianiu komórek odessać pożywkę, dwukrotnie przemyć PBS i dodać świeżą pożywkę. Ten krok jest ważny, ponieważ może usunąć czerwone krwinki, komórki odpornościowe i inne zanieczyszczenia.

6. Różnicowanie komórek

  1. Wykonaj media konserwacyjne i indukcyjne.

Medium konserwacyjne

Kompletny nośnik z dodanymi:

Insulina, końcowe stężenie 5 μg/ml (5 mg/ml bulionu, ***100 μl kwasu octowego w 10 ml H2O do przygotowania zakwaszonej wody o pH 2,5. Rozpuść insulinę w zakwaszonej wodzie. Przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C)

3,3',5-Triiodo-L-tyronina (T3), końcowe stężenie 1 nM (10 μM zapas, ***rozpuść T3 w 1N NaOH i dodaj pożywkę, aby uzyskać 10 μM zapasu. Sigma cat# T-2877)

Przechowywać w temperaturze 4 °C, dobre przez tydzień.

Medium indukcyjne

Podłoże konserwacyjne zawierające następujące związki:

Indomethacin, końcowe stężenie 125 μM (0,125 M zapas etanolu, Sigma cat#I-7378). Indometacyna musi zostać podgrzana do temperatury 60 °C w celu rozpuszczenia.

Deksametazon, stężenie końcowe 2 μg/ml (2 mg/ml skarpeta w etanolu, Sigma cat# D-1756)
3-Izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX), stężenie końcowe. 0,5 mM (0,25 mM zapas w DMSO, Sigma cat# I-5879)
Rozyglitazon, stężenie końcowe 0,5 μM (10 mM zapas w DMSO, Sigma cat# R-2408)

Uwaga: Za każdym razem przygotuj nową pożywkę indukcyjną.

  1. Hoduj pierwotne adipocyty do 95-97% konfluencji w kompletnym podłożu (zlewającym się, ale niezbyt upakowanym)
  2. Zamień zwykłą pożywkę kompletną na pożywkę indukcyjną (dzień 0)
  3. Po 48 godzinach (dzień 2) zmienić pożywkę na pożywkę podtrzymującą z rozyglitazonem (0,5 μM)
  4. Po dodatkowych 48 godzinach (dzień 4) zmień pożywkę na świeżą pożywkę podtrzymującą z rozyglitazonem (1 μM) przez dodatkowe 2-3 dni. 6-7 dni po dodaniu pożywki indukcyjnej komórki są w pełni zróżnicowane do dojrzałych komórek tłuszczowych i są wypełnione kropelkami oleju. Kropelki pojawią się około 3-4 dni po indukcji.

Uwaga: Zmieniaj podłoże co 2-3 dni, aż komórki w pełni się zróżnicują.

Komórki mogą być teraz pobierane, a ekspresja mRNA Ucp1 i innych genów specyficznych dla brązowych adipocytów może być mierzona za pomocą qRT-PCR. Western blot zostanie użyty do wykrywania białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Proces brązowienia pierwotnych adipocytów można ocenić poprzez pomiar ekspresji mRNA Ucp1 oraz innych genów specyficznych lub selektywnych dla tkanki tłuszczowej brunatnej za pomocą qRT-PCR. Na Rysunku 1 przedstawiono dane dotyczące ekspresji genów w pierwotnych adipocytach pochodzących z pachwinowej tkanki tłuszczowej białej (WAT). Komórki indukowano do różnicowania w obecności dwóch różnych dawek roziglitazonu, odpowiednio 50 nM i 500 nM. Podzbiór komórek traktowano forskoliną w stężeniu 10 μM...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj przedstawiamy niezawodny system komórkowy do badania rozwoju komórek beżowo-brite w pierwotnych adipocytach hodowanych u myszy. W porównaniu z kilkoma dostępnymi nieśmiertelnymi liniami komórkowymi, system ten prawdopodobnie będzie miał większe znaczenie dla brązowienia białego tłuszczu in vivo.

Mimo że badanie tych pierwotnych adipocytów oferuje pewne korzyści, istnieją również pewne ograniczenia i obawy, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, system ten jest w dużym stopni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louisowi Sharpowi, Emi Tomoda i Lauren Ruiz za dyskusję, pomoc techniczną i redakcyjną nad rękopisem. Prace te były wspierane przez granty z NIH (DK087853), z Program for Breakthrough Biomedical Research oraz od Asubio Pharm Inc. dla S.K. U.L.A. były wspierane przez stypendia doktoranckie SHARE z Uniwersytetu w Kopenhadze oraz projekt UE 7PR DIABAT (HEALTH-F2-2011-278373) dla Lise Madsen i Karstena Kristiansena. Przyjmujemy również do wiadomości grant centrum DERC (NIH P30 DK063720).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik
Collaginase DRoche11088874103
Dispase IIRoche04942078001
CaCl2
DMEM mediumFisher10017-CVZ 2,5 g/l glukozy i L-glutamina bez pirogronianu sodu
Insulina
T3 (3,3',5-Triiodo-L-tyronina) SigmaT-2877
Indometacyna SigmaI-7378
Deksametazon SigmaD-1756
IBMX SigmaI-5879
Rozyglitazon SigmaR-2408
Equipment
Naczynia pokryte kolagenemBD354450talerze 10 cm
70 μ m filtr BD Falcon352350Sitko do komórek, 70 μ M Nylon 1/SZT.

Bibliografia

  1. Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
  2. Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  4. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
  5. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
  6. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
  7. Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
  8. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  9. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
  10. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
  11. Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
  12. Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
  13. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
  14. Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
  15. Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
  16. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
  17. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
  18. Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
  19. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
  20. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
  21. Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
  22. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
  23. Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
  24. Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
  25. Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
  26. Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
  27. Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

frakcja naczyniowa zstromoaizolacja adipocyt wtrawienie tkankiwysiew kom rekindukcja r nicowaniaekspresja UCP1analiza Q RT PCRWestern blottraktowanie roglitazonem

Powiązane artykuły