Angiogeneza w niedokrwiennym płucu szczura

Podsumowanie

Płuco jest perfundowane zarówno przez tętnicę oskrzelową systemową, jak i tętnice płucne. W większości patologii płuc to mniejsze uczynki układowe wykazują solidną neowaskularyzację. Zatrzymanie przepływu krwi w płucach sprzyja energicznej angiogenezie oskrzeli. Zapewniamy chirurgiczne szczegóły indukowania niedokrwienia lewej tętnicy płucnej, które sprzyja neowaskularyzacji oskrzeli.

Streszczenie

Płuco dorosłego człowieka jest perfundowane zarówno przez tętnicę oskrzelową systemową, jak i przez cały powrót żylny przepływający przez tętnice płucne. W większości patologii płuc to mniejsze ugrupowanie naczyniowe reaguje na potrzebę zwiększonej perfuzji płuc i wykazuje solidną neowaskularyzację. Wykazano, że niedokrwienie naczyń płucnych wywołane niedrożnością tętnicy płucnej powoduje szybką układową angiogenezę tętniczą u ludzi, a także w kilku modelach zwierzęcych. Chociaż histologiczna ocena przebiegu proliferacji tętnic oskrzelowych u szczurów została dokładnie opisana przez Weibela ¹, mechanizmy odpowiedzialne za ten zorganizowany wzrost nowych naczyń krwionośnych nie są jasne. Przedstawiamy szczegóły chirurgiczne indukowania niedokrwienia lewej tętnicy płucnej u szczura, które prowadzi do neowaskularyzacji oskrzeli. Kwantyfikacja zakresu angiogenezy stanowi dodatkowe wyzwanie ze względu na obecność dwóch łożysk naczyniowych w płucach. Podano metody określania funkcjonalnej angiogenezy na podstawie znakowanych iniekcji mikrosfery.

Wprowadzenie

Angiogeneza układowa w płucach jest dobrze rozpoznana. W stanach chorobowych, takich jak astma ², śródmiąższowe zwłóknienie płuc ³, rak ⁴ i przewlekła choroba zakrzepowo-zatorowa ^{płuc 5}, układowe naczynia krwionośne w płucach i otaczających je rozrastają się i atakują miąższ płucny. Jednak modele zwierzęce do badania tej zróżnicowanej aktywacji krążenia ogólnoustrojowego, a nie płucnego, są nieliczne. Być może najbardziej powtarzalnym modelem ogólnoustrojowej neowaskularyzacji w płucach dorosłego ssaka jest ten, który występuje po wywołaniu przewlekłego niedokrwienia tętnicy płucnej. Reakcją na niedrożność lewej tętnicy płucnej u ludzi ^{w wieku 5-7} lat, psów ⁸, świń ⁹, owiec ¹⁰, świnek morskich ¹¹, szczurów ^{1, 12, 13} i myszy ¹⁴ jest szybka proliferacja tętnicy oskrzelowej oraz tętnic międzyżebrowych. Mechanizmy odpowiedzialne za ogólnoustrojową neowaskularyzację płuc po niedokrwieniu płuc są w dużej mierze nieznane i nie zostały szeroko zbadane. Przebieg angiogenezy oskrzelowej u szczura po niedrożności lewej tętnicy płucnej został dokładnie opisany w pracy histologicznej Weibela ¹. Rozszerzając tę pracę na szczurach, nasze laboratorium skupiło się zarówno na czynnikach wzrostu ważnych w tym procesie, jak i na fizjologicznym wyniku tej neowaskulatury w płucach. Wyniki pokazują, że chemokina CXC CINC-3 jest podwyższona wcześnie po niedokrwieniu, a leczenie szczurów przeciwciałem neutralizującym CXCR2, receptor dla CINC-3, osłabia angiogenezę ¹³. Wykazano, że nowo utworzone unaczynienie oskrzeli 14 dni po wystąpieniu niedokrwienia płuc jest nieprawidłowe ze znacznie zwiększoną przepuszczalnością białka ¹⁵. Czynność lewego płuca nie była prawidłowa, wykazując zmniejszoną zdolność dyfuzyjną i zmniejszenie objętości płuc ¹⁵. Chociaż neowaskulatura mogła przyczynić się do zachowania tkanki płucnej podczas przewlekłego niedokrwienia płuc, wydaje się, że nie jest normalna i może przyczyniać się do trwałego pogorszenia czynności płuc.

Być może jednym z najciekawszych aspektów tego modelu jest przestrzenny rozkład proliferujących naczyń krwionośnych. Pomimo uwalniania czynników wzrostu w miąższu płucnym z powodu niedokrwienia, neowaskulatura pochodzi ze stosunkowo dużych tętnic oskrzelowych znajdujących się w górnym strumieniu. Normalna tętnica oskrzelowa powstaje jako mała gałąź z aorty i atakuje drzewo dróg oddechowych w carina. Tak więc mechanizm, za pomocą którego czynniki wzrostu indukują początkową fazę arteriogenezy, nie jest jasny. Sugerujemy, że szczur, o anatomii naczyniowej podobnej do ludzkiej, daje wyjątkową okazję do zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za angiogenezę układową podczas niedokrwienia płuc. Chociaż całkowita niedrożność lewej tętnicy płucnej jest rzadkim zjawiskiem u ludzi, zwiększone unaczynienie oskrzeli wydaje się być podobnie indukowane u pacjentów, niezależnie od miejsca i wielkości niedrożności tętnicy płucnej ¹⁶. W związku z tym przedstawiamy szczegółowy opis podejścia chirurgicznego do podwiązania lewej tętnicy płucnej u szczurów oraz sposób ilościowego określenia wielkości angiogenezy.

Protokół

Wszystkie protokoły przeprowadzone na szczurach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa oraz zgodne z wytycznymi NIH. O ile to możliwe, zwierzę powinno być chirurgicznie przygotowane w obszarze oddzielonym od obszaru operacyjnego, aby zminimalizować zanieczyszczenie pola operacyjnego.

1. Znieczulenie/analgezja

1. Miejsce szczura (samce szczurów Sprague Dawley, 125-150 g; Harlan, Indianapolis, IN) w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem.
2. Umieść znieczulonego szczura na tablicy operacyjnej przymocowanej do stożka nosowego i respiratora z 3% znieczuleniem izofluranem. Do wszystkich zabiegów używaj sterylnej techniki. Ułóż szczura, aby zapewnić sterylne pole operacyjne.

2. Intubacja

1. Unieruchomić przydatki w pozycji leżącej na plecach za pomocą taśmy chirurgicznej.
2. Usuń szczura ze stożka nosa, rozciągnij język za pomocą wyściełanych kleszczyków.
3. Użyj kawnika o rozmiarze 14 z metalowym szpilką jako prowadnicą. Wsuń za język, do tchawicy.
4. Usuń metalową szpilkę, pozostawiając białą plastikową rurkę śródkatechową w tchawicy. Upewnij się, że szczur oddycha, a powietrze przepływa przez rurkę.
5. Zastąp stożek nosowy bezpośrednim adapterem do cewnika, podłącz szczura do respiratora (90 oddechów/min; 8 ml/kg objętości oddechowej; Respirator dla gryzoni model 683, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts).
6. Nałóż maść weterynaryjną Puralube (Butler Schein, Dublin, OH) na oczy.

3. Torakotomia

1. Umieść szczura prawą stroną do dołu, unieruchomij przydatki za pomocą taśmy chirurgicznej.
2. Ogolić lewą stronę klatki piersiowej.
3. Usuń nadmiar sierści za pomocą małego podciśnienia.
4. Zrób sterylne pole, przecierając je alkoholem, a następnie wacikiem z widonu i jodu (Dynarex Corporation, Orangebur, NY). Powtórz ten proces jeszcze dwa razy (w sumie trzy peelingi).
5. Wykonaj poprzeczne nacięcie sterylnymi nożyczkami preparacyjnymi lub sterylnym skalpelem na środku pola.
6. Tępo przeciąć warstwy tkanki i tłuszczu aż do żeber (ostatnia warstwa to cienka błona pokrywająca żebra).
7. Policz żebra, aby określić 3. przestrzeń międzyżebrową.
8. Za pomocą sterylnych kleszczy Graefe 45 ° wykonaj nacięcie między 3^a 4^żebrem.
9. Włóż separatory żeber, delikatnie pociągnij, tworząc otwartą pustkę z pełną wizualizacją płuc, umieść taśmę na szwach, aby pozostały otwarte.

4. Podwiązanie lewej tętnicy płucnej

1. Za pomocą kleszczy Graefe 90 ° cofnij lewe płuco prawą ręką.
2. Używając kleszczy prostych Dumont wzór #5, chwyć lewą ręką lewą tętnicę płucną i drogi oddechowe. Lewa tętnica płucna będzie leżeć na drogach oddechowych. Upewnij się, że kleszcze są bezpośrednio prostopadłe do stołu. Dodatkowo najskuteczniejsze jest podniesienie lewej tętnicy płucnej / lewego oskrzela głównego w najbardziej dystalnym położeniu (najbliżej miąższu). Odepchnij wentylowane lewe płuco na bok za pomocą tego manewru lewą ręką.
3. Użyj kleszczyków zakrzywionych Dumont #5 45 °, aby oddzielić lewą tętnicę płucną od lewego oskrzela głównego na ich naturalnych granicach. Ta linia separacji wydaje się cienka i biała między dwiema pojedynczymi strukturami.
4. Oddzielić bezpośrednio pod tętnicą bez przechodzenia przez naczynie; płynnie przesuwaj końcówki kleszczy trzymane razem wzdłuż separacji.
5. Kontynuuj, aż końcówki kleszczy widocznie oddzielą lewą tętnicę płucną od lewego oskrzela głównego pnia. Tylko mały punkt końcówki musi być w pełni przepuszczony. Jeśli krew można uwidocznić na czubku kleszczy, oznacza to, że nie jest ona w pełni zakończona i nie należy podejmować prób podwiązania. Po przejściu przez przestrzeń lewa tętnica płucna będzie leżeć na krzywiźnie kleszczy. Przytrzymaj w tej pozycji.
6. Delikatnie zwolnij prosty, uchwyt kleszczowy (lewa ręka) i chwyć kawałek wstępnie przyciętego szwu (~ 2-3 cale; szew polipropylenowy rozmiar 6-0; Myco Medical, Cary, Karolina Północna).
7. Otwórz zakrzywione kleszcze obejmujące lewą tętnicę płucną i szew chwytający. Delikatnie przeciągnij szew przez przestrzeń między lewą tętnicą płucną a lewym oskrzelem pnia głównego ruchem w górę w stosunku do krzywizny kleszczy.
8. Zawiąż zasłaniając lewy płucny kwadratowym węzłem, ostrożnie odetnij pozostałą część szwu.
9. Zamknij żebra za pomocą kleszczyków, aby przytrzymać żebro i zszyj dwukrotnie za pomocą polipropylenu (niebieskiego monofilamentu) w rozmiarze 4-0 przymocowanego do igły do odwrotnego cięcia 19 mm, 3/8 koła (Myco Medical, Cary, NC ) w hemostacie, uważając, aby nie zszyć skóry (tylko żebra).
10. Wypełnij luźny kwadratowy węzeł, napompuj płuco, umieść dodatnie ciśnienie wydechowe (PEEP; 2-5 cmH₂O), przepompuj płuco, a następnie mocno zamocuj węzeł i wykonaj kolejny pełny węzeł przed przecięciem pozostałej części szwu. Usuń z PEEP i wizualizuj przez 30 sekund, aby upewnić się, że płuco się nie zapadnie. Zastosuj 5 kropli Bupiwakainy (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL).
11. Zamknij skórę, nakładając klej tkankowy na ranę i dociśnij skórę do siebie za pomocą tylnego końca aplikatora z bawełnianą końcówką. Podawać bupiwakainę (2,0 mg/kg podskórnie) w miejscu nacięcia, a następnie co 8 godzin przez 24 godziny lub do momentu, gdy zwierzę powróci do normalnej aktywności. Ponieważ warstwa podskórna w tym obszarze jest bardzo cienka, nie jest łatwo zszyć samodzielnie. Po nałożeniu kleju tkankowego i dociśnięciu skóry do siebie, zamyka on również warstwę podskórną.
12. Wyłącz gaz izofluranowy, ale kontynuuj wietrzenie szczura przez 1-2 minuty na powietrzu w pomieszczeniu, aż powróci dobrowolny ruch. Odłącz rurkę dotchawiczą od respiratora i upewnij się, że szczur oddycha spontanicznie przed jej usunięciem.
13. Wytrzyj Puralube z oczu bawełnianym wacikiem i monitoruj ruch i regenerację. Wstrzyknąć chlorowodorek buprenorfiny (0,05 mg/kg dootrzewnowy, Butler Schein, Dublin OH). Kontynuuj podawanie leków przeciwbólowych co 12 godzin przez 48 godzin po zabiegu.

5. Kaniulacja lewej tętnicy szyjnej

Aby ocenić wielkość perfuzji oskrzelowej niedokrwiennego lewego płuca w pożądanych punktach czasowych po podwiązaniu lewej tętnicy płucnej, wstrzyknij oznaczone mikrosfery przez lewą tętnicę szyjną do łuku aorty. Przygotuj szczury jak wyżej 1-2.

1. Przeciąć linię środkową wzdłuż szyi, tępo rozciąć, aby odsłonić tchawicę i lewą tętnicę szyjną (miejsce wstrzyknięcia mikrosfery).
2. Wprowadzić cewnik wypełniony heparynizowaną solą fizjologiczną, końcówką rurki PE20 (Becton Dickinson, Sparks MD) do naczynia podłączonego do igły 25 g, 4-kierunkowego kranu, strzykawki 1 ml.
3. Umieść butelkę z mikrosferami (15 μm szkarłatnych polistyrenowych mikrosfer fluorescencyjnych, 1 x 10⁶ kulek/ml; Invitrogen, Eugene, OR) w sonikatorze wodnym przez 30 sek.
4. Wyjąć butelkę, odwirować i pobrać 0,5 ml (500 000 mikrosferek) do szklanej strzykawki Hamilton o pojemności 1 ml (Hamilton Company, Reno, NV) za pomocą igły o wadze 20 g.
5. Podłączyć strzykawkę Hamilton do 4-kierunkowego kranu i zainfuzjować mikrosfery za pomocą pompy strzykawkowej (szybkość: 500 μl/min; Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT).
6. Wyjąć strzykawkę Hamiltona i aparat do płukania 1 ml soli fizjologicznej z heparzyzacją o stężeniu 500 μl/min.
7. Wykonaj pełną torakotomię klatki piersiowej i wykrwawij szczura, przecinając żyłę główną dolną.
8. Usuń lewe płuco i inne interesujące tkanki.
9. Aby wyekstrahować mikrosfery z tkanki, weź całe lewe płuco szczura po wykrwawieniu i umieść je w 2M KOH (4-6 ml). Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C i pozostawić na noc do trawienia tkankowego. Dodaj Tween 80 (0,25%), aby umyć kulki, wirować (10 sekund) i odwirować (2 000 obr./min; 20 °C przez 10 min). Usunąć sklarowany osad, dodać octan 2-etoksyetylu (1 ml), odstawić i odstawić na 1 godzinę. Wirować zawiesinę i odwirować (2,000 obr./min; (20 °C przez 10 min). Usunąć warstwę wodną octanu 2-etoksyetylu zawierającą fluorescencję, umieścić w kuwecie i zmierzyć za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-2500 (wzbudzenie 612/emisja 618; Digilab, Holliston, MA).

Wyniki

Odlew naczyniowy: Wyniki efektów niedokrwienia lewej tętnicy płucnej u szczura przedstawiono na Rysunku 1. Przedstawiono odlew z metakrylanu unaczynienia oskrzelowego oraz rozległe unaczynienie drzewa dróg oddechowych po lewej stronie 28 dni po LPAL. Aby uzyskać ten odlew, do unaczynienia systemowego wstrzyknięto mieszaninę metakrylanu (czerwona), wstecznie do aorty zstępującej, a tchawicę kaniulowano i wstrzyknięto do niej materiał na bazie silikonu w kolorze białym. Ten odlew naczyniowy zapewnia wyjątk...

Dyskusja

Podwiązanie lewej tętnicy płucnej u wszystkich badanych gatunków prowadzi do solidnej ogólnoustrojowej neowaskularyzacji niedokrwionego płuca. Przedstawiliśmy szczegóły dostępu chirurgicznego na modelu szczurzym. Nasze wyniki uzyskane za pomocą odlewu naczyniowego, histopatologii i znakowania in vivo pokazują, że tętnice oskrzelowe proliferują i perfundują miąższ płucny. W ten sposób mechanizmy angiogenezy oskrzeli można badać w modelu zwierzęcym, który jest równoległy do stanu ludzkiego przewlekłej choroby zak...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
chlorowodorek buprenorfiny, Puralube	Butler Schein
bupiwakaina	APP Pharmaceuticals
Wacik powidonowo-jodowy	Dynarex Corporation
polipropylenowy rozmiar 6-0, igła do odwróconego cięcia 3/8 koła	rurka Myco Medical
PE20	Becton Dickinson
15 μ m szkarłatne fluorosfery polistyrenowe	Invitrogen
1 ml Szklana strzykawka	Hamilton <
strong> Sprzęt: < / strong>
Genie Plus	Kent Scientific
	Digilab
Model 683	Aparat
Tabela 1. Tabela konkretnych odczynników i sprzętu.

szew Spektrofotometr fluorescencyjny Respirator dla gryzoni Harvarda