Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Streszczenie

Nicień Caenorhabditis elegans jest wszechstronnym organizmem modelowym do badań biomedycznych, ze względu na zachowanie genów i szlaków związanych z chorobą, a także łatwość uprawy. Opisano kilka modeli choroby C. elegans, w tym zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona (PD), która obejmuje zwyrodnienie neuronów dopaminergicznych (DA) ¹. Zarówno transgeny, jak i neurotoksyczne substancje chemiczne zostały wykorzystane do wywołania neurodegeneracji DA i wynikających z niej wad ruchowych u robaków, co pozwoliło na badania nad podstawami neurodegeneracji i badania przesiewowe pod kątem genów i związków neuroprotekcyjnych ^2,3.

Ekrany u niższych eukariontów, takich jak C. elegans, dostarczają skutecznego i ekonomicznego sposobu identyfikacji związków i genów wpływających na sygnalizację neuronalną. Konwencjonalne ekrany są zwykle wykonywane ręcznie i oceniane przez kontrolę wzrokową; W związku z tym są czasochłonne i podatne na błędy ludzkie. Ponadto większość skupia się na analizie poziomu komórkowego, ignorując lokomocję, która jest szczególnie ważnym parametrem w przypadku zaburzeń ruchowych.

Opracowaliśmy nowatorski system badań przesiewowych mikroprzepływowych (Rysunek 1), który kontroluje i określa ilościowo lokomocję C. elegans za pomocą bodźców pola elektrycznego wewnątrz mikrokanałów. Wykazaliśmy, że pole prądu stałego (DC) może silnie indukować ruch na żądanie w kierunku katody ("elektrotaksja") ⁴. Odwrócenie polaryzacji pola powoduje, że robak szybko zmienia również swój kierunek. Wykazaliśmy również, że defekty w neuronach dopaminergicznych i innych neuronach czuciowych zmieniają reakcję pływania ⁵. W związku z tym nieprawidłowości w sygnalizacji neuronalnej można określić za pomocą lokomocji jako odczytu. Reakcję ruchową można dokładnie określić ilościowo za pomocą szeregu parametrów, takich jak prędkość pływania, częstotliwość zginania ciała i czas odwrócenia.

Nasza praca wykazała, że reakcja elektrotaktyczna zmienia się wraz z wiekiem. W szczególności młodzi dorośli reagują na niższy zakres pól elektrycznych i poruszają się szybciej w porównaniu z larwami ⁴. Odkrycia te skłoniły nas do zaprojektowania nowego urządzenia mikroprzepływowego do pasywnego sortowania robaków według wieku i fenotypu ⁶.

Przetestowaliśmy również reakcję robaków na impulsowe pola elektryczne prądu stałego i przemiennego (AC). Impulsowe pola prądu stałego o różnych cyklach pracy skutecznie generowały elektrotaksję zarówno u C. elegans, jak i u jego kuzyna C. briggsae ⁷. W innym eksperymencie symetryczne pola prądu przemiennego o częstotliwościach od 1 Hz do 3 kHz unieruchomiły robaki wewnątrz kanału ⁸.

Implementacja pola elektrycznego w środowisku mikroprzepływowym umożliwia szybkie i zautomatyzowane wykonanie testu elektrotaksji. Podejście to może ułatwić wysokoprzepustowe genetyczne i chemiczne badania przesiewowe pod kątem czynników wpływających na funkcję i żywotność neuronów.

Protokół

1. Fotolitografia do produkcji form

1. Kąpać 3-calową płytkę krzemową w acetonie przez 30 sekund, a następnie w metanolu przez 30 sekund. Płukać wodą dH₂0 przez 5 minut.
2. Osusz powierzchnię wafla za pomocą pistoletu do przedmuchiwania N2. Podgrzej wafel na płycie grzejnej w temperaturze 140 °C przez 2 minuty.
3. Plazma utlenia powierzchnię płytki krzemowej (1 min, 50 W).
4. Pokryj powierzchnię płytki 3 ml fotorezystu SU-8 100 (40 sek; 1 750 obr./min).
5. Wstępnie piecz powlekaną wafel na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie zwiększ temperaturę do 95 °C w ciągu 2 minut. Utrzymuj to ustawienie....

Wyniki

Reprezentatywny film przedstawiający elektrotaksję młodego dorosłego nicienia typu dzikiego oraz wyniki analizy jego pozycji i prędkości uzyskane z oprogramowania do śledzenia nicieni przedstawiono w Supplementary Video 1 oraz na Rysunku 3. Samo oprogramowanie do analizy ruchu nie rozpoznaje kierunku polaryzacji pola ani momentu odwrócenia polaryzacji; informacje te muszą zostać pobrane z filmu źródłowego. Można to osiągnąć, wykorzystując sygnał dźwiękowy lub wizualny w filmie lub zapisu.......

Dyskusja

Wykorzystując zjawisko behawioralne po raz pierwszy opisane przez Gabela i współpracowników oraz opierając się na pracy Chuanga i współpracowników w zakresie manipulacji dielektroforetycznej ^11,12, nasz test elektrotaksji oparty na mikroprzepływach zapewnia łatwą, solidną i czułą metodę badania aktywności neuronalnej u robaków przy użyciu ruchu jako danych wyjściowych. Analiza parametrów ruchu pozwala na ilościowe porównanie różnych genotypów. Precyzja wytwarzania mikrokanalików i zastosowanie pola elektryczne.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aceton	CALEDON Labs	1200-1-30
Metanol	CALEDON Labs	6700-1-30
Izopropanol	CALEDON Labs	8600-1-40
SU-8	Microchem Corp.	Y131273	SU-8 100
SU-8 Deweloper	Microchem Corp.
92x16mm Szalka Petriego	Sarstedt	82.1473.001
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning		Zawiera bazę elastomerową i utwardzacz
Generator funkcji	Tektronix Inc.		Model AFG3022B
Wzmacniacz	Trek Inc.		Model 2210-CE
Pompa strzykawkowa	Aparat Harvard	70-4506	Model 11 ELITE
Płyta grzejna	Fisher Scientific	11675916Q	Model HP131725Q

Y020100