Method Article

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/50226

⸱

May 2nd, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, McMaster University , 2Department of Mechanical Engineering, McMaster University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicień Caenorhabditis elegans jest wszechstronnym organizmem modelowym do badań biomedycznych, ze względu na zachowanie genów i szlaków związanych z chorobą, a także łatwość uprawy. Opisano kilka modeli choroby C. elegans, w tym zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona (PD), która obejmuje zwyrodnienie neuronów dopaminergicznych (DA) 1. Zarówno transgeny, jak i neurotoksyczne substancje chemiczne zostały wykorzystane do wywołania neurodegeneracji DA i wynikających z niej wad ruchowych u robaków, co pozwoliło na badania nad podstawami neurodegeneracji i badania przesiewowe pod kątem genów i związków neuroprotekcyjnych 2,3.

Ekrany u niższych eukariontów, takich jak C. elegans, dostarczają skutecznego i ekonomicznego sposobu identyfikacji związków i genów wpływających na sygnalizację neuronalną. Konwencjonalne ekrany są zwykle wykonywane ręcznie i oceniane przez kontrolę wzrokową; W związku z tym są czasochłonne i podatne na błędy ludzkie. Ponadto większość skupia się na analizie poziomu komórkowego, ignorując lokomocję, która jest szczególnie ważnym parametrem w przypadku zaburzeń ruchowych.

Opracowaliśmy nowatorski system badań przesiewowych mikroprzepływowych (Rysunek 1), który kontroluje i określa ilościowo lokomocję C. elegans za pomocą bodźców pola elektrycznego wewnątrz mikrokanałów. Wykazaliśmy, że pole prądu stałego (DC) może silnie indukować ruch na żądanie w kierunku katody ("elektrotaksja") 4. Odwrócenie polaryzacji pola powoduje, że robak szybko zmienia również swój kierunek. Wykazaliśmy również, że defekty w neuronach dopaminergicznych i innych neuronach czuciowych zmieniają reakcję pływania 5. W związku z tym nieprawidłowości w sygnalizacji neuronalnej można określić za pomocą lokomocji jako odczytu. Reakcję ruchową można dokładnie określić ilościowo za pomocą szeregu parametrów, takich jak prędkość pływania, częstotliwość zginania ciała i czas odwrócenia.

Nasza praca wykazała, że reakcja elektrotaktyczna zmienia się wraz z wiekiem. W szczególności młodzi dorośli reagują na niższy zakres pól elektrycznych i poruszają się szybciej w porównaniu z larwami 4. Odkrycia te skłoniły nas do zaprojektowania nowego urządzenia mikroprzepływowego do pasywnego sortowania robaków według wieku i fenotypu 6.

Przetestowaliśmy również reakcję robaków na impulsowe pola elektryczne prądu stałego i przemiennego (AC). Impulsowe pola prądu stałego o różnych cyklach pracy skutecznie generowały elektrotaksję zarówno u C. elegans, jak i u jego kuzyna C. briggsae 7. W innym eksperymencie symetryczne pola prądu przemiennego o częstotliwościach od 1 Hz do 3 kHz unieruchomiły robaki wewnątrz kanału 8.

Implementacja pola elektrycznego w środowisku mikroprzepływowym umożliwia szybkie i zautomatyzowane wykonanie testu elektrotaksji. Podejście to może ułatwić wysokoprzepustowe genetyczne i chemiczne badania przesiewowe pod kątem czynników wpływających na funkcję i żywotność neuronów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fotolitografia do produkcji form

  1. Kąpać 3-calową płytkę krzemową w acetonie przez 30 sekund, a następnie w metanolu przez 30 sekund. Płukać wodą dH20 przez 5 minut.
  2. Osusz powierzchnię wafla za pomocą pistoletu do przedmuchiwania N2. Podgrzej wafel na płycie grzejnej w temperaturze 140 °C przez 2 minuty.
  3. Plazma utlenia powierzchnię płytki krzemowej (1 min, 50 W).
  4. Pokryj powierzchnię płytki 3 ml fotorezystu SU-8 100 (40 sek; 1 750 obr./min).
  5. Wstępnie piecz powlekaną wafel na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie zwiększ temperaturę do 95 °C w ciągu 2 minut. Utrzymuj to ustawienie przez dodatkową 1 godzinę.
  6. Wyrównaj fotomaskę zawierającą żądany projekt kanału. Wystaw rezystor na działanie światła UV 550-600 mJ/cm2 (350-400 nm). Fotomaski można projektować w programie AutoCAD i drukować na folii przezroczystej z drukowaniem w wysokiej rozdzielczości.
  7. Po upieczeniu wafla na gorącej płycie w temperaturze 65 °C przez 1 minutę i 95 °C przez 10 minut, zwiększając temperaturę jak poprzednio.
  8. Zanurz wafel w roztworze wywoływacza SU-8 na 10-15 minut. Sprawdź, czy zakończono wywoływanie, płucząc izopropanolem. Jeśli pojawi się biały osad, kontynuuj rozwój. Forma wzorcowa jest pokazana na rysunku 2A.

2. Miękka litografia do produkcji mikrokanałów

  1. Zmieszać 35 ml bazy elastomerowej polidimetylosiloksanu (PDMS) z 3,5 ml utwardzacza PDMS.
  2. Umieść sfabrykowaną formę wzorcową (wzorem skierowanym do góry) i pustą płytkę krzemową na szalkach Petriego wyłożonych folią aluminiową.
  3. Wlać 20 ml prepolimeru PDMS do naczynia wzorcowego i 15 ml do drugiego naczynia. Wyeliminuj kieszenie powietrzne pod waflami, delikatnie naciskając je jednorazowym drewnianym aplikatorem.
  4. Przykryj obie potrawy i odstaw na jeden dzień do wytwardzenia. Alternatywnie, w celu szybszego utwardzania, usuń pęcherzyki powietrza z PDMS za pomocą odgazowywacza próżniowego, a następnie pozostaw naczynia na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C na 2 godziny.
  5. Usuń folię i oderwij PDMS od wafli.
  6. Użyj Harris Uni-Core (2.5 mm), aby przebić porty dostępu do płynów na obu końcach kanału. Wytnij kanał i puste PDMS na paski o podobnej wielkości.
  7. Załaduj kanał, ślepy pasek PDMS i szklany szkiełko (75×25 mm2) do utleniacza plazmowego, prawdopodobnie znajdującego się w pomieszczeniu czystym. Wystaw na działanie plazmy tlenowej przez 40 sekund przy mocy 40 W.
  8. Przyklej element kanału i szklany suwak po przeciwnych stronach pustego paska. Odstawić na 2 godziny, aby zakończyć wiązanie.
  9. Umieść zespół na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C. Podłącz plastikowe rurki (średnica wewnętrzna 1/32", średnica zewnętrzna 3/32"), każda o długości co najmniej 6 cali, do dziurkowanych zbiorników za pomocą prepolimeru PDMS. Przymocuj płynny plastikowy łącznik do jednej lub obu probówek, aby umożliwić podłączenie strzykawki, lub użyj dostępnych w handlu łączników.
  10. Poczekaj, aż PDMS mocujący rurkę utwardzi się. Włóż 3-calowe odcinki izolowanego drutu miedzianego o średnicy 22 do każdego zbiornika, między rurą wlotową a kanałem i zabezpiecz prepolimerem PDMS. Gotowy produkt pokazano na rysunku 2B.

3. Eksperyment z elektrotaksją

  1. Umieść mikrokanalik na stoliku (najlepiej ruchomym XY) mikroskopu z zamontowaną kamerą podłączoną do monitora (rysunek 1).
  2. Podłącz zasilacz lub amplifier przewody wyjściowe do elektrod mikrokanału. Prosty zasilacz prądu stałego jest wystarczający, jeśli pożądany jest tylko sygnał DC, ale wzmacniacz podłączony do generatora funkcyjnego umożliwia również zastosowanie impulsowych sygnałów DC i AC.
  3. Podłącz rurkę wyjściową mikrokanału do jednorazowej strzykawki. Zanurzyć wylot rurki wlotowej w buforze fizjologicznym M9 i delikatnie zassać płyn do kanału, przykładając podciśnienie wewnątrz strzykawki (ręcznie lub za pomocą pompy strzykawkowej). Gdy rurki wlotowe i wylotowe są napełnione M9, odłączyć strzykawkę od rurki. Wypoziomuj obie rury na tej samej wysokości, aby zapobiec przepływowi napędzanemu hydrostatycznie.
  4. Przyłóż napięcie stałe do kanału i upewnij się, że rezystancja (R= V/I) wynosi około 0,6 MΩ (dla mikrokanału o długości 50 mm, szerokości 0,3 mm i głębokości ~0,1 mm).
  5. Jeśli jesteś zadowolony z integralności kanału, wykonaj powyższe kroki, aby załadować robaki z rozcieńczonej zawiesiny do kanału.
  6. Odłączyć strzykawkę i hydrostatycznie manipulować przepływem, regulując względną wysokość rurek. Użyj tej metody, aby umieścić robaka na środku kanału, a następnie ułóż obie rurki płasko na tej samej wysokości.
  7. Ustaw zasilanie na odpowiednie napięcie: 4-12 V/cm dla zwierząt w stadium L3, 4-10 V/cm dla L4 i 2-4 V/cm dla młodych dorosłych. Aktywuj sygnał elektryczny i pozwól robakowi na 1 minutę wstępnej ekspozycji zaaklimatyzować się w terenie. Robak powinien zacząć poruszać się w kierunku katody. Po upływie minuty użyj aparatu, aby rozpocząć nagrywanie.
  8. W przypadku eksperymentów z prądem przemiennym i impulsowym prądem stałym można przyjąć maksymalne czułe pole elektryczne od góry, a częstotliwość i cykl pracy sygnału można modulować zgodnie z potrzebami 7, 8.
  9. Po zakończeniu eksperymentu usuń cały płyn (i robaki) z kanału, przepłucz go dH20 i pozostaw urządzenie na gorącej płycie w temperaturze 125 °C do wyschnięcia.
  10. Wyodrębnij dane lokomotoryczne z nagranych filmów ręcznie za pomocą NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) lub niestandardowego oprogramowania do śledzenia robaków opartego na MATLAB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywny film przedstawiający elektrotaksję młodego dorosłego nicienia dzikiego typu oraz jego pozycję i prędkość z oprogramowania do śledzenia robaków są pokazane na Dodatkowym Filmie 1 i Rysunku 3. Samo oprogramowanie do analizy ruchu nie rozpoznaje kierunku polaryzacji pola i czasu odwrócenia polaryzacji; Zamiast tego informacje te należy uzyskać ze źródłowego filmu wideo. Można to zrobić za pomocą wskazówek dźwiękowych lub wizualnych w filmie lub zapisać warunki eksperymentu i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystując zjawisko behawioralne po raz pierwszy opisane przez Gabela i współpracowników oraz opierając się na pracy Chuanga i współpracowników w zakresie manipulacji dielektroforetycznej 11,12, nasz test elektrotaksji oparty na mikroprzepływach zapewnia łatwą, solidną i czułą metodę badania aktywności neuronalnej u robaków przy użyciu ruchu jako danych wyjściowych. Analiza parametrów ruchu pozwala na ilościowe porównanie różnych genotypów. Precyzja wytwarzania mikrokanalików i zastosowanie pola elektryczne...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia elektrotaksji mikroprzepływowej została zgłoszona do opatentowania w Stanach Zjednoczonych Ameryki i Kanadzie.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Kanadyjskiej Radzie ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych, Programowi Kanadyjskich Katedr Badawczych, Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem oraz Ministerstwu Badań i Innowacji Ontario za wsparcie finansowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonCALEDON Labs1200-1-30
MetanolCALEDON Labs6700-1-30
IzopropanolCALEDON Labs8600-1-40
SU-8Microchem Corp.Y131273SU-8 100
SU-8 DeweloperMicrochem Corp.
92x16mm Szalka PetriegoSarstedt82.1473.001
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow CorningZawiera bazę elastomerową i utwardzacz
Generator funkcjiTektronix Inc.Model AFG3022B
WzmacniaczTrek Inc.Model 2210-CE
Pompa strzykawkowaAparat Harvard70-4506Model 11 ELITE
Płyta grzejnaFisher Scientific11675916QModel HP131725Q
Y020100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
  2. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
  3. Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
  4. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
  5. Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
  6. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
  7. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116(2011).
  8. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702(2010).
  9. van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027(2008).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
  12. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
  13. Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5(2005).
  14. Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ElectrotaxisC Elegans LocomotionElectric Field StimulationMicrochannel DesignPDMS MoldingWorm Tracking SoftwareSwimming Speed AnalysisBody Bend FrequencyReversal Time MeasurementNeurodegenerative Disorder Screening

Related Articles