Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Podsumowanie

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka. Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Streszczenie

Odtworzenie kanałów jonowych w chemicznie zdefiniowanych błonach lipidowych w celu zapisu elektrofizjologicznego było potężną techniką identyfikacji i badania funkcji tych ważnych białek. Jednak klasyczne preparaty, takie jak dwuwarstwy płaskie, ograniczają manipulacje i eksperymenty, które można przeprowadzić na odtworzonym kanale i jego środowisku błonowym. Bardziej przypominająca komórkę struktura gigantycznych liposomów pozwala na tradycyjne eksperymenty z klamrą bez poświęcania kontroli nad środowiskiem lipidowym.

Elektroformacja to skuteczny sposób na wytwarzanie gigantycznych liposomów o średnicy >10 μm, który polega na przyłożeniu zmiennego napięcia do cienkiego, uporządkowanego filmu lipidowego osadzonego na powierzchni elektrody. Ponieważ jednak klasyczny protokół wymaga osadzania lipidów z rozpuszczalników organicznych, nie jest on kompatybilny z mniej wytrzymałymi białkami błonowymi, takimi jak kanały jonowe, i musi zostać zmodyfikowany. Ostatnio opracowano protokoły elektroformowania gigantycznych liposomów z częściowo odwodnionych małych liposomów, które w naszym laboratorium dostosowaliśmy do liposomów zawierających białka.

Prezentujemy tutaj tło, sprzęt, techniki i pułapki elektroformacji gigantycznych liposomów z małych dyspersji liposomów. Zaczynamy od klasycznego protokołu, który należy opanować przed przystąpieniem do bardziej wymagających protokołów, które następują. Przedstawiono proces kontrolowanego częściowego odwodnienia małych liposomów za pomocą równowagi parowej z nasyconymi roztworami soli. Na koniec demonstrujemy sam proces elektroformacji. Opiszemy proste, niedrogie urządzenia, które można wykonać we własnym zakresie w celu produkcji wysokiej jakości liposomów, a także opiszemy oględziny preparatu na każdym etapie, aby zapewnić najlepsze rezultaty.

Wprowadzenie

Gigantyczne liposomy (często nazywane gigantycznymi pęcherzykami jednowarstwowymi lub GUV) były głównie używane do badania fizyki i chemii fizycznej dwuwarstw lipidowych, w tym do badań deformacji dwuwarstw, współistnienia faz bocznych ("tratwy"), fuzji błonowej, itp. ^1-4. Mają one strukturę bardzo podobną do komórki: kulistą powłokę błony otaczającą wodne wnętrze, które można łatwo odróżnić od otaczającego go wodnego buforu. Z definicji mają średnicę ≈1-100 μm, dzięki czemu można je obrazować przy użyciu różnych metod mikroskopii świetlnej. Mogą być napięte za pomocą gradientów osmotycznych lub mechanicznie przyłożonego naprężenia, dzięki czemu choć na ogół miękkie, ich właściwościami można manipulować w celu łatwej obsługi. W szczególności kontrolowanie "sztywności" liposomu ułatwia tworzenie "przyczepionych do liposomów" lub wyciętych plam do elektrofizjologii. W przeszłości rekonstytucja kanałów jonowych była w dużej mierze wykonywana w płaskich dwuwarstwach lipidowych. Obecnie zdolność do tworzenia plam z gigantycznych liposomów i korzystania ze znacznego kołczanu narzędzi opracowanych dla konwencjonalnej elektrofizjologii (mikroskopia fluorescencyjna, aspiracja mikropipet, szybka perfuzja i kontrola temperatury itp.) sprawia, że gigantyczne liposomy stają się coraz bardziej atrakcyjne do badań nad rekonstytucją^5,6.

Gigantyczne liposomy powstały dzięki wielu strategiom. W rzeczywistości gigantyczne liposomy tworzą się spontanicznie w procesie pęcznienia, gdy wysuszony film lipidowy jest ponownie uwodniony^4,7,8. Chęć szybszego przygotowania większych, bardziej jednorodnych liposomów skłoniła naukowców do innych podejść, z których najważniejszym było elektroformowanie^1,9. Elektroformacja również opiera się na uwodnieniu wysuszonego filmu lipidowego, ale przyspiesza ten proces poprzez zastosowanie oscylującego pola elektrycznego w poprzek filmu lipidowego. Pole jest podawane przez dwie elektrody, druty platynowe lub szkiełka szkiełkowe pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO), oddzielone wodą lub buforem i na których osadza się lipidy. Przyspieszając pęcznienie liposomów, osiąga się wyższą wydajność większych liposomów. W ten sposób elektroformacja stała się domyślną metodą wytwarzania gigantycznych liposomów⁴.

Mechanizm elektroformacji nie jest w pełni zrozumiały, a większość protokołów jest rozwijana empirycznie (np. ^10,11). Niemniej jednak możemy dowiedzieć się trochę o tym, czego się spodziewać, biorąc pod uwagę teorię i niektóre wyniki empiryczne. Powszechnie uważa się, że elektroformacja zachodzi poprzez sterowanie elektroosmotycznym przepływem buforu między poszczególnymi dwuwarstwami lipidowymi ułożonymi w osadzonym filmie lipidowym^10,11. Prawdopodobnie w grę wchodzi również sprzężenie elektrostatyczne z fluktuacjami termicznymi dwuwarstw lipidowych¹². Hipotezy te jakościowo przewidują górne granice częstotliwości i natężenia pola elektrycznego, które można zastosować^10,12. W szczególności przewiduje się, że roztwory o wysokiej przewodności (tj. fizjologiczne roztwory soli) zmniejszają siły elektrohydrodynamiczne, które mogą inicjować elektrotworzenie liposomów¹². Natężenia przepływu elektroosmotycznego na ogół zmniejszają się wraz ze wzrostem stężenia soli i często osiągają szczyt przy pewnej częstotliwości oscylacji pola elektrycznego (np. choć w innej geometrii, Green i wsp.¹³). Tak więc wyższe natężenie pola i wyższe częstotliwości są rozsądne dla roztworów o wysokiej przewodności, w granicach¹⁰.

Jednakże, białka błonowe mogą być niezgodne z tradycyjną metodą osadzania lipidów na elektrodach podczas procedury elektropęcznienia, a mianowicie w rozpuszczalnikach organicznych, które są następnie odparowywane, aby pozostawić cienki film lipidowy. Istnieją dwie główne drogi obejścia tej trudności: włączenie białek po utworzeniu gigantycznych liposomów lub dostosowanie sposobu odkładania lipidów. Nasze podejście opiera się na innych^5,11 w celu zdeponowania lipidów i odtworzonego białka błonowego razem z zawiesiny małych lub dużych "proteoliposomów". Opisujemy długi i bardziej wymagający proces wytwarzania proteoliposomów z oczyszczonych białek i lipidów w innym miejscu (Collins i Gordon, w przeglądzie). Tutaj opisujemy protokół w przypadku braku jakiegokolwiek białka, ale jest on taki sam, gdy białko jest włączone; dołączamy wyniki pokazujące, że proteoliposomy zawierające kanał jonowy TRPV1 mogą być przekształcane w GUV i wykorzystywane do elektrofizjologii patch-clamp. W każdym podejściu do elektroformacji kontrola wzrokowa próbki lipidów podczas procesu osadzania lipidów ma kluczowe znaczenie dla sukcesu.

Nasze podejście może być istotne poza specjalistycznym zastosowaniem do odtwarzania kanałów jonowych. W czasie, który upłynął od czasu opracowania tego protokołu i obecnie, wykazano również, w jaki sposób sposób, w jaki lipidy są osadzane na elektrodach w celu elektroformacji, wpływa na niejednorodność składu powstałych GUV. Baykal-Caglar i wsp.¹⁴ wykazało, że GUV utworzone ze starannie odwodnionych liposomów miały 2,5 razy mniejszą zmienność temperatury mieszalności GUV utworzonych z mieszanin różnych fosfolipidów i cholesterolu. Ich praca wskazuje, że lipidy, a zwłaszcza cholesterol, mogą wytrącać się z mieszaniny lipidów po zdeponowaniu z rozpuszczalników organicznych, co powoduje duże przestrzenne zróżnicowanie składu zdeponowanego filmu lipidowego. Jest to szczególnie ważne dla badań nad zachowaniem fazy błony lipidowej, ale może mieć również kluczowe znaczenie dla eksperymentów ilościowych dotyczących funkcji kanałów jonowych. Baykal-Caglar i wsp." Protokół jest podobny, ale nie identyczny z naszym, a czytelnicy są zachęcani do jego studiowania.

Ten protokół (zobacz przegląd, Rysunek 1) jest jednym z wielu, które mogłyby być użyte. Zasadniczo powodzenie elektroformacji zależy od mieszaniny lipidów, hydratacji, temperatury, innych substancji rozpuszczonych (zwłaszcza jonów) i oczywiście napięcia i częstotliwości użytych do formacji. W miarę jak elektroformacja staje się coraz lepiej rozumiana, spodziewamy się jeszcze bardziej udoskonalić nasz protokół.

Na koniec, często występuje stroma krzywa uczenia się w gigantycznych liposomach do elektroformowania. Sugerujemy opanowanie konwencjonalnego protokołu (sekcje 1 i 4 oraz, jeśli to konieczne, sekcja 5) przed nauczeniem się deponowania lipidów z zawiesin liposomalnych (sekcje 2-5).

Protokół

1. Osadzanie lipidów z rozpuszczalników organicznych: Klasyczny protokół

1. Usunąć lipidy z magazynu w temperaturze -20 °C lub -80 °C; ogrzać do temperatury słonecznej. Uwaga: lipidy są wyjątkowo higroskopijne, a wiele z nich jest wrażliwych na tlen. Pokryj lipidy suchym argonem lub azotem i na wszystkich etapach zminimalizuj narażenie na działanie powietrza.
2. Jeśli to konieczne, zawiesić lipidy w chloroformie lub cykloheksanie w stężeniu 1-10 mg/ml; należy pamiętać, że podane przez producenta stężenia są zazwyczaj tylko nominalne. UWAGA: Podczas stosowania rozpuszczalników organicznych należy nosić odpowiednie rękawice i inne środki ochrony osobistej. W przypadku rozlania na nie rozpuszczalnika należy szybko zdjąć środki ochrony indywidualnej, ponieważ większość materiałów jest nadal przepuszczalna dla tych rozpuszczalników i zapewniają one tylko tymczasową ochronę.
3. Wyczyść obie strony dwóch szkiełek szklanych z powłoką ITO o wymiarach 25 x 37,5 mm za pomocą etanolu
4. Wymieszaj lipidy, aby uzyskać pożądane proporcje molowe. Na każde 1^cm2 powierzchni szkiełek ITO, które mają być pokryte lipidem, należy wymieszać ~15-20 μg lipidów. Na przykład, jeśli oba szkiełka o wymiarach 25 x 37,5 mm miałyby być w pełni pokryte, zwykle używalibyśmy 30 μl mieszaniny lipidów o stężeniu 10 mg/ml. Uwaga: dodać 0,1% mol Texas Red-DPPE do obrazowania fluorescencyjnego i zapoznać się z poniższymi ostrzeżeniami dotyczącymi barwników fluorescencyjnych.
5. Sprawdź, czy strona szkiełek pokryta ITO jest skierowana do góry, mierząc rezystancję powierzchniową za pomocą omomierza lub multimetru.
6. Odessać lipidy do strzykawki odpornej na działanie rozpuszczalników. ostrożność: Żadne kleje ani tworzywa sztuczne, inne niż PTFE, nie powinny mieć kontaktu z rozpuszczalnikiem organicznym.
7. Gdy igła strzykawki nie dotyka całkowicie powierzchni ITO, powoli nakładaj lipid, przesuwając igłę w przód iw tył po szkiełku. Pokryj powierzchnię tak równomiernie, szukając "tęczowego połysku" na szklanej powierzchni.
8. Umieść szkiełka szybko pod < 1 torr (1 mmHg) próżnię na 0,5-1 godziny, aby usunąć wszelkie śladowe ilości rozpuszczalnika. Uwolnić próżnię za pomocą gazu obojętnego.
9. Nałożyć silikonową uszczelkę z cienką warstwą silikonowego smaru próżniowego po obu stronach. Pozostaw co najmniej 5 mm odkrytego szkiełka odsłoniętego odsłoniętego na jednym końcu szkiełka.
10. Przejdź natychmiast do sekcji 4.

2. Preparat do małego liposomu do kontrolowanego odwodnienia

1. Przygotować mieszaninę lipidów jak w krokach 1.1-1.4.
2. Wysuszyć lipidy za pomocą strumienia argonu lub azotu w probówce hodowlanej o średnicy 10-15 mm. W przypadku małych ilości lipidów, ≤0,5 mg, powstały film można uwodnić bezpośrednio po umieszczeniu go w próżni na 0,5-1 godziny w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika; Przejdź do kroku 2.5. Większe ilości lipidów mają tendencję do zatrzymywania rozpuszczalników organicznych w gęstym żelu, nawet w próżni, i są lepiej przygotowywane przez liofilizację; Zobacz kroki 2.3-4.
3. Zawiesić wysuszony film lipidowy w cykloheksanie, pokryć argonem i zamknąć korkiem, umieścić probówkę w zimnym bloku i zamrażać w temperaturze -80 °C przez minimum 1 godzinę.
4. Umieścić zimny blok i próbkę lipidów w układzie próżniowym zdolnym do osiągnięcia 100 mTorr. Zastosuj próżnię; "zatrzyma się" na około 1 Torr, gdy rozpuszczalnik sublimuje. Po całkowitym usunięciu rozpuszczalnika (~1 godzina) próżnia spadnie poniżej tego poziomu. Uwolnić próżnię gazem obojętnym i natychmiast uszczelnić rurkę lub uwodnić.
5. Podczas gdy lipidy są pod próżnią, odgazowuj bufor hydratacyjny za pomocą próżni i spryskiwania^15-17.
6. Uwodnić lipidy za pomocą odgazowanego buforu o końcowym stężeniu 1-10 mg/ml. Pozwól lipidom powoli się uwodnić. Po 30 min-1 godz. przeprowadź wir, aby rozbić pozostałe grudki. Odczekaj dodatkowe 0,5-1 godziny, aby zapewnić pełne nawodnienie. Użyj środka osmotycznego, takiego jak sorbitol lub sacharoza do 200 mM, aby zapobiec całkowitemu odwodnieniu w poniższych krokach.
7. Przygotuj liposomy o średnicy 100-200 nm przez wytłaczanie. Szczegółowe informacje można znaleźć w protokole wytłaczania producenta. Należy pamiętać, że bufor musi mieć siłę jonową mniejszą niż ~25 mM, w przeciwnym razie potrzebne będą specjalne protokoły napięcia elektroformacji w sekcji 4.

3. Odkładanie lipidów przez kontrolowane odwodnienie małych liposomów

1. Uwaga: Nasz protokół wymaga, aby lipidy były umieszczone w równowadze parowej z nasyconymi roztworami soli przez wiele godzin. Zdecydowanie zalecamy wykonanie protokołu w atmosferze gazu obojętnego, przy użyciu schowka rękawicowego lub podobnej obudowy.
2. Uwaga: Przygotowując próbki zawierające białka, unikaj całkowitego odwodnienia. Nawodnij atmosferę w dowolnej obudowie za pomocą zlewki z ciepłą wodą lub nawilżacza opartego na sonikatorze. Użyj higrometru, aby upewnić się, że wilgotność względna wynosi co najmniej 30%. Użyj sorbitolu lub sacharozy w małym buforze liposomowym jako dodatkowy środek ostrożności, aby zapobiec całkowitemu odwodnieniu.
3. Przygotować nasycony roztwór soli o odpowiedniej wilgotności względnej. Wilgotność docelowa zależy od osmolarności preparatu pęcherzykowego. W przypadku preparatów o fizjologicznej wilgotności względnej należy stosować 30-45% wilgotności względnej, podczas gdy preparaty pęcherzykowe o niskiej osmolarności można odpowiednio odwodnić w równowadze z wilgotnością względną 75-90% (patrz również tabela 1).
4. Nasycony roztwór soli i nadmiar soli umieść w szczelnie zamykanym pojemniku z wewnętrzną półką. Bardzo dobrze sprawdzają się komercyjne pojemniki na jogurt i granolę. Po napełnieniu wymień półkę i upewnij się, że płyn znajduje się 5-10 mm poniżej półki.
5. Wyczyść szkiełka z powłoką ITO, jak w rozdziale 1. Użyj multimetru, aby określić, która strona jest przewodząca, i oznacz stronę nieprzewodzącą nazwą próbki.
6. Lekko nasmaruj obie strony silikonowej (USP Grade VI) uszczelki (uszczelek) z jednym lub wieloma otworami.
7. Umieść szkiełka przewodzącą stroną do góry na stole i nałóż silikonową uszczelkę (uszczelki) na każde szkiełko, na które zostanie nałożony lipid, upewniając się, że na jednym końcu znajduje się co najmniej 5 mm odsłoniętego szkiełka, które można podłączyć do aparatu do elektroformacji. Wygładź uszczelkę, aby zapewnić dobre uszczelnienie.
8. Rozcieńczyć preparat pęcherzykowy w buforze izosmotycznym o niskiej zawartości soli do ~1-2 mg/ml. Okazuje się, że wyższe stężenia dają słabe wyniki.
9. Nałóż lipid na szkiełko w kroplach 1-10 μl. Mniejsze krople na ogół dają lepsze rezultaty.
10. Umieść szkiełko na wewnętrznej półce nad nasyconym roztworem soli i szczelnie zamknij pojemnik. Wyjazd w RT na 3 godziny do O/N. Pojemnik można umieścić w temperaturze 4 °C, ale należy pamiętać, że w przypadku niektórych soli wilgotność względna zależy silnie od temperatury, a zimno wydłuży czas równowagi.
11. Powstały film może mieć lekki tęczowy połysk, ale w każdym razie powinien wyglądać na prawie wysuszony. Wysoce osmotyczne roztwory wyjściowe mogą być niemożliwe do całkowitego wyschnięcia do filmu lipidowego; Nie wpłynie to negatywnie na wyniki.

4. Elektroformacja gigantycznych liposomów

1. Filmy lipidowe, zwłaszcza te powstałe z odwodnionych liposomów, łatwo się usuwają. Ostrożnie nawodnij każdą studzienkę, umieszczając igłę strzykawki o strzykawce 27 G na krawędzi uszczelki i powoli nakładając bufor. mogą zawierać wodę, ≤200 mM sacharozy, ≤1 M sorbitolu i ≤5 mM HEPES. Roztwór soli o stężeniu większym niż 10 mM może wymagać alternatywnych protokołów napięcia galwanizacji. Przepełnij dobrze każdą uszczelkę o ~10%.
2. Uwaga: po uwodnieniu lipidów szybko przejdź przez pozostałe kroki, ponieważ filmy lipidowe zaczynają się natychmiast rozwarstwiać. Wydajność i wielkość są maksymalizowane, jeśli elektroformacja rozpocznie się szybko.
3. Jednym płynnym ruchem nałóż drugi szkiełko ITO, przewodząc od wewnątrz do wewnątrz, na górną część uszczelki. Upewnij się, że co najmniej 5 mm zwisu znajduje się poza obszarem uszczelki i naprzeciwko pierwszego zwisu. Delikatnie dociśnij, aby zapewnić dobre uszczelnienie.
4. Oczyść dwa zwisy za pomocą etanolu i sprawdź, czy boki skierowane w stronę uszczelki przewodzą prąd z multimetrem.
5. W razie potrzeby komorę można dodatkowo zabezpieczyć za pomocą parafilmu lub lekkich klipsów sprężynowych naciągowych.
6. Podłącz komorę galwanoformacyjną do źródła napięcia, zabezpieczając pręty aluminiowe lub miedziane, "piankę uszczelniającą EMI" lub przewodzącą taśmę klejącą do przewodzących powierzchni dwóch szkiełek. Używamy pianki uszczelniającej EMI. Plany przyrządu i zacisku pokazano na rysunku 5.
7. Sprawdź, czy nie ma zwarcia elektrycznego między stykami i czy styki są prawidłowo połączone z powierzchniami ITO za pomocą multimetru.
8. Podgrzać komorę o 10 °C powyżej najwyższej temperatury topnienia spośród wszystkich obecnych lipidów; np. w przypadku DPPC podgrzać co najmniej do 52 °C, 10 °C powyżej temperatury topnienia łańcucha wynoszącej 42 °C.
9. W przypadku o niskiej zawartości soli należy zastosować falę sinusoidalną 10 Hz, ~0,7 V_rms na każdy milimetr przerwy między dwiema powierzchniami pokrytymi ITO, przez 60-90 minut. W przypadku o wysokiej zawartości soli należy stosować inne protokoły napięciowe (patrz referencje).

5. Obrazowanie i rozwiązywanie problemów

1. Zobrazuj liposom za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w kostkę filtrującą do barwników Rhodamine lub Texas Red. Liposom powinien być kulisty, przeważnie jednopłytkowy na oko i wolny od wad, takich jak "sznurki" zwisające z liposomu.
2. Jeśli liposomy są zbyt małe, użyj mniej lipidów.
3. Jeśli występuje wiele wad lub niewiele liposomów, może to być spowodowane lipidami w fazie żelowej. Rozważ podniesienie temperatury elektroformacji.
4. Jeśli z odwodnionych małych liposomów powstało niewiele gigantycznych liposomów lub nie ma ich wcale, zmniejsz siłę osmotyczną buforu liposomowego lub zwiększ siłę osmotyczną buforu elektroformacyjnego. Wlew buforu do stężonego śródmiąższowego roztworu buforowego może spowodować rozwarstwienie zdeponowanego filmu lipidowego.
5. Jeśli wydajność, jakość lub rozmiar pęcherzyków jest niska, a do elektroformacji lub liposomów włączono sole lub pH, rozważ alternatywne protokoły napięcia elektroformacji. Na przykład Pott i wsp.¹¹, zaleca trzyetapowy protokół przy użyciu fali sinusoidalnej 500 Hz, podnosząc napięcie z 50-1,300 Vpp / m przez 30 minut, utrzymując przez 90 minut, a następnie zmniejszając częstotliwość do 50 Hz w ciągu 30-60 minut. W takim przypadku mogą być potrzebne elektrody platynowe lub tytanowe, ale nie zmieni to zasadniczo protokołu.

Wyniki

W naszych przykładach przygotowujemy liposomy z mieszaniny składającej się z około 55 mol% POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholine), 15 mol% POPS (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphoserine), 30 mol% cholesterolu oraz 0,1 mol% Texas Red-labeled 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoethanolamine (TxR-DPPE). Skład ten wybrano jako reprezentatywny dla lipidów zwojów korzeni grzbietowych¹⁸. Zauważamy, że 15 mol% lipidów naładowanych (w tym przypadku POPS) jest bliskie granicy tego, c...

Dyskusja

Elektroformacja gigantycznych liposomów przekształciła się w elastyczną technikę kompatybilną z różnymi lipidami, preparatami i. Dokładna kontrola procesu odkładania się lipidów ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Przedstawiliśmy proste narzędzia, dzięki którym kontrolowane osadzanie lipidów z małych preparatów liposomowych staje się prostym procesem. Wilgotność względna ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego odwodnienia początkowych liposomów, a optymalna wartość będzie się różnić w zależności od początkowego stężenia su...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Multimetr cyfrowy	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A lub podobny	Każdy multimetr będzie dobry, ale unikaj omomierzy analogowych starego typu, które przykładają znacznie większy prąd do testowanej rezystancji.
	Fluke	117 lub 177	Każdy multimetr będzie odpowiedni, ale unikaj omomierzy analogowych starego typu, które przykładają znacznie większy prąd do testowanej rezystancji.
Generator funkcyjny	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A lub podobny	Większość generatorów funkcyjnych działa dla prostych protokołów. Ten programowalny model jest przydatny w zaawansowanych protokołach elektroformacji. Upewnij się, że generator może napędzać 10 V od szczytu do szczytu do 50 Ω załaduj
szkiełka szklane powlekane ITO	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 lub podobne	Przełam je na pół, aby utworzyć dwie prowadnice, 25 mm x 37 mm
Regulator temperatury	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 lub podobny
Higrometr	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Arkusz kauczuku silikonowego	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Użyj silikonu USP Grade VI dla jego
uszczelki EMI	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 lub podobne	Dystrybuowane przez Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Dostępne są inne fluorescencyjnie znakowane lipidy, ale TxR-DHPE jest jednym z najjaśniejszych i najbardziej fotostabilnych.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P lub 850457C	Lipidy można zamówić w postaci proszku (P) lub chloroformu (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667

o wysokiej czystości