Artykuł metodologiczny

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

DOI:

10.3791/50227

⸱

21 czerwca 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka. Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odtworzenie kanałów jonowych w chemicznie zdefiniowanych błonach lipidowych w celu zapisu elektrofizjologicznego było potężną techniką identyfikacji i badania funkcji tych ważnych białek. Jednak klasyczne preparaty, takie jak dwuwarstwy płaskie, ograniczają manipulacje i eksperymenty, które można przeprowadzić na odtworzonym kanale i jego środowisku błonowym. Bardziej przypominająca komórkę struktura gigantycznych liposomów pozwala na tradycyjne eksperymenty z klamrą bez poświęcania kontroli nad środowiskiem lipidowym.

Elektroformacja to skuteczny sposób na wytwarzanie gigantycznych liposomów o średnicy >10 μm, który polega na przyłożeniu zmiennego napięcia do cienkiego, uporządkowanego filmu lipidowego osadzonego na powierzchni elektrody. Ponieważ jednak klasyczny protokół wymaga osadzania lipidów z rozpuszczalników organicznych, nie jest on kompatybilny z mniej wytrzymałymi białkami błonowymi, takimi jak kanały jonowe, i musi zostać zmodyfikowany. Ostatnio opracowano protokoły elektroformowania gigantycznych liposomów z częściowo odwodnionych małych liposomów, które w naszym laboratorium dostosowaliśmy do liposomów zawierających białka.

Prezentujemy tutaj tło, sprzęt, techniki i pułapki elektroformacji gigantycznych liposomów z małych dyspersji liposomów. Zaczynamy od klasycznego protokołu, który należy opanować przed przystąpieniem do bardziej wymagających protokołów, które następują. Przedstawiono proces kontrolowanego częściowego odwodnienia małych liposomów za pomocą równowagi parowej z nasyconymi roztworami soli. Na koniec demonstrujemy sam proces elektroformacji. Opiszemy proste, niedrogie urządzenia, które można wykonać we własnym zakresie w celu produkcji wysokiej jakości liposomów, a także opiszemy oględziny preparatu na każdym etapie, aby zapewnić najlepsze rezultaty.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gigantyczne liposomy (często nazywane gigantycznymi pęcherzykami jednowarstwowymi lub GUV) były głównie używane do badania fizyki i chemii fizycznej dwuwarstw lipidowych, w tym do badań deformacji dwuwarstw, współistnienia faz bocznych ("tratwy"), fuzji błonowej, itp. 1-4. Mają one strukturę bardzo podobną do komórki: kulistą powłokę błony otaczającą wodne wnętrze, które można łatwo odróżnić od otaczającego go wodnego buforu. Z definicji mają średnicę ≈1-100 μm, dzięki czemu można je obrazować przy użyciu różnych metod mikroskopii świetlnej. Mogą być napięte za pomocą gradientów osmotycznych lub mechanicznie przyłożonego naprężenia, dzięki czemu ch....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Osadzanie lipidów z rozpuszczalników organicznych: Klasyczny protokół

  1. Usunąć lipidy z magazynu w temperaturze -20 °C lub -80 °C; ogrzać do temperatury słonecznej. Uwaga: lipidy są wyjątkowo higroskopijne, a wiele z nich jest wrażliwych na tlen. Pokryj lipidy suchym argonem lub azotem i na wszystkich etapach zminimalizuj narażenie na działanie powietrza.
  2. Jeśli to konieczne, zawiesić lipidy w chloroformie lub cykloheksanie w stężeniu 1-10 mg/ml; należy pamiętać, że podane przez producenta stężenia są zazwyczaj tylko nominalne. UWAGA: Podczas stosowania rozpuszczalników organicznych należy nosić odpowiednie rękawice ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszych przykładach przygotowujemy liposomy z mieszaniny składającej się z około 55 mol% POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocholiny), 15 mol% POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfoseryny), 30 mol% cholesterolu oraz 0,1 mol% 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolaminy znakowanej Texas Red (TxR-DPPE). Skład ten wybrano jako reprezentatywny dla lipidów zwojów korzeni grzbietowych18. Zauważamy, że 15 mol% lipidów naładowanych (w tym przypadku POPS) znajduje się blisko granicy tego.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroformacja gigantycznych liposomów przekształciła się w elastyczną technikę kompatybilną z różnymi lipidami, preparatami i. Dokładna kontrola procesu odkładania się lipidów ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Przedstawiliśmy proste narzędzia, dzięki którym kontrolowane osadzanie lipidów z małych preparatów liposomowych staje się prostym procesem. Wilgotność względna ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego odwodnienia początkowych liposomów, a optymalna wartość będzie się różnić w zależności od początkowego stężenia su.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Bryanowi Venemie i Ericowi Martinsonowi za skonstruowanie urządzenia do elektroformacji. Praca ta została sfinansowana z grantów Narodowych Instytutów Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (R01GM100718 SEG) oraz Narodowego Instytutu Oka Narodowych Instytutów Zdrowia (R01EY017564 SEG).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Multimetr cyfrowyAgilent Technologies, www.agilent.comU1232A lub podobnyKażdy multimetr będzie dobry, ale unikaj omomierzy analogowych starego typu, które przykładają znacznie większy prąd do testowanej rezystancji.
Fluke117 lub 177Każdy multimetr będzie odpowiedni, ale unikaj omomierzy analogowych starego typu, które przykładają znacznie większy prąd do testowanej rezystancji.
Generator funkcyjnyAgilent Technologies, www.agilent.com33210A lub podobnyWiększość generatorów funkcyjnych działa dla prostych protokołów. Ten programowalny model jest przydatny w zaawansowanych protokołach elektroformacji. Upewnij się, że generator może napędzać 10 V od szczytu do szczytu do 50 Ω załaduj
szkiełka szklane powlekane ITODelta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.comCB-90IN-S107 lub podobnePrzełam je na pół, aby utworzyć dwie prowadnice, 25 mm x 37 mm
Regulator temperaturyOmega Engineering Stamford, CT www.omega.com CNi3233 lub podobny
HigrometrExtech, Nashua, NH, www.extech.com445815
Arkusz kauczuku silikonowegoMcMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com87315K64Użyj silikonu USP Grade VI dla jego
uszczelki EMILaird Technologies www.lairdtech.com4202-PA-51H-01800 lub podobneDystrybuowane przez Mouser www.mouser.com
TxR-DHPELife Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.comT1395MPDostępne są inne fluorescencyjnie znakowane lipidy, ale TxR-DHPE jest jednym z najjaśniejszych i najbardziej fotostabilnych.
POPCAvanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com850457P lub 850457CLipidy można zamówić w postaci proszku (P) lub chloroformu (C)
POPSAvanti Polar Lipids840034P/C
CholesterolSigma-AldrichC8667
o wysokiej czystości

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  2. Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika elektroformowaniaosadzanie filmu lipidowegokontrolowane odwodnienieszk o powlekane ITOgigantyczne p cherzyki jednowarstwoweobrazowanie liposom wrekonstytucja bia ek b onowychrejestracja elektrofizjologiczna

Powiązane artykuły