Pionowy olfaktometr labiryntu w kształcie litery T jest opisany do badania reakcji behawioralnej stawonogów. Olfaktometr pozwala eksperymentatorowi zmierzyć wybory dokonywane przez osoby badane pod wpływem dwóch potencjalnych pól zapachowych. Za pomocą tego urządzenia można zmierzyć zarówno przyciąganie, jak i odpychanie od substancji zapachowych.
Artykuł metodologiczny
Pionowy test wyboru labiryntu w kształcie litery T dla reakcji stawonogów na substancje zapachowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biorąc pod uwagę ekonomiczne znaczenie owadów i pajęczaków jako szkodników upraw rolnych, środowisk miejskich lub jako wektorów chorób roślin i ludzi, rozwijane są różne technologie jako narzędzia kontroli. Podzbiór tych narzędzi koncentruje się na modyfikowaniu zachowania stawonogów poprzez przyciąganie lub odpychanie. Dlatego stawonogi są często przedmiotem badań behawioralnych. Opracowano różne narzędzia do pomiaru zachowania stawonogów, w tym tunele aerodynamiczne, młyny lotnicze, serwosfery i różne rodzaje olfaktometrów. Celem tych narzędzi jest pomiar reakcji owadów lub pajęczaków na sygnały wizualne lub częściej węchowe. Opisany tutaj pionowy labirynt T-laktometru mierzy wybory dokonywane przez owady w odpowiedzi na atraktanty lub repelenty. Jest to urządzenie testowe o wysokiej przepustowości, które wykorzystuje dodatnią fototaksję (przyciąganie do światła) i ujemną geotaksję (tendencję do chodzenia lub latania w górę) wykazywaną przez wiele stawonogów. Olfaktometr składa się z 30-centymetrowej szklanej rurki, która jest podzielona na pół paskiem teflonowym tworzącym labirynt w kształcie litery T. Każda połówka służy jako ramię olfaktometru, umożliwiając badanym dokonanie wyboru między dwoma potencjalnymi polami zapachowymi w testach z udziałem atraktantów. W testach z użyciem repelentów brak normalnej odpowiedzi na znane atraktanty może być również mierzony jako trzecia zmienna.
Wprowadzenie
Stawonogi (w tym owady i pajęczaki) są często definiowane jako szkodniki, ponieważ albo konkurują z konsumpcją przez ludzi w środowisku rolniczym lub miejskim, albo przenoszą patogeny powodujące chorobę1. Inwestuje się dużo w rozwój narzędzi do zwalczania takich szkodników. Narzędzia te mogą się znacznie różnić, a w opracowywaniu narzędzi bioracjonalnych, które modyfikują lub wykorzystują naturalne zachowanie szkodników za pomocą atraktantów behawioralnych lub repelentów2,3.
Szkodniki stawonogów często polegają na sygnałach węchowych lub wskazówkach dotyczących lokalizacji partnera i/lub gospodarza4. Dlatego odkrycie skutecznych atraktantów lub repelentów szkodników może często prowadzić do opracowania narzędzi zwalczania. Ten proces odkrywania składa się z kilku kroków. Po pierwsze, należy zrozumieć naturalne zachowanie osoby badanej. Na przykład, należy ustalić, czy jedna płeć danego gatunku przyciąga płeć przeciwną do lokalizacji partnera. Jeśli tak, należy ustalić, czy to przyciąganie jest pośredniczone przez substancję chemiczną i gdzie ta substancja chemiczna jest produkowana. Dalsze kroki obejmują określenie, kiedy substancja chemiczna jest produkowana i jej ostateczną identyfikację. Podczas tej procedury należy przetestować reakcję behawioralną osoby badanej (owada lub roztocza) na substancje zapachowe. Początkowo zachowanie osoby badanej zostanie przetestowane na naturalnym materiale. Na przykład reakcja samca może być testowana na reakcję ekstraktu z feromonów żeńskiego osobnika tego samca. Alternatywnie można przetestować reakcję roślinożercy na naturalne zapachy rośliny żywicielskiej. Chociaż badania te często koncentrują się w praktyce na opracowywaniu narzędzi zarządzania5,6, można je również zastosować do badań, które dotyczą bardziej podstawowych pytań, takich jak specjacja7. Kolejne kroki polegają na przetestowaniu reakcji stawonogów na syntetyczne wersje zidentyfikowanych produktów naturalnych.
Zrozumienie, jak stawonogi reagują na chemikalia, wymaga opracowania odpowiednich narzędzi do pomiaru ich zachowania. Dane generowane przez takie narzędzia będą zależeć od tego, jak dobrze badacz jest w stanie zmierzyć naturalne zachowania w kontrolowanym otoczeniu. Ponad sześćdziesiąt lat temu opracowano olfaktometry i tunele do pomiaru reakcji owadów na substancje zapachowe8,9. Olfaktometry różnią się znacznie pod względem konstrukcji i często są dostosowane do konkretnego owada lub badanego problemu. Celem tego artykułu jest opisanie konstrukcji i zastosowania zorientowanego pionowo olfaktometru T-labirynt do pomiaru reakcji owadów na substancje zapachowe (ryc. 1). Orientacja pionowa olfaktometru wykorzystuje negatywną geotaksję (tendencję do przesuwania się w górę) wykazywaną przez wiele owadów. Źródło światła umieszczone bezpośrednio nad olfaktometrem wykorzystuje dodatnią fototaksję (tendencję do poruszania się w kierunku źródła światła) wykazywaną przez wiele owadów. Olfaktometr jest szczególnie przydatny w przypadku owadów pluskwiaków, które nie wykazują łatwo ruchu w olfaktometrach zorientowanych poziomo i na które duży wpływ ma natężenie światła w odniesieniu do orientacji. Jednak to urządzenie może być używane do szerokiej gamy owadów latających i pełzających, a także pajęczaków. Olfaktometr może być używany do oceny zarówno atraktantów, jak i repelentów. W przypadku atraktantów rozwidlone pole zapachowe (ryc. 1) ustala się przy założeniu, że przypuszczalny atraktant jest uwalniany z jednej strony, a czyste powietrze uwalniane jest z drugiej strony. Wybór jest rejestrowany, gdy owad uwolniony u podstawy olfaktometru wybierze jedno z dwóch pól zapachowych. W przypadku repelentów możliwe jest trzecie zachowanie. Oprócz ruchu w górę do któregokolwiek z dwóch pól zapachowych, można zarejestrować brak ruchu w górę, co wskazuje na bodziec niereagujący lub odpychający bodziec z któregokolwiek z pól zapachowych.
Protokół
- Montaż specjalnie zaprojektowanego, dwuportowego, dzielonego olfaktometru T, opisanego wcześniej w Mann et al.10 pokazano na rysunku 1. Olfaktometr składa się ze szklanej rurki o długości 30 cm, która jest rozwidlona na dwa oddzielne porty z paskiem teflonowym tworzącym labirynt w kształcie litery T. Każda połówka jest analogiczna do ramienia olfaktometru typu 2-wyboru, umożliwiając badanemu wybór między dwoma potencjalnymi polami zapachowymi.
- Montaż i późniejsze testy powinny odbywać się w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze lub komorze środowiskowej.
- Zamontuj szklany olfaktometr T-maze pionowo, jak pokazano na rysunku 1 i umieść go pod żarówką fluorescencyjną o natężeniu 900 luksów.
- Aby zapewnić optymalne rozproszenie światła, zespół powinien być zamontowany w nieprzezroczystym pojemniku o wymiarach 1,0 x 0,6 x 0,6 m, aby zmaksymalizować równomierne rozproszenie światła.
- Podłącz ramiona olfaktometru do źródeł zapachów, które będą umieszczone w komorze mikroekstrakcji / źródła zapachów w fazie stałej (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville, FL) za pomocą złączy teflonowych; szklanych rurek. Każdy SPMEC składa się z prostej szklanej rurki (17,5 cm długości x 3,5 cm szerokości) wspartej na zaworze wlotowym i wylotowym dla strumieni powietrza wlotowego i wywiewanego (rysunek 1).
- Podłącz system dostarczania powietrza do zewnętrznego źródła nawilżonego i oczyszczonego węglem powietrza, które jest pod stałym ciśnieniem (system dostarczania powietrza ma zarówno wewnętrzny filtr węglowy do oczyszczania powietrza, jak i bąbelk powietrza do nawilżania, jeśli źródła zewnętrzne są niedostępne).
- Rozpuść żądane próbki chemiczne w odpowiednim rozcieńczalniku (rozpuszczalniku) i pipetuj na podłożu o powolnym uwalnianiu, takim jak bawełniany (Petty John Packaging, Inc., Concord, NC). Zabieg kontrolny powinien składać się z bawełnianego nasączonego wyłącznie rozpuszczalnikiem.
- Aby zapobiec znacznemu zanieczyszczeniu wyrobów szklanych, należy owinąć poddane obróbce i kontrolować bawełniane w tkance laboratoryjnej (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) i umieścić w dwóch ramionach SPMEC (ARS, Inc., Gainesville, FL). W przypadku żywych próbek roślin, w miejsce SPMEC można podłączyć komorę do zbierania lotnych substancji jadalnych gilotyny, w miejsce SPMEC (rysunek 1).
- Dostarczyć oczyszczone i nawilżone powietrze przez SPMEC (lub lotynową komorę lotną) za pomocą dwóch pomp podłączonych do systemu dostarczania powietrza (rysunek 1). Utrzymuj natężenie przepływu powietrza na poziomie 0,1 l/min przez oba ramiona olfaktometru.
- Wykorzystanie olfaktometru do zbadania reakcji stawonogów na domniemane repelenty. W niniejszym opisie jako stawonóg testowych użyto owada z rodzaju pluskwiak, azjatyckiego psyllida cytrusowego, Diaphorina citri. Testowano reakcję na substancje lotne cytrusowe samodzielnie lub w połączeniu z repelentem (disiarczkiem dimetylu) i czystym powietrzem jako źródłem zapachu.
- Wszystkie eksperymenty przeprowadzaj w znormalizowanej temperaturze i wilgotności względnej.
- Przed wszystkimi testami wystaw osoby badane na działanie czystego powietrza w porównaniu z czystym powietrzem lub rozpuszczalnika w porównaniu z czystym powietrzem w olfaktometrze T-labirynt, aby sprawdzić brak odchylenia pozycyjnego lub wpływu rozpuszczalnika na zachowanie osoby badanej.
- Przypisz źródło zapachu losowo do jednego z ramion olfaktometru na początku każdego testu biologicznego. Odwróć tę pozycję co najmniej po każdych 10 badanych obiektach, aby wyeliminować potencjalne odchylenie pozycyjne.
- Zbadaj odpowiedź co najmniej 30 (a do 120) badanych osób na każdą kombinację leczenia.
- Pozwól badanym na 100-300 sekund na wykazanie odpowiedzi behawioralnej w oparciu o wcześniej ustalony interwał odpowiedzi (opóźnienie).
- Rejestruj, czy pacjent wchodzi do ramienia terapeutycznego, ramienia kontrolnego lub pozostaje w porcie uwalniania lub poniżej podziału T-maze.
- Oceń wybór grupy leczenia lub grupy kontrolnej, gdy badany przekroczy podział w labiryncie T i przejdzie do dowolnego ramienia olfaktometru.
- Oceń wybór ramienia zwalniającego, gdy obiekt testowy pozostaje w porcie zwalniania lub poniżej podziału T-maze.
- Dokładnie wyczyść olfaktometr i rurki łączące 2% roztworem mydła i upiecz szklane elementy w temperaturze 200 ° F między stosowaniem różnych środków przeciwzapachowych.
- W przypadku testów, w których domniemane leczenie odstraszające jest prezentowane w olfaktometrze T-labirynt z obróbką chemiczną lub bez niej w porównaniu z czystym powietrzem, należy porównać liczbę badanych osób pozostających w punkcie uwolnienia i nie wchodzących do olfaktometru między zabiegami za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu HSD Tukeya (α < 0,05). W przypadkach, w których badani opuszczają ramię uwalniające, porównaj liczbę wybierającą ramię kontrolne w porównaniu z ramieniem leczenia z analizą Chi-kwadrat (χ2) przy α < 0,05.
Wyniki
Przyciąganie dorosłych osobników azjatyckiego psyllida cytrusowego (Diaphorina citri) do zapachów lotnych związków organicznych z ich rodzimej rośliny żywicielskiej (cytrusów) przedstawiono na Rysunku 2A. Znacząco więcej (α < 0.05) dorosłych osobników wybrało ramię olfaktometru w kształcie litery T, do którego docierały zapachy z żywych roślin cytrusowych, w porównaniu z kontrolą pustą (czyste powietrze).
Przykład odpychania przedstawiono na Rysunku 2B. W tym przypadku owady wystawiono na jedno ramię labiryntu w kształcie litery T, do którego doprowadzano lotne związki cytrusowe, podczas gdy do drugiego ramienia doprowadzano lotne związki z rośliny cytrusowej traktowanej znanym repelentem, dwumetyldisiarczkiem11. W tej sytuacji zaobserwowano trzy typy zachowań. Liczba psyllid, które zatrzymały się w ramieniu startowym i nie reagowały, nie różniła się statystycznie od liczby owadów wchodzących do ramienia z zapachami pochodzącymi wyłącznie z roślin cytrusowych (Rysunek 2B). Jednakże żadna psyllida nie weszła do ramienia zawierającego lotne związki rośliny żywicielskiej, gdy były one prezentowane jednocześnie z repelentem (Rysunek 2B).
Rysunek 1. Schematyczny rysunek pionowo zorientowanego olfaktometru w kształcie litery T połączonego z systemem dostarczania powietrza i urządzeniami do uwalniania substancji zapachowych. Diagram jest adaptacją Rysunku 1 z pracy Mann et al.10. Obiekt testowy jest umieszczany pojedynczo w komorze startowej dwuportowego, podzielonego T-olfaktometru. Porusza się on w kierunku zapachów poprzez zawór odcinający, który umożliwia kontrolowany ruch w górę do olfaktometru i zapobiega cofaniu się owada do obszaru punktu startowego. Rurka rozgałęzia się 10 cm za zaworem odcinającym. Reakcję pozytywną na zapach rejestruje się, gdy owad przesunie się o 0,5 cm w stronę konkretnej części podziału. Gilotynowa komora do zbierania substancji lotnych może być użyta zamiast komory utrzymującej mikroekstrakcję w fazie stałej/źródła zapachu (SPMEC) jako źródło zapachu.
Rysunek 2. Reakcja dorosłych osobników azjatyckiej psyllidy cytrusowej (Diaphorina citri) na lotne substancje z roślin żywicielskich cytrusów w porównaniu z kontrolą w postaci czystego powietrza (A) lub lotne substancje cytrusów w porównaniu z lotnymi substancjami cytrusów uwalnianymi wspólnie z repelentem (dysiarczek dimetylu) (B) w olfaktometrze w kształcie litery T o orientacji pionowej. Rysunek 2A: Przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test HSD Tukeya (α < 0,05), aby porównać liczbę psyllid dokonujących wyboru między ramionami (2 traktowania, n = 120). Słupki oznaczone różnymi literami różnią się od siebie istotnie (α < 0,05). Rysunek 2B: Przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test HSD Tukeya (α < 0,05), aby porównać liczbę psyllid dokonujących wyboru między ramionami lub pozostających w punkcie uwalniania (3 traktowania, n = 120). Słupki oznaczone różnymi literami różnią się od siebie istotnie (α < 0,05).
Dyskusja
W niniejszym dokumencie opisano urządzenie testowe i protokół pomiaru reakcji małych stawonogów (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) na substancje zapachowe. Metoda obejmuje test wyboru, który pozwala owadowi dokonać wyboru między dwoma polami zapachowymi w przypadku testów oceniających domniemany atraktant. Co więcej, osoba badana może wykazywać trzy rodzaje zachowań, opuszczając ramię uwalniające i wchodząc w jedno z dwóch potencjalnych pól zapachowych lub pozostając w ramieniu uwalniającym, w przypadku testów odstraszania. Olfaktometr pozwala na gromadzenie danych o wysokiej przepustowości, ponieważ wykorzystuje negatywną naturalną reakcję behawioralną wielu stawonogów (tendencja do poruszania się w górę) i pozytywną fototaktyczną (tendencja do poruszania się w kierunku światła). Chociaż w niniejszej demonstracji wykorzystano przykład testu na owadach psyllidowych, test można łatwo dostosować do szeroko pojętych stawonogów, zarówno tych, które wykorzystują lot lub chodzenie jako dominujące środki transportu.
Olfaktometry przeznaczone do pomiaru reakcji owadów zostały pierwotnie opracowane kilkadziesiąt lat temu i odegrały ważną rolę w wyjaśnianiu atraktantów i repelentów owadów12. Konkretne konstrukcje takich olfaktometrów są bardzo różne; jednak wariacje na temat ogólnego tematu opisanego tutaj testu dwuwyboru, a także podobne testy z rurką Y były często wykorzystywane do pomiaru odpowiedzi stawonogów na chemikalia. Większe tunele lotnicze, które mogą powodować długotrwały lot owadów9 , doprowadziły również do zebrania przełomowych danych wyjaśniających podstawowe mechanizmy ucieczki owadów i ich orientacji na semiochemikalia, a także danych informujących o praktycznym zastosowaniu narzędzi do zwalczania szkodników.
Często konieczne jest dostosowanie projektu olfaktometru i związanego z nim oprzyrządowania do biologii konkretnego badanego stawonoga. Te olfaktometry, które mogą być używane wśród ogólnej grupy owadów, są bardziej przydatne niż te specyficzne dla małej grupy; Zdarza się jednak, że znaczenie ekonomiczne niewielkiej grupy owadów dyktuje konieczność opracowania bardzo specyficznego olfaktometru i techniki testowej. Obecnie opisana konstrukcja opiera się na znanych wcześniej technikach stawonogówów. Pozwala to na bardziej standardowy test dwuwyboru niż testy biologiczne z rurką Y, w których arena doświadczalna lub test wyboru przyjmuje formę szklanego urządzenia w kształcie litery Y7. Zazwyczaj jedno ramię takiej rurki Y otrzyma leczniczy środek zapachowy, podczas gdy drugie pozostanie puste13. Wariacje na temat takich olfaktometrów mogą obejmować dodanie wielu promieniujących ramion14 , a nawet dodanie pożywki glebowej do badania zachowania organizmów poruszających się w glebie15. Opracowując takie olfaktometry i związane z nimi testy, ważne jest, aby rozważyć, jak ściśle odwzorowane są warunki naturalne, a tym samym prawdziwe znaczenie ocenianych reakcji behawioralnych pod względem biologii badanych. W dużym stopniu zebrane dane będą tylko tak użyteczne, jak znaczenie behawioralnego testu biologicznego w odniesieniu do ekologii behawioralnej organizmu16.
Obecnie opisany olfaktometr i behawioralny test biologiczny jest specjalnie zaprojektowany dla owadów z rodzaju pluskwiak, które mają tendencję do inicjowania lotu w postaci krótkich "skoków"16. Pionowa orientacja olfaktometru i rozmieszczenie źródła światła ułatwiają inicjację ruchu owadów, a tym samym późniejsze zachowanie orientacyjne za pośrednictwem substancji chemicznych może być oceniane efektywnie i z dużą przepustowością. Ten układ testów behawioralnych może być prawdopodobnie stosowany do szerokiej gamy latających lub chodzących taksonów stawonogów lub może być również łatwo modyfikowany w celu dopasowania do potrzeb organizmów innych niż stawonogi.
Oświadczenia
Autor otrzymał dofinansowanie, które zostało zapewnione przez Fundację Badań i Rozwoju Cytrusów.
Podziękowania
Fundacja Badań i Rozwoju Cytrusów jest doceniana za udzielanie funduszy. Podziękowania dla Angela Hoyte'a i Michaela Floresa za przeprowadzenie testów biologicznych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dwuportowy trój-olfaktometr | Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL | Brak (wykonane na zamówienie) | Jeśli nie jest dostępny w ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) również obecnie buduje i dystrybuuje taki sprzęt. |
| Komora z mikroekstrakcją w fazie stałej/źródłem zapachów z łącznikami teflonowo-szklanymi. | Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL | RV-R3 | Zobacz powyższy komentarz |
| System dostarczania powietrza | Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL | HADS-2AFM2C.4 | Zobacz powyższy komentarz |
| Komora gilotynowa | Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL | L3GP3 | Zobacz powyższy komentarz |
Bibliografia
- Resh, R. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. , Academic Press, Elsevier Science. USA. (2003).
- Biorational tree-fruit pest management. Aluja, M., Lesky, T. C., Vincent, C. , CABI. USA. (2009).
- Rodriquez-Saona, C., Stelinski, L. L. Behavior-modifying strategies in IPM: Theory and Practice. Integrated Pest Management: Innovation - Development Process. Peshin, R., Dhawan, A. K. , Springer. NY. 261-311 (2009).
- Cardé, R. T., Millar, J. G. Advances in insect chemical ecology. , Cambridge University Press. UK. (2004).
- Knight, A. L., Stelinski, L. L., Hebert, V., Gut, L., Light, D., Brunner, J. Novel dispensers simultaneously releasing pear ester and sex pheromone for disruption of codling moth (Lepidoptera: Tortricidae). Journal of Applied Entomology. 136 (1-2), 79-86 (2012).
- Mann, R. S., Tiwari, S., Smoot, J. M., Rouseff, R. L., Stelinski, L. L. Repellency and toxicity of plant-based essential oils and their constituents against Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Journal of Applied Entomology. 136 (1-2), 87-96 (2012).
- Forbes, A. A., Powell, H. Q., Stelinski, L. L., Smith, J. J., Feder, J. L. Sequential sympatric speciation across trophic levels. Science. 323 (5915), 776-779 (2009).
- Kennedy, J. S. The visual responses of flying mosquitos. Proceedings of the Zoological Society of London A. 109 (4), 221-242 (1940).
- Miller, J. R., Roelofs, W. L. Sustained-flight tunnel for measuring insect responses to wind-borne sex pheromones. Journal of Chemical Ecology. 4 (2), 187-198 (1978).
- Mann, R. S., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Castle, W. S., Stelinski, L. L. Sulfur volatiles from Allium spp. affect Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), response to citrus volatiles. Bulletin of Entomological Research. 101 (1), 89-97 (2011).
- Onagbola, E. O., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Stelinski, L. L. Guava leaf volatiles and dimethyl disulfide inhibit response of Diaphorina citri Kuwayama to host plant volatiles. Journal of Applied Entomology. 135 (6), 404-414 (2011).
- Baker, T. C., Linn, C. E. Wind tunnels in pheromone research. Techniques in Pheromone Research. Hummel, H., Miller, T. A. , Springer-Verlag. New York. 75-110 (1984).
- Stelinski, L. L., Rodriguez-Saona, C., Meyer, W. L. Recognition of foreign oviposition marking pheromone in a multitrophic context. Naturwissenschaften. 96 (5), 585-592 (2009).
- Gökçe, A., Stelinski, L. L., Whalon, M. E. Behavioral and electrophysiological responses of leafroller moths to selected plant extracts. Environmental Entomology. 34 (6), 1426-1432 (2005).
- Ali, J. G., Alborn, H. T., et al. herbivore-induced plant volatile increases biological control activity of multiple beneficial nematode species in distinct habitats. PLoS ONE. 7 (6), e38146(2012).
- Mann, R. S., Ali, J. G., et al. Induced release of a plant defense volatile 'deceptively' attracts insect vectors to plants infected with a bacterial pathogen. PLoS Pathogens. 8 (3), e1002610(2012).
Przedruki i uprawnienia
