Mysi model implantacji stentu w tętnicy szyjnej do badania restenozy

Podsumowanie

Opisano model implantacji stentu w tętnicy szyjnej myszy. W porównaniu z innymi podobnymi metodami, procedura ta jest bardzo szybka, prosta i dostępna, oferując możliwość zbadania w wygodny sposób reakcji ściany naczyniowej na różne stenty uwalniające leki oraz molekularnych mechanizmów restenozy.

Streszczenie

Pomimo znacznego postępu, jaki dokonał się w rozwoju stentów w ostatnich dziesięcioleciach, choroby sercowo-naczyniowe pozostają główną przyczyną zgonów w krajach zachodnich. Oprócz korzyści płynących z opracowania różnych stentów uwalniających leki, rewaskularyzacja naczyń wieńcowych niesie ze sobą również zagrażające życiu ryzyko zakrzepicy w stencie i restenozy. Badania nad nowymi strategiami terapeutycznymi są utrudnione przez brak odpowiednich metod badania procesów implantacji stentów i restenozy. W tym miejscu opisujemy szybki i przystępny zabieg implantacji stentu w tętnicy szyjnej myszy, który daje możliwość zbadania w wygodny sposób molekularnych mechanizmów przebudowy naczyń i efektów działania różnych powłok lekowych.

Wprowadzenie

Choroby sercowo-naczyniowe spowodowane postępem miażdżycy są główną przyczyną zgonów w krajach uprzemysłowionych. Miażdżyca jest ogniskową, zapalną reakcją włóknisto-proliferacyjną ściany naczynia krwionośnego na uszkodzenie śródbłonka¹, powodującą tworzenie się przedłużonej blaszki miażdżycowej w świetle naczynia, wpływającą na przepływ krwi przez tętnice wieńcowe. Ponad 75% zawałów mięśnia sercowego wynika z pęknięcia cienkiej włóknistej czapeczki zapalnej blaszki miażdżycowej². Ponieważ to powikłanie może być śmiertelne, przezskórna angioplastyka przezświetlna (wieńcowa) (PTCA) z implantacją stentu stała się terapią pierwszego wyboru w obecnej praktyce medycznej. Metoda pozwala na poszerzenie zwężonej tętnicy wieńcowej, a tym samym przywrócenie przepływu krwi. Jednocześnie powoduje rozległe uszkodzenie śródbłonka i ściany naczynia³. Jednak długotrwały efekt tej terapii jest ograniczony przez nadmierną przebudowę tętnic i restenozy⁴.

Dzięki zastosowaniu stentów, PTCA stał się bardziej skuteczny w leczeniu skomplikowanych zmian, umożliwiając rewaskularyzację po ostrym zamknięciu naczynia⁵. Ta metoda zmniejsza częstość występowania restenozy w stencie do mniej niż 10%⁶. Oprócz tych korzyści, ta terapia pierwszego wyboru w rewaskularyzacji naczyń wieńcowych niesie ze sobą również zagrażające życiu ryzyko zakrzepicy w stencie i restenozy.

Zakrzepica w stencie jest spowodowana deendotelializacją naczynia, po której następuje masywne przyleganie płytek krwi i fibryny do uszkodzonego miejsca. 26% pacjentów cierpi na zakrzepicę w stencie, a 63% umiera z powodu zawału mięśnia sercowego⁷. Retenoza odnosi się do procesu gojenia się ran po mechanicznym urazie ściany naczynia, obejmującym przerost neointimy (migracja i proliferacja komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC), odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i przebudowa naczynia. Często konieczna staje się inwazyjna ponowna interwencja w celu rozszerzenia poważnie zwężonych naczyń miażdżycowych z powodu zakrzepicy w stencie i restenozy.

Aby zapobiec zakrzepicy w stencie, konieczne jest długotrwałe leczenie lekami przeciwzakrzepowymi⁸. Aby zapobiec restenozy, stenty uwalniające leki nowej generacji wymywają środki antyproliferacyjne, takie jak leki immunosupresyjne (np. syrolimus, ewerolimus, zotarolimus) i leki przeciwnowotworowe (np. paklitaksel) z powłoki polimerowej przez kilka miesięcy^9,10. Chociaż leki te zmniejszają powstawanie neointimy i restenozy, utrzymują wysokie ryzyko zakrzepicy w stencie poprzez hamowanie reendotelializacji.

Po uszkodzeniu tętnicy, utrzymanie przedziału śródbłonka jest niezbędne, aby zapobiec powikłaniom zakrzepowym. W warunkach fizjologicznych śródbłonek człowieka wykazuje niewielką rotację¹¹. Jednak w warunkach patologicznych integralność śródbłonka jest upośledzona, tak że wymagana jest szybka regeneracja poprzez otoczenie dojrzałych komórek śródbłonka i krążących komórek progenitorowych śródbłonka (EPC)^12,13.

Badanie tych skomplikowanych mechanizmów molekularnych u większych zwierząt^14-16 lub w tętnicy aortalnej myszy jest bardzo trudną procedurą, oferującą ograniczone dane^17-19. Aby przetestować skuteczność nowatorskich powłok stentowych w celu zmniejszenia zakrzepicy i restenozy w stencie, niezbędne są nowe modele.

Nitinol stanowi idealną platformę dla stentów ze względu na jego wysoką elastyczność, efekt pamięci kształtu i dobrą tolerancję u pacjentów, będąc z powodzeniem stosowany jako stenty z gołego metalu w zastosowaniach klinicznych. Stop ten umożliwił stworzenie zminiaturyzowanego stentu o średnicy zewnętrznej 500 μm, który można pokryć²⁰ i wszczepić do tętnicy szyjnej myszy. Opracowanie zminiaturyzowanego stentu nitinolowego do tętnicy szyjnej myszy pozwala na badanie precyzyjnych mechanizmów molekularnych indukowanych przez implantację stentu i daje możliwość szybkiego i skutecznego przetestowania działania różnych powłok lekowych w celu zapobiegania restenozy. Co więcej, istnienie różnych szczepów myszy z nokautem stanowi ogromną zaletę w wyjaśnianiu roli różnych cząsteczek zaangażowanych we wzrost neointimy i zakrzepicę w stencie.

Protokół

1. Przygotowanie stentu i implantacja

1. Rozpórki stentu (Fort Wayne Metals, Castlebar, Irlandia) zostały splecione, a następnie przycięte do pożądanego rozmiaru w Instytucie Technologii Włókienniczej i Inżynierii Mechanicznej Uniwersytetu RWTH Aachen w Niemczech (ryc. 1A).
2. Przed implantacją stenty należy przenieść do silikonowej rurki o średnicy 2 cm za pomocą kleszczyków i umieścić 2 mm na jednym końcu końcowym, skierowanym do przodu końcem (ryc. 1A).
3. Przedni koniec powinien być przycięty ukośnie, aby zapewnić ostrą końcówkę do implantacji.
4. Przed implantacją stent powinien być obficie podlewany, aby zapewnić poślizg
.

2. Implantacja stentu

1. 10-12 tygodniowe samce myszy typu dzikiego C57Bl/6, 25-27 g, są znieczulane za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Prawidłowe znieczulenie potwierdza przed zabiegiem brak odruchów i ruchów brody. Aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia, oczy myszy są pokryte filmem kremu bepantenowego.
2. Po goleniu i odpowiedniej dezynfekcji brzusznej części szyi wykonuje się małe środkowe nacięcie o długości 1 cm pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu nożyczek. Po oddzieleniu 2 ciał tłuszczowych za pomocą sterylnych zakrzywionych kleszczy, można zobaczyć lewą tętnicę szyjną wspólną pulsującą wraz z tchawicą.
3. 1 cm lewej tętnicy szyjnej wspólnej i rozwidlenie powinny być swobodnie przygotowane. 1 węzeł przy użyciu nici jedwabnej 5/0 zostanie zawiązany wokół lewej tętnicy szyjnej wspólnej, 2 węzły przy użyciu nici jedwabnych 7/0 zostaną związane wokół lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej, a 1 węzeł przy użyciu nici jedwabnej 7/0 zostanie zawiązany wokół tętnicy szyjnej wewnętrznej (ryc. 1B).
4. Przepływ krwi jest następnie przerywany przez mocne zawiązanie węzłów na tętnicy szyjnej wewnętrznej i bliższej tętnicy szyjnej zewnętrznej, a także przez pociągnięcie węzła otaczającego tętnicę szyjną wspólną. Naczynie powinno być zamocowane w taki sposób, aby tętnica szyjna wspólna i zewnętrzna znajdowały się w linii prostej.
5. Małe nacięcie na tętnicy szyjnej zewnętrznej wykonuje się w pobliżu węzła proksymalnego za pomocą nożyczek Vannas. Rurkę silikonową zawierającą stent wprowadza się do tętnicy szyjnej zewnętrznej, z ostrym końcem z przodu, za pomocą prowadnika. Po tym, jak stent osiągnie pożądaną pozycję, rurka silikonowa jest naciągana z powrotem na drut prowadnikowy i umożliwia rozszerzenie stentu z pamięcią kształtu (ryc. 1B).
6. Węzeł dystalny na tętnicy szyjnej zewnętrznej jest ściśle wiązany, aby zamknąć miejsce nacięcia, a węzły na tętnicy szyjnej wewnętrznej i wspólnej są usuwane, przywracając w ten sposób przepływ krwi.
7. Nacięcie skóry zamyka się za pomocą 3-4 klipsów do szwów Michela i kleszcza Michela. Mysz umieszcza się pod czerwonym światłem do momentu pełnego wyzdrowienia. Leczenie przeciwbólowe nie jest konieczne.
8. Płytkę nazębną można przeanalizować po 1-3 tygodniach. Aby zbadać ponowną endotelializację, konieczny jest wcześniejszy punkt czasu końcowego (3-4 dni). Zaobserwowaliśmy w naszym modelu implantacji stentu, że 4 tygodnie po tej interwencji chirurgicznej, zwłaszcza dzięki zastosowaniu specjalnych powłok do biofunkcjonalizacji zminiaturyzowanych stentów, neoangiogeneza występuje w około 30% próbki. Jest to łania dla procesów przebudowy i regeneracji, o różnych mechanizmach i stanowiących kolejny patologiczny problem. Aby skoncentrować się na tworzeniu neointima, zwężeniu w stencie i/lub analizie mechanizmów leżących u podstaw tych skutków ubocznych po implantacji stentu, korzystne byłoby zastosowanie punktu końcowego wynoszącego 3 tygodnie, aby nie mylić go z efektami regeneracyjnymi wywołanymi początkiem neoangiogenezy.

3. Analiza powstawania płytki nazębnej

1. W punkcie końcowym zwierzęta są znieczulane za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Prawidłowe znieczulenie potwierdza przed zabiegiem brak odruchów i ruchów brody.
2. Zwierzęta są zabijane przez wykrwawienie wewnątrzsercowe. Surowica krwi jest pobierana do dalszej analizy.
3. Po otwarciu jamy klatki piersiowej i przemyciu PBS poprzez nakłucie śródsercowe, przez 5 minut przeprowadza się perfuzję ciała z 4% roztworem paraformaldehydu (PFA). Lewa tętnica szyjna zawierająca stent jest preparowana, bezpośrednio umieszczana w 4% roztworze PFA, a następnie co najmniej 16 godzin później zanurzana w plastiku.
4. Przekroje o grubości 50 μm są wykonywane z próbek osadzonych w tworzywie sztucznym za pomocą diamentowej piły taśmowej.
5. Aby zmierzyć rozmiar płytki nazębnej, wykonuje się barwienie Giemsa.
6. Aby przeanalizować szybkość reendotelializacji w obrębie stentowanego obszaru naczynia, przeprowadza się immunohistochemię czynnika von Willebranda (vWF).

Wyniki

1. Implantacja zminiaturyzowanego stentu z nitinolu do lewej tętnicy szyjnej myszy trwa 25-30 min, a wskaźnik śmiertelności wynosi 10%, co wynika głównie z uszkodzenia naczynia podczas interwencji. Lepszy wskaźnik przeżywalności obserwuje się u myszy o masie ciała powyżej 25 g w momencie implantacji stentu (wskaźnik śmiertelności 5%). W związku z tym do implantacji wybrano myszy o masie od 25-27 g. Po zabiegu myszy budzą się z narkozy w ciągu 2-5 min i nie obserwuje się u nich żadnych upośledzeń fizycznych, takich np. jak paraliż. Obrazowanie mikrotomografią komputerową (Micro-CT) wykonane tydzień po implantacji stentu wykazało, że stenty nie uległy przemieszczeniu pod wpływem przepływu krwi (Rycina 1C). Niestety, analiza tworzenia neointimy na tych obrazach nie jest możliwa ze względu na artefakty pochodzące od metalu (Rycina 1D, 1E).
2. Nie zaobserwowaliśmy żadnych uszkodzeń naczynia ani śródbłonka w obszarze naczynia bez stentu, bezpośrednio poniżej stentu, co potwierdzono badaniem histologicznym (Rycina 2A) oraz specyficznym barwieniem śródbłonka (Rycina 2B, przeciwciało anty-CD31 przeciwko myszy). Aby uzyskać lepszy przegląd, przekrój został przeskanowany przy użyciu dwufotonowej mikroskopii laserowej (Rycina 2B, 2C).
3. W naczyniu ze stentem u myszy o masie od 25-27 g wykryto trwałe rozszerzenie o 15% (stosunek stent:tętnica, 1,15:1). Tworzenie neointimy oraz formowanie zakrzepów można analizować za pomocą klasycznych barwień histologicznych (np. hematoksylina i eozyna, Giemsa, Movat, błękit toluidyny, Masson-Trichrom-Goldner, Rycina 3A, 3B). Ponieważ błona zewnętrzna i wewnętrzna nie są już widoczne, wielkość blaszki miażdżycowej obliczono jako różnicę między powierzchnią zewnętrzną a światłem naczynia (średnia powierzchnia blaszki: 234566 ± 3315 μm², średnia powierzchnia światła: 12036 ± 2662 μm²). Zmierzono również obwód zewnętrzny (średnia: 1799 ± 14 μm). Do analizy składu komórkowego przekroje muszą zostać poddane deplastyfikacji i zabarwione specyficznymi markerami. Do oceny reendotelizacji zastosowano przeciwciało anty-CD31 sprzężone z Cy3, a do oceny proliferacji komórek mięśni gładkich przeciwciało anty-SMA sprzężone z FITC (Rycina 3C). Reendotelizację obliczono jako procent powierzchni zabarwionej pozytywnie na CD-31 w stosunku do całkowitej powierzchni światła naczynia (średnia: 23,07 ± 3,14 %) tydzień po implantacji stentu.

Oczywiście, w zależności od doświadczenia danego laboratorium, możliwe jest zastosowanie nieograniczonej liczby specyficznych barwień. W zależności od celu badania można również przeprowadzić analizę ciężkiego łańcucha miozyny w celu lepszej charakterystyki SMC, a także analizę komórek naciekających (monocytów, limfocytów) lub barwienia na różne cytokiny zapalne.

Rycina 1. Schematyczny przegląd procedury chirurgicznej (A). Przepływ krwi zostaje przerwany poprzez mocne zawiązanie węzłów na tętnicy szyjnej wewnętrznej oraz proksymalnej części tętnicy szyjnej zewnętrznej, a także poprzez zaciśnięcie węzła otaczającego tętnicę szyjną wspólną. Silikonowa rurka zawierająca stent zostaje wprowadzona do tętnicy szyjnej zewnętrznej poprzez małe nacięcie w tej tętnicy. Po osiągnięciu przez stent pożądanej pozycji, rurka silikonowa jest cofnięta po drucie prowadzącym, co umożliwia ekspansję stentu z pamięcią kształtu. Obrazy mikro-CT przedstawiające pozycję stentu tydzień po implantacji chirurgicznej (B). Ze względu na artefakty wynikające z zastosowanego materiału, analiza wzrostu neointimy nie jest możliwa (C,D).

Rysunek 2. Obszar naczynia bez stentu nie jest dotknięty procedurą chirurgiczną, co wykazuje barwienie błękitem toluidyny (A) oraz barwienie CD31 swoiste dla śródbłonka (B, C).

Rycina 3. Analizę blaszki miażdżycowej można przeprowadzić za pomocą klasycznych barwień histologicznych (np. Masson-Trichrom-Goldner) (A). Zorganizowany zakrzep można wykryć poprzez czarne złogi fibryny wewnątrz neointimy; w niektórych przypadkach obserwuje się całkowite zamknięcie naczynia (B). Reendotelializację (Cy3, czerwony) lub proliferację komórek mięśni gładkich (FITC, zielony) wykryto za pomocą podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego z użyciem specyficznych markerów. Kontrastowanie wykonano przy użyciu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI, niebieski) (C). Zauważono pełną reendotelializację zastrzałów stentu (lewa, podwójna strzałka) w porównaniu do niepełnej reendotelializacji światła naczynia (prawa, pojedyncza strzałka).

Dyskusja

Aby zmniejszyć ryzyko zakrzepicy i restenozy w stencie oraz utrzymać rozwój nowych powłok dla stentów uwalniających leki, potrzebna jest łatwa, prosta i dostępna metoda implantacji stentu w modelu zwierzęcym. Myszy dostarczają idealny system do badania złożonych mechanizmów przebudowy tętnic po implantacji stentu i skuteczności takich leków. Istniejące modele restenozy w stencie u myszy są trudne, wymagają wysokich umiejętności chirurgicznych i implikują wysokie ryzyko powikłań, takich jak krwawienie lub paraliż^17-19. Na przykład w modelu implantacji stentu do aorty piersiowej myszy dawcy po dylatacji balonowej naczynia, a następnie przeszczepieniu stentowanego segmentu do tętnicy szyjnej myszy biorcy¹⁷, na badanie mechanizmów patologicznych ma wpływ nie tylko reakcja biorcy na materiał dawcy, ale także masywne uszkodzenie naczynia krwionośnego i przydanki. Wszczepienie stentu ze stali nierdzewnej bezpośrednio do aorty brzusznej po poszerzeniu balonem¹⁹ powoduje wysoką śmiertelność (35%) z powodu paraliżu tylnej nogi po zakrzepicy lub krwawienia z aorty brzusznej w miejscu arteriantomii. Wszczepienie spiralnego, samorozprężalnego stentu nitinolowego do aorty brzusznej przez tętnicę udową¹⁸ wymaga wysokich umiejętności chirurgicznych, głównie ze względu na ślepe skierowanie stentu wzdłuż rozgałęzienia od tętnicy udowej do aorty, aby umieścić stent we właściwej pozycji. Po tej procedurze występuje duże ryzyko uszkodzenia nerwu udowego, a tym samym paraliżu tylnej nogi. W porównaniu z tymi procedurami, nasz model implantacji stentu u myszy nie wymaga wysokich umiejętności chirurgicznych.

Nasz model oferuje prostą, łatwą i wydajną metodę analizy wpływu różnych powłok lekowych na przebudowę tętnic, umieszczenie stentu odbywa się pod okiem i nie ma ryzyka uszkodzenia nerwów lub innych struktur. Złożone mechanizmy molekularne mogą być łatwiej badane w naszym modelu stentowania tętnicy szyjnej myszy, nie tylko ze względu na bezpośrednią dostępność naczynia, ale także ze względu na istnienie różnych szczepów myszy z nokautem.

Jednym z ograniczeń, w porównaniu z procedurą kliniczną, jest to, że nasz model wykorzystuje zdrowe myszy/tętnice i nie wykonuje stentowania na wcześniej istniejących blaszkach miażdżycowych (nie restenoza w stencie, ale zwężenie w stencie). Nie wykonujemy również dylatacji balonu przed implantacją stentu. Jednak ze względu na ogromne uszkodzenia ściany naczynia w obu modelach, procesy naprawcze są podobne. Niestety, ze względu na artefakty pochodzące z metali, monitorowanie wzrostu nowozewnętrznej błony wewnętrznej in vivo nie jest możliwe przy użyciu istniejących metod obrazowania, takich jak ultrasonografia lub tomografia komputerowa. Innym czynnikiem ograniczającym jest cienki przekrój stentów na bazie metalu, co wymaga pewnej wiedzy specjalistycznej w zakresie obróbki metali.

Korzystając z tej metody, byliśmy w stanie wykazać, że biofunkcjonalizowane zminiaturyzowane stenty nitinolowe pokryte LL-37 instruują neutrofile, zmniejszają restenozę w stencie, zapewniając nowatorską koncepcję promowania gojenia naczyń krwionośnych po terapii interwencyjnej²¹.

Pomimo tych ograniczeń, model ten wydaje się być do tej pory najodpowiedniejszym systemem, a tym samym oszczędzającym pieniądze i czas, do badania nowych powłok leków do stentów i ich wpływu na zdarzenia molekularne podczas przebudowy tętnic. Co więcej, model ten można łatwo dostosować do chomika, który jest bardziej podobny do człowieka, dzięki czemu każdą hipotezę terapeutyczną można zweryfikować przed zastosowaniem u większych zwierząt lub człowieka, aby uniknąć nieprzyjemnych i nieoczekiwanych efektów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
stenty nitinolowe (wykonane samodzielnie z rozpórek nitinolowych)	Fort Wayne Metals, Castlebar, Irlandia NiTi#1, superelastyczne, wyżarzane prosto, lekki tlenek, średnica 500 μ m	produkt na zamówienie	Instytut Technologii Włókienniczej i Inżynierii Mechanicznej
Rura silikonowa	IFK Isofluor, Niemcy	produktu na zamówienie	500 μ m, grubość przekroju 100 μ m, cewnik z politetrafluoroetylenu
stereomikroskop Olympus		SZ/X9
kleszcze	FST, Niemcy	91197-00	standardowa końcówka zakrzywiona 0,17 mm
Ketamina 10%	CEVA, Niemcy
Ksylazyna 2%	Medistar, Niemcy
Bepanthene	Bayer, Niemcy
Nożyczki	FST, Niemcy	91460-11	Proste
nożyczki Vannas	Aesculap, Niemcy	OC 498 R
5/0 Silk	Seraflex	IC 108000
7/0 Silk	Seraflex	IC 1005171Z
prowadnik	Abbott Vascular	1001782-HC	0,014-calowy prowadnik angioplastyki
Klipsy do szwów Michel	Aesculap, Niemcy	BN507R	Wymiary: 7,5 x 1,75 mm
Michel Kleszcz	Aesculap, Niemcy	BN730R

średnica