Artykuł metodologiczny

Projektowanie i wykorzystanie multipleksowanych macierzy chemostatów

24K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50262

⸱

23 lutego 2013

 ,  ,  , 
1Department of Genome Sciences, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy i sprawdziliśmy zestaw miniaturowych chemostatów o niewielkich rozmiarach, zbudowanych z łatwo dostępnych części za niskie koszty. Wyniki ewolucji fizjologicznej i eksperymentalnej były podobne do chemostatów o większej objętości. Macierz ministat zapewnia kompaktową, niedrogą i dostępną platformę do tradycyjnych eksperymentów z chemostatem, genomiki funkcjonalnej i badań przesiewowych substancji chemicznych.

Streszczenie

Chemostaty to ciągłe systemy hodowli, w których komórki są hodowane w ściśle kontrolowanym, chemicznie stałym środowisku, gdzie gęstość hodowli jest ograniczona przez ograniczenie określonych składników odżywczych. 1,2 Dane z chemostatów są wysoce powtarzalne do pomiaru fenotypów ilościowych, ponieważ zapewniają stałe tempo wzrostu i środowisko w stanie ustalonym. Z tych powodów chemostaty stały się użytecznymi narzędziami do precyzyjnej charakterystyki fizjologii poprzez analizę ekspresji genów3-6 i innych cech kultur w stanie równowagi w stanie ustalonym. 7 Długoterminowe eksperymenty z chemostatami mogą wskazać konkretne trajektorie, które populacje drobnoustrojów przyjmują podczas ewolucji adaptacyjnej w kontrolowanym środowisku. W rzeczywistości chemostaty były używane do ewolucji eksperymentalnej od czasu ich wynalezienia. 8 Powszechnym wynikiem eksperymentów ewolucyjnych jest to, że każda replika biologiczna nabywa unikalny repertuar mutacji. 9-13 Ta różnorodność sugeruje, że jest jeszcze wiele do odkrycia, przeprowadzając eksperymenty ewolucyjne ze znacznie większą wydajnością.

Prezentujemy tutaj projekt i działanie stosunkowo prostej, taniej matrycy miniaturowych chemostatów - lub ministatów - i sprawdzamy ich użycie w określaniu fizjologii i eksperymentach ewolucyjnych z drożdżami. Takie podejście pociąga za sobą wzrost dziesiątek chemostatów spływających z jednej multipleksowanej pompy perystaltycznej. Kultury są utrzymywane w objętości roboczej 20 ml, co jest praktyczne w różnych zastosowaniach. Mamy nadzieję, że zwiększenie przepustowości, zmniejszenie kosztów i dostarczenie szczegółowych instrukcji budowy i obsługi może również zmotywować do badań i przemysłowego zastosowania tego projektu jako ogólnej platformy do funkcjonalnego charakteryzowania dużej liczby szczepów, gatunków i parametrów wzrostu, a także bibliotek genetycznych lub leków.

Wprowadzenie

Dynamika wzrostu i ewolucji mikroorganizmów jest fundamentalna dla mikrobiologii, ekologii, genetyki i biotechnologii. Najczęstszą metodą hodowli drobnoustrojów jest hodowla wsadowa, w której komórki są inokulowane o niskiej gęstości do bogatego w składniki odżywcze bulionu i hodowane do nasycenia. Chociaż jest to łatwe do przeprowadzenia przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, hodowle okresowe doświadczają zmiennego środowiska chemicznego i odpowiednio zmieniającej się fizjologii komórki. To niejednorodne środowisko wzrostu może powodować wtórny wzrost i efekty stresu, które mogą maskować subtelne różnice fizjologiczne. Ewolucja eksperymentalna poprzez seryjny transfer partii może selekcjonować złożone mieszaniny subpopulacji specyficznych dla fazy wzrostu, komplikując próby połączenia adaptacji do określonych warunków selektywnych. Pomiar fenotypów ilościowych może być trudny ze względu na szum spowodowany nieprecyzyjnym czasem próbkowania i zmiennością cech, takich jak czas opóźnienia. Hodowle ciągłe zapewniają alternatywny reżim wzrostu, w którym komórki mogą być odtwarzalnie hodowane w chemicznie jednorodnym środowisku z określoną szybkością wzrostu, aby osiągnąć fizjologiczny stan stabilny. Ze względu na te zalety, badania nad ewolucją eksperymentalną i charakterystyką stanu komórkowego często wykorzystują kontrolowane środowisko ciągłych kultur, takich jak chemostat. 14

Uznanie tych zalet doprowadziło do odrodzenia zainteresowania kulturami chemostatów. 15 Od czasu ich wprowadzenia w 1950 r.1,2 systemy chemostatu zostały opracowane tak, aby działały w różnych skalach, od litrów do mikrolitrów, i do różnych zastosowań. 16-19 Te różne konstrukcje, począwszy od bioreaktorów produkowanych komercyjnie, poprzez naczynia dmuchane ze szkła, aż po niestandardowe platformy mikrofluidyczne, mają wspólne ogólne zasady projektowania. Komora hodowlana jest mieszana i napowietrzana (zwykle przez bulgotanie przez nią powietrzem), a zawarte w niej drobnoustroje są przez cały czas jednorodnie rozproszone w komorze hodowlanej. Świeża pożywka o określonym składzie jest dodawana w sposób ciągły, a szybkość dodawania kontroluje tempo wzrostu i wpływa na środowisko chemiczne doświadczane przez kulturę. Przepełnienie ustawia objętość kultury w probówce wzrostowej, a przez ten przelew próbka kultury będzie pobierana w tym samym tempie, w jakim dostaje się świeże podłoże. W ten sposób kultury szybko osiągają fizjologiczny stan równowagi, w którym wiele parametrów biologicznych pozostaje stałych. Pomimo zalet chemostatów i doniesień o tych różnych platformach w literaturze, ich powszechne przyjęcie było ograniczone przez trudności w budowie i obsłudze tych systemów oraz wysokie koszty związane z opcjami komercyjnymi. Ponadto opisy jak wykonać i używać tych urządzeń mogą być nieprzejrzyste.

Prezentujemy projekty i instrukcje użytkowania miniaturowych chemostatów o niewielkich rozmiarach, zbudowanych z łatwo dostępnych części po niskich kosztach. Obserwujemy wysoce spójne parametry eksperymentalne i powtarzalne wyniki, porównując nasze urządzenie z raportowanymi danymi dotyczącymi drożdży hodowanych w komercyjnych bioreaktorach o większej objętości. Obejmuje to odtwarzalność fizjologii komórkowej obserwowaną poprzez osiągnięcie równowagi w stanie ustalonym w ciągu 10-15 pokoleń i uzyskanie podobnych gęstości kultur w stanie równowagi. Ponadto wzorce ekspresji genów są spójne między ministatami a komercyjną platformą o większej objętości. Stabilność szybkości rozcieńczania, gęstość optyczna i odtwarzalność ekspresji genów między trzema powtórzonymi kulturami świadczą o solidności naszej platformy. Pokazujemy również, że te same mutacje adaptacyjne powstają w podobnych skalach czasowych ewolucji eksperymentalnej, jak w przypadku chemostatów o większej objętości.

Protokół

Używaj odpowiedniej techniki sterylnej w całym protokole.

1. Składanie części i przygotowanie tablicy Ministat

  1. Zamów wszystkie części.
  2. Wyczyść szklane rurki. Oznaczyć probówki o objętości 20 ml.
  3. Wykonaj zespoły korkowe z portami powietrza, mediów i ścieków i umieść je na górze oczyszczonych szklanych probówek hodowlanych.
  4. Przygotuj komory nawilżające i ułóż wszystkie nieautoklawowane części.
  5. Wykonaj rurki powietrza, ścieków i mediów, używając przewodów o wystarczającej długości i kompatybilnych złączy.
  6. Podłącz każdy rodzaj przewodów (powietrze, media i ścieki) do zespołów korkowych i filtrów foliowych oraz szybkozłączki mediów, aby przygotować je do autoklawu.
  7. Przygotować gąsiornik do użycia w celu przygotowania sterylnego podłoża chemostatu.
  8. Przygotować butelki do pobierania próbek kultur, wkładając gumowy korek z dwoma otworami z odpowiednimi łącznikami. Zafoliuj każdy filtr, aby przygotować go do autoklawu.
  9. Dopasuj zmontowaną matrycę starannie do jednej lub więcej tac autoklawu i autoklaw wszystkie części.
  10. Wytwarzać i filtrować pożywki chemostatowe do autoklawowanych balonów.

2. Przygotowanie eksperymentu

  1. Napełnij każdą kolbę hydracyjną 700 ml ddH2O.
  2. Umieść autoklawowane ministaty w bloku grzewczym ustawionym na żądaną temperaturę.
  3. Umieść linie lotnicze w 4-portowym kolektorze i włącz pompę powietrza.
  4. Podłącz przewody ściekowe do butelek zbiorczych o pojemności 100 ml.
  5. Usuń folię z końca rurki mediów i gąsiora na nośnik i połącz dwa szybkozłącza. Przeciągnij każdą długość rurki pompy przez wkład pompy perystaltycznej i zatrzaśnij je na swoim miejscu. Włącz pompę mediów.
  6. Niech komory się wypełnią. Wyłącz pompę mediów.
  7. Spryskaj zespoły korka 70% etanolem i zaszczep kultury za pomocą strzykawki. W razie potrzeby należy zachować próbkę inokulum jako zamrożony zapas glicerolu. Pozwól kulturom rosnąć przez 30 godzin.
  8. Dostosuj wysokość igły odpływu, aż objętość kultury zostanie ustawiona na 20 ml przy wyłączonym przepływie powietrza. Może to wymagać kilku korekt w ciągu godziny. Po zakończeniu ponownie włącz przepływ powietrza.
  9. Włącz pompę mediów.
  10. Opróżnij butelki do pobierania próbek ścieków, które zawierają pożywkę zebraną podczas ustawiania objętości kultury roboczej, i zapisz czas.
  11. Aby wykonać pomiar w czasie zerowym, umieść przewody ściekowe w sterylnych probówkach zbiorczych na 15 min-2 godziny (w zależności od objętości, którą chcesz pobrać do analizy DNA). W razie potrzeby przygotuj również zamrożony bulion glicerolowy dla każdej kultury.

3. Codzienne pomiary

  1. Podobnie jak w przypadku pomiaru czasu zerowego, pobieraj próbki na lodzie przez 15 min-2 godziny (zgodnie z wymaganiami eksperymentu) na lodzie i zapisuj czas pobierania próbek DNA i zamrożonych próbek wyjściowych.
  2. W przypadku próbek RNA należy pobrać niewielką objętość za pomocą strzykawki i igły 22G 5" z kultury lub odkorkować każdy ministat, aby zebrać całą kulturę. Próbki muszą być pobierane szybko, pobierane przez filtrację i natychmiast zamrażane w ciekłym azocie.
  3. Zmierzyć ścieki zebrane od ostatniego pobierania próbek dla każdego ministatu w celu ilościowego określenia stopnia rozcieńczenia. W razie potrzeby dostosuj szybkość rozcieńczania, ponownie regulując ustawienie pompy lub dostrajając precyzyjną regulację na poszczególnych przewodach pompy.
  4. Wymień przewody ściekowe w pustych butelkach zbiorczych.
  5. Określ ilościowo komórki/ml, a także inne interesujące punkty końcowe i przygotuj zamrożony zapas glicerolu.

4. Sprzątanie po eksperymencie

  1. Umieść wszystkie rurki w osobnych tackach i nadmiernie spłucz ddH2O. Suche rurki za pomocą pompy akwariowej.
  2. Wyczyść zespoły korka za pomocą ddH2O i użyj wkładki igły do czyszczenia igieł, kolejno zasysając i dozując wodę. Wytrzyj zewnętrzną część igieł i korka, aby usunąć wszelkie pozostałości mediów.
  3. Wyczyść szklaną rurkę wodą i etanolem i usuń zanieczyszczenia fizyczne za pomocą 3 zwiniętych chusteczek Kimwipes i kleszczyków.
  4. Przed użyciem ponownie spłucz i wysusz wszystkie części.

Wyniki

Opisany powyżej i na (Rycina 1A, B) układ ministatów został wykorzystany do hodowli haploidalnego laboratoryjnego szczepu drożdży pączkujących MATa (S288c) w warunkach ograniczonej dostępności siarczanów, zgodnie z wcześniejszymi opisami.10 Przetestowano skuteczność urządzenia w typowych zastosowaniach chemostatu, w tym w określaniu fizjologii oraz w ewolucji eksperymentalnej. W celu walidacji ministatów powtórzono kilka eksperymentów, które wcześniej przeprowadzono w fermentorach przemysłowych zmodyfikowanych do pracy w trybie chemostatu.10,20,21 Fermentory ATR Sixfors pracowały przy objętości roboczej 300 ml, co stanowi ponad dziesięciokrotność objętości ministatów, i posiadają znacznie odmienne tryby napowietrzania oraz mieszania hodowli. Podjęto próbę odwzorowania stabilności sprzętu, fizjologii w stanie stacjonarnym, wyników ewolucji eksperymentalnej oraz wzorców ekspresji genów uzyskanych przy użyciu tych fermentorów.

Ponieważ jednolitość szybkości rozcieńczania i napowietrzania są istotnymi aspektami konstrukcji chemostatu, zmierzyliśmy rzeczywistą szybkość rozcieńczania w 32 ministatach po 15 generacjach wzrostu i stwierdzono, że przy docelowej szybkości rozcieńczania 0,17 vol/hr (4-5 kropel/min) osiągnięto średnią szybkość rozcieńczania 0,17208 z odchyleniem standardowym 0,0075 w 32 powtórzeniach. Zakres ten mieścił się w naszej typowej tolerancji różnicy +/-0,01 vol/hr od wartości docelowej, powyżej której obserwowano znaczne zmiany w ekspresji genów.22-23 W 4 ministatach prędkość przepływu powietrza wyniosła 307,5 ml/min z odchyleniem standardowym 9,57 ml/min. Sugeruje to, że przepływ powietrza do komór jest stabilny i równomiernie rozdzielony między 4 komory, a uzyskana wartość jest zbliżona do opisanej dla napowietrzania w fermentorach przemysłowych.20

Wcześniej zaobserwowaliśmy nawracającą amplifikację wysokoafinitywnego transportera jonów siarki SUL1 w 8/8 eksperymentach ewolucyjnych z ograniczeniem siarczanów u drożdży.10 Ze względu na spójność wyników w tych warunkach, wybraliśmy ograniczenie siarczanów do przetestowania możliwości naszego systemu. Niezbędnym elementem hodowli w chemostacie jest konieczność utrzymania stałego środowiska chemicznego. Wahania w dostępności ograniczającego składnika odżywczego lub inne zmiany w środowisku zazwyczaj skutkują zmianą liczby komórek w danej kulturze. Zmierzyliśmy gęstość optyczną jako wskaźnik liczby komórek (Rysunek 2A) i oceniliśmy powtarzalność w 16 kulturach powtórzonych, uzyskując średnią wartość A600 wynoszącą 1,12 (~109 komórek) po ~15 generacjach wzrostu, z odchyleniem standardowym 0,057 jednostki, czyli 5,1%. Dla porównania, pomiary wykonane w 4 kulturach powtórzonych hodowanych w fermentorach przemysłowych wykazały odchylenie standardowe wynoszące 2,5%. Komórki były dobrze wymieszane w komorze wzrostowej: pomiary OD i liczby komórek pobrane z kanału odpływowego były równoważne próbkom pobranym bezpośrednio z probówki z kulturą (dane nie pokazano). Wyniki te demonstrują stabilność naszej platformy oraz zdolność do utrzymania stałego środowiska chemicznego w zakresie tolerancji zbliżonym do fermentora przemysłowego.

Aby uzyskać bardziej czuły odczyt fizjologii, porównaliśmy genomową ekspresję genów w stanie stacjonarnym w kulturach hodowanych w warunkach ograniczenia siarczanów w ministatach oraz w fermentorze przemysłowym. Ekspresja genów w ministatach wykazała wysoki stopień podobieństwa w trzech powtórzeniach biologicznych (Ryc. 2B). Wcześniej zauważyliśmy, że dla RNA pochodzącego z dwóch powtórzeń w chemostatach Sixfors, które poddano co-hybrydyzacji na mikromacierzy, ekspresja 99% genów mieściła się w zakresie 1,5-krotnym, co pozwoliło na zastosowanie wartości 1,5X jako empirycznego progu istotności.21 W przypadku ekspresji genów z trzech powtórzeń w ministatach, porównanych parami, 99% genów mieściło się w zakresie 1,5-1,7-krotnym, co jest wynikiem porównywalnym z wynikami z fermentorów przemysłowych. Trzy próbki poddano hybrydyzacji na oddzielnych macierzach, a stosunki par obliczono następnie, zatem wartości te obejmują szum międzymacierzowy oprócz szumu biologicznego, co potencjalnie zawyża zmienność między powtórzeniami w porównaniu z opublikowanymi wynikami co-hybrydyzacji. 138 genów wykazało ekspresję różnicową >1,5-krotną we wszystkich trzech powtórzeniach w ministatach w porównaniu z próbką pobraną z odpowiadającej im kultury hodowanej w fermentorze przemysłowym. Geny o obniżonej ekspresji w ministatach były silnie wzbogacone w procesy metabolizmu żelaza. Sygnatura ta może odzwierciedlać różny skład metaliczny każdej z konfiguracji urządzeń: aparat Sixfors zawiera metalowy impeller i zespół napowietrzający zanurzony w kulturze, a wcześniej stosowane gąsiory z pożywką również wymagały metalowych okuć. Ministat wykorzystuje igły ze stali nierdzewnej, ale nie posiada innych metalowych komponentów. Geny o zwiększonej ekspresji były w dużej mierze związane z błonami komórkowymi, choć znaczenie biologiczne tego powiązania pozostaje niejasne.

Na koniec przetestowaliśmy ewolucję eksperymentalną w tych warunkach. Po 250 generacjach wzrostu z ograniczoną ilością siarczanów 4/4 klonów przebadanych z 4 niezależnych ewoluujących populacji wykazały amplifikację SUL1, co wykryto za pomocą porównawczej hybrydyzacji genomicznej w układzie macierzowym (CGH, Rysunek 2C). Wynik ten jest zgodny z ustaleniami uzyskanymi w chemostatach o większej objętości w podobnych odstępach czasu.10

Schemat hodowli drobnoustrojów z gąsiorem z pożywką, pompą perystaltyczną, komorami, napowietrzaniem i układem pobierania próbek.
Rycina 1. A. Projekt i układ zestawu ministat. B. Projekt komory hodowlanej.

Analiza wzrostu drobnoustrojów: wykres (A600 względem generacji), mapa ciepła ekspresji genów, liczba kopii genomowych.
Rysunek 2. A. Dane eksperymentalne wykazujące, że kultury osiągają stan równowagi w ciągu dziesięciu generacji wzrostu (n=16). B. Dane ekspresji dla trzech powtórzeń biologicznych S1-3 pobranych podczas stanu stacjonarnego przy ograniczeniu siarczanów w porównaniu z wspólną referencją hodowaną w dopasowanym chemostacie Sixfors z ograniczeniem siarczanów. C. Amplifikacje SUL1 odzyskane w ministatach po 250 generacjach wzrostu w środowisku z ograniczeniem siarczanów. DNA genomowe każdego ewoluowanego klonu porównano z DNA przodka metodą CGH zgodnie z opisem.21 Średnią liczbę kopii obliczono dla każdego amplifikowanego regionu i przedstawiono obok każdego amplikonu. Wszystkie dane z mikromacierzy zostały zdeponowane w bazie danych GEO pod numerem dostępu GSE36691. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Uprawa chemostatu w ministatach, jak w przypadku każdego chemostatu, wymaga dbałości o szczegóły i rozwiązywania problemów. Ponieważ zanieczyszczenie jest dużym problemem w ciągłych eksperymentach z kulturami, zwykle patrzymy przez mikroskop na skażenie bakteryjne i grzybicze po zaszczepieniu i co 50 pokoleń podczas długoterminowych eksperymentów ewolucyjnych. Do tej pory nie zaobserwowaliśmy skażenia w 96 eksperymentach ewolucyjnych obejmujących więcej niż 300 pokoleń (dane nie pokazane). Aby przetestować zanieczyszczenie krzyżowe między ministatami i potencjał mikroorganizmów do kolonizacji komory hodowlanej za pomocą linii ściekowej, przeprowadziliśmy 16 ministatów, tak aby każdy inny ministat został zaszczepiony drożdżami, jak powyżej, a reszta nie została zaszczepiona żadną kulturą. Próbki kultur pobierano do pojemnika na odpady komunalne, który był opróżniany co drugi dzień. Tak więc, gdyby możliwe było przedostanie się zanieczyszczeń przez linię ściekową, prawdopodobnie zaobserwowalibyśmy to w tym eksperymencie. W ciągu trzech tygodni i ponad 100 pokoleń wzrostu w tym schemacie szachownicy kultur inokulowanych i niezaszczepionych nie zaobserwowaliśmy wzrostu w niezaszczepionych probówkach z ministatami, co sugeruje, że jest mało prawdopodobne, aby zanieczyszczenie drożdżami lub innymi drobnoustrojami wystąpiło w eksperymentach o podobnych ramach czasowych.

Mimo, że ministaty zostały zaprojektowane tak, aby działały w sposób analogiczny do komercyjnych chemostatów, modułowy charakter tego układu pozwala na optymalizację w celu dopasowania do potrzeb i budżetu użytkowników. Pompa perystaltyczna zastosowana w tym protokole może osiągać natężenia przepływu od 0,0186 obj./godz. do 3,6 obj./godz. (dane nie pokazane). Większą kontrolę nad szybkościami rozcieńczania można osiągnąć za pomocą alternatywnych modeli pomp. Należy pamiętać, że praca z niższymi szybkościami rozcieńczania może wymagać zastąpienia igły o wyższej grubości w celu osiągnięcia tej samej częstotliwości dostarczania kropel. Wielkość populacji jest ważnym czynnikiem dla prawidłowego projektowania eksperymentów ewolucyjnych. Zastosowana tutaj standardowa szybkość rozcieńczania i stężenie składników odżywczych zapewnia stosunkowo dużą wielkość populacji (~109 komórek) tego samego rzędu wielkości, co opublikowane badania ewolucji. 11 Większe lub mniejsze populacje można utrzymać poprzez zmianę objętości roboczej lub ograniczenie stężenia składników odżywczych. Zwiększoną podaż mutacji można również uzyskać poprzez pracę ze szczepami o podwyższonym wskaźniku mutacji.

Ministatystyki również mogłyby zostać ulepszone w stosunku do naszego obecnego projektu. Na przykład kondensacja może gromadzić się na ściankach rurki hodowlanej i można ją znacznie ograniczyć, stosując głęboką kąpiel wodną, inkubator lub pomieszczenie o stałej temperaturze. Chociaż zbrylanie się i wzrost ścian w kulturach ograniczonych siarczanami wydaje się być stosunkowo rzadki, pojawiając się w eksperymentach ewolucji 5/48 przez 300 pokoleń (dane nie pokazane), dostępne są różne środki powierzchniowo czynne, które mogą pomóc w zmniejszeniu lub opóźnieniu tej cechy. W przypadku, gdy zbrylanie przeszkadza w odpowiednim mieszaniu kultur, zwiększone mieszanie można osiągnąć poprzez zmniejszenie liczby sposobów podziału każdej pompy powietrza lub dodanie aparatu mieszającego. Można również dołączyć dodatkowe sondy do pomiaru stężenia rozpuszczonego gazu, pH lub innych parametrów, podobnie jak w niektórych innych konstrukcjach. 17

Pomimo potencjalnych modyfikacji, korzystając z ministatów opisanych w tym protokole, zaobserwowaliśmy wysoce spójne parametry eksperymentalne i powtarzalne wyniki podczas porównywania naszego urządzenia z danymi raportowanymi dla większych objętości komercyjnych chemostatów. Obejmowało to odtwarzalność fizjologii komórkowej obserwowaną poprzez osiągnięcie równowagi w stanie ustalonym w ciągu 10-15 pokoleń (ryc. 2A) i uzyskanie podobnych gęstości kultur w stanie równowagi. Wzorce ekspresji genów były spójne w trzech replikacjach biologicznych w ministatach oraz między ministatami a komercyjnymi platformami o dużej objętości (Figura 2B), z wyjątkiem genów metabolizmu żelaza. Te różnice w ekspresji są prawdopodobnie spowodowane zmianami w zawartości metalu w obu urządzeniach lub poprawą jakości składników pożywki. Nasze dane sugerują, że ministaty będą przydatne w eksperymentach fizjologicznych lub wyczynowych, w których wymagane jest spójne środowisko.

Aby sprawdzić, czy projekt ministatu jest wystarczający do zastosowań w ewolucji eksperymentalnej, ewoluowaliśmy kultury pod ograniczeniem siarczanów przez 250 pokoleń i użyliśmy CGH do scharakteryzowania amplifikacji w locus SUL1 - cechy charakterystycznej długoterminowej ewolucji w tych warunkach w chemostatach o większej objętości. 10 Zaobserwowaliśmy amplifikację SUL1 w klonach z niezależnych eksperymentów ewolucyjnych 4/4 w pożywkach o ograniczonej zawartości siarczanów (Figura 2C). Ogólnie rzecz biorąc, dane te sugerują, że ministaty są solidną platformą, która może być przydatna w wielu tradycyjnych zastosowaniach chemostatu. Chociaż wykazaliśmy ich zastosowanie w hodowli pączkujących drożdży, ministaty powinny być również kompatybilne z innymi organizmami, a podobne projekty zostały w rzeczywistości wykorzystane do hodowli bakterii i innych gatunków drożdży. 16,17,25 Co więcej, mniejsza objętość hodowli i związane z tym zmniejszone zapotrzebowanie na pożywki mogą sprawić, że ministaty staną się atrakcyjną alternatywą dla eksperymentów wymagających drogich lub egzotycznych odczynników, jak to może mieć miejsce w przypadku badań chemicznych lub genetycznych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Stworzenie filmu było wspierane przez granty z National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) oraz National Institute of General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) z National Institutes of Health. Prace te były również wspierane przez granty NSF 1120425. MJD jest stypendystką Fundacji Rity Allen. AWM jest częściowo obsługiwany przez NIH T32 HG00035. Dziękujemy Annie Sunshine za pomoc w ulepszaniu protokołów. Ponadto uznajemy Sarę DiRienzi, Celię Payen i Amy Sirr za pierwszych użytkowników ministatów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka silikonowa 3/32" x 7/32"VWR63009-260Rurka: Zamówienie: (pakiet cewek 50')
Rurka silikonowa 1/2" x 5/8" (bardzo duża)VWR63009-299Rurka: Zamówienie: (pakiet cewek 50')
Rurka silikonowa 1/4" x 3/8" (średnia)VWR63009-279Przewody rurowe: Zamówienie: (pakiet cewek 50')
Pomarańczowo-zielone rurkipompy marprenuWatson-Marlow978.0038.00+Przewody: Zamówienie: 6x(opakowanie 6 sztuk)
Żeńskie luer, 1/8" zadziorCole ParmerHV-45500-04Złącza: Zamówienie: 4x(opakowanie 25 sztuk)
Męski zamek luer, 1/8" zadziorCole ParmerHV-45503-04Złącza: Zamówienie: 1x (opakowanie 25 szt.)
Łącznik redukcyjny, PVDF, 1/4" do 1/8"Cole ParmerEW-30703-50Złącza: Zamówienie: 1x (opakowanie 10 szt.)
Złącze kolczaste Y, 1/8" IDCole ParmerHV-30703-92Złącza: Zamówienie: 3x (opakowanie 10 sztuk)
Średnie zaciski do wężyVWR63022-405Zaciski: Zamówienie: 1x(opakowanie 12 sztuk)
Day Pinchcock (metalowy zacisk do rurek)VWR21730-001Zaciski: Zamówienie: 1x(opakowanie 10 sztuk)
Szybkozłącze z zaworem męskim inline, Pasuje do rurki: 1/4 cala.Fisher05-112-39Złącza: Zamówienie: 1x (opakowanie 25 sztuk)
Szybkozłącze z zaworem żeńskim w linii, Pasuje do rurek: 1/4 cala. ID, polipropylenFisher05-112-37Złącza: Zamówienie: 1x(opakowanie 5)
Ciche pompy powietrzaAkwarium Guys.com 212422Dopływ powietrza: Zamówienie: 4 pompy
Filtry PTFE, 0,45 μ m, do filtracji powietrzaCole ParmerHV-02915-22 Dopływ powietrza: Zamówienie: 1x(pudełko 100)
1L Kolba z bronią bocznąFisher10-181FDopływ powietrza: Zamówienie: 2x(Opakowanie 6)
#8 silikonowy korek, otwór 3/8 cala, do kolb bocznychFisherK953715-0801Dopływ powietrza: Zamówienie: 8 korków
4-portowy kolektorCole ParmerEW-06464-85Dopływ powietrza: Zamówienie: 8 rozdzielaczy
55 ml Zakręcane probówki hodowlaneCorning Life Sciences9825-25Komora hodowlana: Zamówienie: 2x(opakowanie 48 sztuk)
Regularna biała igła do piałka podskórnego, 16G, długość 5 cali do linii ściekowejFisher14-817-105Komora hodowlana: Zamówienie: 1x(opakowanie 100 sztuk)
Igła do nakłucia lędźwiowegoVWRBD40836Komora hodowlana: Zamówienie: 4x(opakowanie 10 sztuk)
Regularna różowa igła podskórnaFisher14-817-104Komora hodowlana: Zamówienie: 1x(opakowanie 100 sztuk)
Pianka Silikonowy korek rozmiar "2", różowyCole ParmerEW-06298-06Komora hodowlana: Zamówienie: 2x(opakowanie 20 sztuk)
Stojak na rurki 8-dołkoweVWR82024-452Komora hodowlana: Zamówienie: 4 stojaki
Butelka zbiornika 10L z dolnym wylotem węża: bezpieczny próżniowoVWR89001-530Media: Zamówienie: 2 lub więcej
Żółty silikonowy korek z pianki, niestandardowy rozmiar 12Cole ParmerEW-06298-22Media: Zamówienie: 2 lub więcej
Filtr odpowietrzający CarboyFisherSLFG 050 10Media: Zamówienie: 1x(opakowanie 10 sztuk)
Taśma izolacyjna, zielona<a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com10851-BA-10Media: Zamów 1 rolkę.
Filtr butelkowy, 1L, .2 μ m, 45 mmVWR29442-978Media: Zamówienie: (1 opakowanie 12)
5000 ml Butelka zbiornika z dolnym wylotem: bezpieczna próżniowoVWR89003-384Media: (Opcjonalnie)
Niebieska pianka Korek silikonowy, niestandardowyrozmiar 10 1/2Cole ParmerEW-06298-18Media: (Opcjonalnie)
205S/CA16, 16 Pompa nabojowaWatson-Marlow020.3716.00A Pompamediów: Zamówienie: 1
16-kanałowa 205CA Przedłużająca głowica pompyWatson-Marlow023.1401.000Pompa mediów: Zamówienie: 2 głowice pompy przedłużającej
Silikonowa uszczelniarka akwariowaFisherS18180BPompa medialna: Zamówienie: 1
6-blokowa sucha kąpielVWR12621-120Blok grzewczy: Zamówienie: 2 na 32 ministaty lub 1 na 16.
Blok do kąpieli suchej, probówka 6 x 25 mm na blokVWR12621-120Blok grzewczy: Zamówienie: 12 dla 32 ministatów lub 6 dla 16.
Filtry membranowe nylonowe, 0,45 μ m Wielkość porów; Średnica: 25 mmFisherR04SP02500Zbiory: Zamówienie: 1x (opakowanie 100 sztuk) (opcjonalnie)
Filtry membranowe nylonowe, 0,45 i mu; m Wielkość porów; 45 mmFisherR04SP04700Zbiór: Zamówienie: 1x(opakowanie 100 sztuk) (opcjonalnie)
47 mm, duży aparat filtrującyFisherXX10 047 30Zbiór: Zamówienie: 1 (opcjonalnie)
Szklany uchwyt filtra, 25 mm, mały aparat filtrującyVWR26316-692Zbiór: Zamówienie: 1 (opcjonalnie)Kolba
Dewara, 1L do ciekłego azotuVWR63380-052Zbiór: Zamówienie: 1 (opcjonalnie)

Bibliografia

  1. Monod, J. Récherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  2. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 15, 715-716 (1950).
  3. Daran-Lapujade, P., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast. Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).
  4. ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).
  5. Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  6. Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation. 101, 3148-3153 (2004).
  7. Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).
  8. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  9. Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors. Mutation Res. 1, 113-120 (1964).
  10. Gresham, D., Dunham, M. J., et al. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genet. 4, e1000303(2008).
  11. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  12. Kvitek, D. J., Sherlock, G. Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape. PLoS Genet. 7, e1002056(2011).
  13. Helling, R. B., Adams, J. Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment. Genetics. 116, 349-358 (1987).
  14. Dunham, M. J. Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide. Methods Enzymol. 470, (2010).
  15. Hoskisson, P. A., Hobbs, G. Continuous culture - making a comeback. Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).
  16. Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).
  17. Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas. Biotechnol. and bioeng. , (2012).
  18. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  19. Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  20. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures. Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).
  21. Torres, E. M., Amon, A., et al. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317, 916-924 (2007).
  22. Regenberg, B., Nielsen, J., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology. 7, R107(2006).
  23. Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. Journal of Biology. 6, 4(2007).
  24. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  25. Ferenci, T. Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment. Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mini Statspompa perystaltycznaewolucja eksperymentalnahodowla drożdżyobjętość hodowliszybkość przepływu pożywkinawilżanie powietrzabutelki do pobierania próbeksterylizacja w autoklawie
Projektowanie i wykorzystanie multipleksowanych macierzy chemostatów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.