Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody sekwencjonowania ChIP (ChIP-seq) bezpośrednio oferują pokrycie całego genomu, gdzie połączenie immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i sekwencjonowania masowo równoległego może być wykorzystane do identyfikacji repertuaru sekwencji DNA ssaków związanych czynnikami transkrypcyjnymi in vivo. Technologie sekwencjonowania genomu "nowej generacji" zapewniają 1-2 rzędy wielkości wzrost ilości sekwencji, którą można wygenerować w sposób opłacalny, w porównaniu ze starszymi technologiami, umożliwiając w ten sposób metodom ChIP-seq bezpośrednie pokrycie całego genomu w celu skutecznego profilowania interakcji białko-DNA ssaków.
Aby metody ChIP-seq były skuteczne, należy wygenerować wysokiej jakości szablon DNA ChIP, aby uzyskać najlepsze wyniki sekwencjonowania. Opis opiera się na doświadczeniach z produktem białkowym genu najsilniej zaangażowanego w patogenezę cukrzycy typu 2, a mianowicie czynnikiem transkrypcyjnym czynnika transkrypcyjnego 7-podobnego 2 (TCF7L2). Czynnik ten jest również związany z różnymi nowotworami.
Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości matrycy DNA ChIP pochodzącej z linii komórkowej raka jelita grubego, HCT116, w celu zbudowania mapy o wysokiej rozdzielczości poprzez sekwencjonowanie w celu określenia genów związanych przez TCF7L2, co daje dalszy wgląd w jego kluczową rolę w patogenezie złożonych cech.
Wprowadzenie
Przez wiele lat istniała niezaspokojona potrzeba identyfikacji zestawu genów związanych i regulowanych przez dany genom białka, w szczególności tych z klasy czynników transkrypcyjnych.
Odom et al.W badaniu 1 zastosowano immunoprecypitację chromatyny (ChIP) w połączeniu z mikromacierzami promotorów w celu systematycznej identyfikacji genów zajmowanych przez wcześniej określone regulatory transkrypcji w ludzkiej wątrobie i wyspach trzustkowych. Następnie Johnson i wsp.W ramach projektu 2 opracowano zakrojony na szeroką skalę test immunoprecypitacji chromatyny oparty na bezpośrednim sekwencjonowaniu DNA ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Chromatyna sieciowana
- Hoduj komórki w szalkach do hodowli komórkowych o wymiarach 100x20mm. Ilość komórek może wynosić od 1 do 10 milionów komórek na naczynie, w zależności od typu komórki. Do jednej immunoprecypitacji wystarcza około 2 miliony komórek.
- Usieciuj komórki w 1% formaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym kołysaniem.
- Utwardzać sieciowanie, dodając końcowe stężenie 125 mM glicyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj komórki dwukrotnie 1X solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zdekantuj PBS, a następnie dodaj 0,2 ml PBS.
- Zbierz komórki za pomocą pl....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po sonikacji chromatyny i potraktowaniu jej RNazą oraz proteinazą, próbki poddane elektroforezie na 2% żelu agarozowym powinny wykazać rozmazanie z większością DNA w pożądanym zakresie wielkości. W przypadku przetestowania kilku różnych cykli, wraz ze wzrostem ich liczby powinno być widoczne stopniowe zmniejszenie wielkości fragmentów (Rysunek 2).
Po zakończeniu części protokołu dotyczącej immunoprecypitacji, wzbogacenie można sprawdzić za pomocą PCR lub PCR w czasie rzeczywis.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecnie możliwe jest przeprowadzenie całego genomu profilu asocjacji interakcji białko-DNA przy użyciu ChIP-seq, jak to niedawno wykazano w przypadku innych czynników transkrypcyjnych2,3. Kluczem do pomyślnego wyniku sekwencjonowania jest wygenerowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny.
Po wygenerowaniu matrycy DNA i upewnieniu się, że jest ona odpowiednio wzbogacona, można ją następnie wykorzystać w bibliotece do późniejszego sekwencjonowania. Na przykła.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Praca jest wspierana przez Institute Development Award od The Children's Hospital of Philadelphia.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | |
| Zestaw EZ-ChIP | Millipore | 17-371 | |
| GoTaq Gorący start Polimeraza | Promega | M5001 | |
| Misonix Sonicator | Qsonica | XL-2000 | |
| NanoDrop 1000 Spektrofotometr | Thermo-Scientific | ||
| Sekwencje starterów kontroli pozytywnej (TCF7L2-1) Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' Sekwencje starterów kontroli ujemnej (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTCTCTGATGGGAAC-3' Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3' |
Bibliografia
- Odom, D. T., et al. Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors. Science. 303, 1378-1381 (2004).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316, 1497-1....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
