Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Podsumowanie

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Streszczenie

Metody sekwencjonowania ChIP (ChIP-seq) bezpośrednio oferują pokrycie całego genomu, gdzie połączenie immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i sekwencjonowania masowo równoległego może być wykorzystane do identyfikacji repertuaru sekwencji DNA ssaków związanych czynnikami transkrypcyjnymi in vivo. Technologie sekwencjonowania genomu "nowej generacji" zapewniają 1-2 rzędy wielkości wzrost ilości sekwencji, którą można wygenerować w sposób opłacalny, w porównaniu ze starszymi technologiami, umożliwiając w ten sposób metodom ChIP-seq bezpośrednie pokrycie całego genomu w celu skutecznego profilowania interakcji białko-DNA ssaków.

Aby metody ChIP-seq były skuteczne, należy wygenerować wysokiej jakości szablon DNA ChIP, aby uzyskać najlepsze wyniki sekwencjonowania. Opis opiera się na doświadczeniach z produktem białkowym genu najsilniej zaangażowanego w patogenezę cukrzycy typu 2, a mianowicie czynnikiem transkrypcyjnym czynnika transkrypcyjnego 7-podobnego 2 (TCF7L2). Czynnik ten jest również związany z różnymi nowotworami.

Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości matrycy DNA ChIP pochodzącej z linii komórkowej raka jelita grubego, HCT116, w celu zbudowania mapy o wysokiej rozdzielczości poprzez sekwencjonowanie w celu określenia genów związanych przez TCF7L2, co daje dalszy wgląd w jego kluczową rolę w patogenezie złożonych cech.

Wprowadzenie

Przez wiele lat istniała niezaspokojona potrzeba identyfikacji zestawu genów związanych i regulowanych przez dany genom białka, w szczególności tych z klasy czynników transkrypcyjnych.

Odom et al.^{W badaniu 1} zastosowano immunoprecypitację chromatyny (ChIP) w połączeniu z mikromacierzami promotorów w celu systematycznej identyfikacji genów zajmowanych przez wcześniej określone regulatory transkrypcji w ludzkiej wątrobie i wyspach trzustkowych. Następnie Johnson i wsp.^{W ramach projektu 2} opracowano zakrojony na szeroką skalę test immunoprecypitacji chromatyny oparty na bezpośrednim sekwencjonowaniu DNA o ultraprzepustowości (ChIP-seq) w celu kompleksowego mapowania interakcji białko-DNA w całych genomach ssaków. W ramach testu zmapowali in vivo wiązanie czynnika tłumika ograniczającego neurony (NRSF) z lokalizacjami w 1946 roku w ludzkim genomie. Dane wykazały wyraźną rozdzielczość pozycji wiązania (+50 par zasad), co ułatwiło zarówno izolację motywów, jak i identyfikację motywów wiążących NRSF. Te dane ChIP-seq miały również wysoką czułość i swoistość oraz pewność statystyczną (P < 10⁻⁴), właściwości, które są ważne dla wnioskowania o nowych interakcjach kandydujących.

Robertson et al.^{W ramach projektu 3} wykorzystano również ChIP-seq w celu mapowania celów STAT1 w stymulowanych interferonem γ (IFN-γ) i niestymulowanych ludzkich komórkach HeLa S3 in vivo. Za pomocą ChIP-seq, wykorzystując 15,1 i 12,9 miliona unikalnie zmapowanych odczytów sekwencji oraz szacowany wskaźnik fałszywych odkryć mniejszy niż 0,001, zidentyfikowali 41 582 i 11 004 przypuszczalne regiony wiążące STAT1 odpowiednio w komórkach stymulowanych i niestymulowanych. Spośród 34 loci, o których wiadomo, że zawierają miejsca wiązania reagujące na interferon STAT1^4-8, ChIP-seq znalazł 24 (71%). Cele ChIP-seq zostały wzbogacone w sekwencje podobne do znanych motywów wiązania STAT1. Porównania z dwoma istniejącymi zestawami danych ChIP-PCR sugerowały, że czułość ChIP-seq wynosiła od 70% do 92%, a swoistość wynosiła co najmniej 95%. Ponadto było jasne, że ChIP-seq oferuje zarówno niską złożoność analityczną, jak i czułość, która wzrasta wraz z głębokością sekwencjonowania.

W związku z tym, technologie sekwencjonowania genomu "nowej generacji" zapewniają 1-2 rzędy wielkości wzrost ilości sekwencji, która może być efektywnie generowana w porównaniu ze starszymi technologiami⁹. Metody ChIP-seq zapewniają zatem bezpośrednie pokrycie całego genomu w celu skutecznego profilowania interakcji białko-DNA ssaków³.

W 2006 roku odkryto silne powiązanie wariantów genu czynnika transkrypcyjnego 7-like 2 (TCF7L2) z cukrzycą typu 2¹⁰. Inni badacze już niezależnie powtórzyli to odkrycie w różnych grupach etnicznych i, co ciekawe, z pierwszych badań asocjacyjnych całego genomu cukrzycy typu 2 opublikowanych w Nature^11,12, Science^13-15 i gdzie indziej^16,17, najsilniejszy związek był rzeczywiście z TCF7L2; Jest to obecnie uważane za najważniejsze odkrycie genetyczne w cukrzycy typu 2 do^{tej pory w wieku 18-20} lat. Ponadto TCF7L2 został powiązany z ryzykiem zachorowania na raka ^21,22; w rzeczywistości związek ten stał się bardziej oczywisty, gdy okazało się, że locus 8q24 ujawniony w badaniach asocjacyjnych całego genomu wielu nowotworów, w tym raka jelita grubego, jest spowodowany ekstremalnym elementem wiążącym TCF7L2 napędzającym transkrypcję MYC^23,24. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie określeniem dalszych genów regulowanych przez ten kluczowy czynnik transkrypcyjny.

Opierając się na doświadczeniach z TCF7L2 jako przykładem metodologii, ten artykuł opisuje, jak wygenerować wysokiej jakości szablon DNA ChIP. Badanie ChIP przeprowadzono na linii komórkowej raka jelita grubego, HCT116, w celu późniejszego sekwencjonowania w celu zbudowania mapy o wysokiej rozdzielczości genów związanych przez TCF7L2²⁵ w celu uzyskania dalszych informacji na temat jego kluczowej roli w patogenezie złożonych cech.

Protokół

1. Chromatyna sieciowana

1. Hoduj komórki w szalkach do hodowli komórkowych o wymiarach 100x20mm. Ilość komórek może wynosić od 1 do 10 milionów komórek na naczynie, w zależności od typu komórki. Do jednej immunoprecypitacji wystarcza około 2 miliony komórek.
2. Usieciuj komórki w 1% formaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym kołysaniem.
3. Utwardzać sieciowanie, dodając końcowe stężenie 125 mM glicyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Umyj komórki dwukrotnie 1X solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zdekantuj PBS, a następnie dodaj 0,2 ml PBS.
5. Zbierz komórki za pomocą plastikowego skrobaka do probówki mikrowirówkowej.
6. Wirować komory z prędkością 2 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. Odessać supernatant. Ponownie zawieś komórki w buforze SDS Lysis (1% SDS, 10mM EDTA, 50mM Tris-HCl pH 8,1) dla lizatu całych komórek lub zachowaj je jako osad do ekstrakcji jądrowej.
8. Komórki można zapisać w temperaturze -80 °C lub natychmiast przystąpić do sonikacji.

2. Przygotowanie jąder (przejdź do kroku 3.5 dla lizatu całych komórek)

1. Uzupełnij bufor do lizy komórek (5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) z 1X inhibitorem proteinazy w każdym eksperymencie.
2. Ponownie zawiesić rozmrożone osady komórkowe w około 10-krotności objętości osadu za pomocą buforu do lizy komórek.
3. Odbić i homogenizować 10 razy tłuczkiem, a następnie inkubować na lodzie przez 10 minut.
4. Odwirować próbkę z prędkością 4 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i zachować pastylkę jądrową.

3. Sonikacja*

1. Rozgrzej bufor do lizy SDS i uzupełnij ilość buforu do użycia z inhibitorem proteinazy.
2. Ponownie zawiesić pastylkę jądrową w buforze do lizy SDS (około 0,5 ml buforu na 1-10 milionów komórek)
3. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
4. Dodać 0,5 ml porcji próbek do probówek do mikrowirówek.
5. Sonikuj na mokrym lodzie za pomocą sonikatora Misonix z 30 sekundami włączenia i 45 sekund wyłączenia przy ustawieniu amplitudy 2. Liczbę cykli dla idealnej wielkości fragmentu można określić, wypróbowując najpierw różne numery cykli (np. 2, 4, 8, 12, 16 i 20 lub więcej cykli). Można użyć innego marki sonikatora, jednak warunki będą się różnić. Należy przeprowadzić eksperymenty z liczbą cykli i ilością czasu włączania i wyłączania, aby określić idealne warunki.
6. Zebrać 20 μl każdej próbki w celu sprawdzenia wyników sonikacji i przeprowadzenia oceny ilościowej. Pozostała część próbki może być przechowywana w temperaturze -80 °C.
7. Rozcieńczyć 20 μl próbki, dodając 30 μl 0,1X buforu TE.
8. Badać próbkę 1 μl RNazy A w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, następnie dodać 1 μl proteinazy K i inkubować w temperaturze 62 °C przez 2 godziny.
9. Umieścić 20 μl próbki na 2% żelu agarozowym.
10. Oczyść pozostałą ilość próbki za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR, a następnie określ ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoDrop.

*Dla natywnego ChIP, trawienie nukleazy mikrokokowej może być stosowane alternatywnie do ścinania DNA.

4. Blok Koralików Agarozowych*

1. Jeśli koraliki są już zablokowane, przejdź do kroku 5.1.
2. Użyj białka A lub białka G agarozy. Dla 5 immunoprecypitacji (IP) użyj 600 μl 50% zawiesiny perełkowej (300 μl granulki kulek)
3. Aby umyć kulki, odwiruj je z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i wyrzuć supernatant. Dodaj nieco ponad 2 ml buforu rozcieńczającego ChIP (0,01% SDS, 1,2 mM EDTA, 167 mM NaCl, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,1) i wymieszaj, powoli odwracając probówkę 10X. Odwirować ponownie z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz pranie jeszcze 2 razy.
4. Blokować kulki, obracając je w temperaturze 4 °C przez noc w roztworze blokującym. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z recepturą roztworu blokującego.

5. Chromatyna wstępnie oczyszczona

1. Rozmrozić sonikowaną chromatynę na lodzie.
2. Wirować z prędkością 12 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie od razu położyć na lodzie, aby usunąć SDS (biały granulek).
3. Zebrać supernatant, wyrzucić osad i w razie potrzeby połączyć próbki.
4. Wyjmij ilości potrzebne do eksperymentu na podstawie obliczeń (1-10 ug chromatyny na IP).
5. Rozcieńczyć chromatynę 10X w buforze rozcieńczającym ChIP uzupełnionym inhibitorem proteinazy.
6. Dodaj 100 μl zablokowanych kulek na IP.
7. Obracać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.

6. Immunoprecypitacja

1. Odwirowywać próbki z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę i przenieść supernatant do świeżej probówki.
2. Odwiruj supernatant z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę i przenieś do innej czystej probówki.
3. Zachować 20 μl supernatantu, który służy jako kontrola wejściowa, w temperaturze -20 °C.
4. Podwielokrotnić chromatynę do liczby IP, które mają być wykonane w eksperymencie.
5. Dodać 2 g przeciwciała na 1-10 ug chromatyny do każdej próbki.
6. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją.
7. Dodać 100 μl zablokowanych kulek do każdej próbki IP.
8. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z rotacją.
9. Granuluj kulki, obracając je z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę i wyrzuć jak najwięcej supernatantu.
10. Umyj koraliki raz za pomocą buforu myjącego Low Salt Immune Complex. Dodać 1 ml buforu do każdej probówki; obracać w temperaturze pokojowej przez 5-8 minut; Wirować z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę, a następnie wyrzucić supernatant. Powtórzyć mycie raz z buforem do płukania High Salt Immune Complex i buforem do płukania LiCl Immune Complex oraz dwa razy z buforem TE, co daje w sumie 5 płukań (Tabela 2).

7. Elucja

1. Rozmrozić próbki wejściowe z poprzedniego dnia, które mają być przetworzone z eluantami.
2. Sprawić, by bufor elucyjny był świeży (Tabela 3).
3. Przygotuj główną mieszankę wystarczającej ilości buforu elucyjnego potrzebnego dla IP i wejściowych próbek kontrolnych oraz 1-2 dodatkowych próbek.
4. Dodać 100 μl buforu elucyjnego do każdej próbki IP i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją.
5. Wirować z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę i dodać supernatant do świeżej probówki.
6. Dodać kolejne 100 μl buforu elucyjnego do każdej probówki kulek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją.
7. Wirować przez 15 sekund po inkubacji; wirować z prędkością 5 000 obr./min przez 1 minutę, a następnie połączyć supernatant z supernatantem z pierwszej elucji. (Upewnij się, że w supernatantach nie pozostały żadne kulki. Jeśli nie masz pewności, ponownie odkręć supernatant z prędkością 5,000 obr./min przez 1 minutę i zbierz supernatant do nowej probówki.
8. Dodać 180 μl buforu elucyjnego do 20 μl wejściowych próbek kontrolnych.

8. Odwrotne usieciowanie krzyżowe

1. Do 200 μl eluantów i kontrolnych danych wejściowych dodać 8 μl 5 M NaCl.
2. Uszczelnić probówki parafilmem i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 65 °C przez noc.

9. Oczyszczanie DNA

1. Każdą próbkę należy traktować 1 μl RNazy A przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
2. Dodać 4 μl 0,5 M EDTA, 8 μl 1M Tris-HCl, wymieszać, a następnie dodać 1 μl proteinazy K do każdej próbki i inkubować w temperaturze 45 °C przez 2 godziny.
3. Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR. Próbki można zapisać w temperaturze -20 °C, a kontrolę PCR można przeprowadzić w późniejszym terminie.

*Alternatywnie, zamiast agarozy można użyć kulek magnetycznych klasy ChIP do części immunoprecypitacyjnej.

10. Kontrola PCR

1. Do kontroli PCR użyj starterów dla regionów, o których wiadomo, że są związane przez białko będące przedmiotem zainteresowania. Należy również stosować startery dla regionów niewiążących jako kontrole ujemne.
2. Wymieszać odczynniki do reakcji. Rozcieńczyć próbkę wejściową w stosunku 1:100 (Tabela 3).
3. Uruchom reakcję. Program PCR:

Krok 1: 94 °C 3 min

Krok 2: 94 °C 20 sek
59 °C 30 sek
72 °C 30 sek
(Powtórz krok 2 przez co najmniej 30 cykli)

Krok 3: 72 °C 2 min

4. Uruchom próbki na 1% żelu agarozowym.
5. Wzbogacenie można również określić ilościowo za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.

Wyniki

Po sonikacji chromatyny i potraktowaniu jej RNazą oraz proteinazą, próbki poddane elektroforezie na 2% żelu agarozowym powinny wykazać rozmazanie z większością DNA w pożądanym zakresie wielkości. W przypadku przetestowania kilku różnych cykli, wraz ze wzrostem ich liczby powinno być widoczne stopniowe zmniejszenie wielkości fragmentów (Rysunek 2).

Po zakończeniu części protokołu dotyczącej immunoprecypitacji, wzbogacenie można sprawdzić za pomocą PCR lub PCR w czasie rzeczywis...

Dyskusja

Obecnie możliwe jest przeprowadzenie całego genomu profilu asocjacji interakcji białko-DNA przy użyciu ChIP-seq, jak to niedawno wykazano w przypadku innych czynników transkrypcyjnych^2,3. Kluczem do pomyślnego wyniku sekwencjonowania jest wygenerowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny.

Po wygenerowaniu matrycy DNA i upewnieniu się, że jest ona odpowiednio wzbogacona, można ją następnie wykorzystać w bibliotece do późniejszego sekwencjonowania. Na przykła...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28104
Zestaw EZ-ChIP	Millipore	17-371
GoTaq Gorący start Polimeraza	Promega	M5001
Misonix Sonicator	Qsonica	XL-2000
NanoDrop 1000 Spektrofotometr	Thermo-Scientific
Sekwencje starterów kontroli pozytywnej (TCF7L2-1) Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' Sekwencje starterów kontroli ujemnej (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTCTCTGATGGGAAC-3' Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'