Artykuł metodologiczny

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

24K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50295

⸱

25 marca 2013

 ,  , 
1Research Department of Cell and Developmental Biology, University College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Streszczenie

Kultury Slice mogą ułatwiać manipulowanie rozwojem zarodka, zarówno farmakologicznie, jak i poprzez manipulacje genami. W tym zredukowanym systemie można przezwyciężyć potencjalne śmiertelne skutki uboczne spowodowane ogólnoustrojowym stosowaniem leków. Jednak warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój przebiega w ograniczonym środowisku wycinka. Skupiliśmy się na rozwoju rdzenia kręgowego, a w szczególności neuronów ruchowych rdzenia. Systematycznie zmienialiśmy warunki hodowli wycinków zarodków kurzych od momentu, w którym urodziła się większość rdzeniowych neuronów ruchowych. Oznaczyliśmy liczbę i typ neuronów ruchowych, które przetrwały w okresie hodowli oraz położenie tych neuronów ruchowych w porównaniu z in vivo. Odkryliśmy, że typ surowicy i czynniki neurotroficzne były wymagane w okresie hodowli i były w stanie utrzymać neurony ruchowe przy życiu przez co najmniej 24 godziny i umożliwić tym neuronom ruchowym migrację do odpowiednich pozycji w rdzeniu kręgowym. Przedstawiono te warunki hodowli oraz metodykę przygotowania kultur zarodków w plastrach z wykorzystaniem wypatroszonych zarodków kurzych zatopionych w agarozie i pokrojonych za pomocą wibratomu.

Wprowadzenie

Podczas normalnego rozwoju zarodka powstaje wiele różnych typów komórek, które muszą migrować z miejsca pochodzenia do miejsca, w którym ostatecznie będą funkcjonować w dojrzałym organizmie. W rozwijającym się rdzeniu kręgowym komórki progenitorowe znajdują się w strefie komorowej w linii środkowej i generują wiele podtypów neuronów postmitotycznych i komórek glejowych, które muszą migrować, aby zintegrować się z funkcjonalnymi obwodami neuronalnymi wymaganymi do przetwarzania sensorycznego i wyjść motorycznych1. Rdzeniowe neurony ruchowe, które kontrolują skurcze mięśni kończyn, zostały szeroko przebadane i wiele wiadomo o cząsteczkach i mechanizmach, które napędzają powstawanie ich różnych podklas. Jednak znacznie mniej wiadomo o mechanizmach, za pomocą których neurony ruchowe migrują, segregują się i odbierają sygnały synaptyczne.

Tożsamość podtypu neuronu ruchowego jest nabywana podczas rozwoju w sposób hierarchiczny. Podtypy neuronów ruchowych można ogólnie podzielić na odrębne kolumny, podziały i pule, które są definiowane przez ich projekcje aksonów. Kolumny motoryczne wystają aksony na mięśnie osiowe, trzewne lub kończyn. Podziały motoryczne dzielą neurony ruchowe wystające kończynami bocznej kolumny ruchowej (LMC) na te wystające do mięśni brzusznych lub grzbietowych2. W obrębie podziałów skupiska neuronów ruchowych zwane pulami motorycznymi rzutują na poszczególne mięśnie kończyny2, 3. Neurony ruchowe wystające kończynami są definiowane przez ich ekspresję czynnika transkrypcyjnego Foxp14, 5, podczas gdy tożsamość dywizyjna charakteryzuje się ekspresją homeodomenowych czynników transkrypcyjnych Islet-1 (wystający brzusznie) lub Lhx-1 (wystający grzbietowo)6. Rzeczywiście, ekspresja Lhx-1 jest wymagana do odpowiednich projekcji grzbietowych neuronów ruchowych7. Każdy z tych podtypów zajmuje odrębne pozycje w rdzeniu kręgowym; Neurony ruchowe wystające brzusznie znajdują się w neuronach ruchowych wystających przyśrodkowo do grzbietowo. Powoduje to, że LMC jest podzielony na tzw. LMCmedial (LMCm) i LMClateral (LMCl). Organizacja dywizji i puli motorowej jest nabywana w dwóch fazach8. W pierwszej fazie segregacja dywizyjna odbywa się poprzez migrację neuronów ruchowych w charakterystyczny sposób przyśrodkowy do bocznego. Komórki LMCl są generowane po komórkach LMCm, a więc LMCl migruje przez LMCm, aby osiągnąć ostateczną pozycję osiadania. Druga faza obejmuje neurony ruchowe w obrębie podziału i grupuje je w pule neuronów ruchowych, prawdopodobnie poprzez grzbietowo-brzuszne sortowanie neuronów ruchowych. Wykazano, że członkowie klasycznej rodziny kadheryny zależnej od kateniny mają kluczowe znaczenie dla obu faz organizacji neuronów ruchowych8-10. Jednak sposób, w jaki funkcja kadheryny kontroluje ruch komórek, jest słabo poznany.

Nabywanie tożsamości kolumnowych, działowych i pulowych wymaga zewnętrznych sygnałów, które wzorcują wewnętrzną ekspresję czynników transkrypcyjnych11. Ponadto około 50% wszystkich neuronów ruchowych umiera w wyniku apoptozy podczas normalnego rozwoju w procesie, który wymaga zewnętrznych sygnałów z kończyny, głównie poprzez neurotroficzne wsparcie przeżycia neuronów ruchowych. W związku z tym rozwój neuronów ruchowych wymaga utrzymania odpowiedniego środowiska przez stosunkowo długi okres czasu. Z tego powodu praktyczne aspekty generowania kultur warstwowych rdzenia kręgowego w celu utrzymania przeżycia neuronów ruchowych wymagają wyjaśnienia odpowiednich warunków hodowli. Poprzednie kultury wycinkowe zarodków zostały wykorzystane do śledzenia zachowania dodanych zewnętrznie oczyszczonych populacji neuronów12-14. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, warunki kulturowe, które ułatwiają przetrwanie i migrację neuronów ruchowych in situ w obrębie samego wycinka, nie zostały opublikowane. Zmodyfikowaliśmy standardowe warunki hodowli, które ułatwiają przetrwanie oczyszczonych, zdysocjowanych neuronów ruchowych czaszki, aby ułatwić rozwój neuronów ruchowych w systemie hodowli plastrów zarodka. Monitorowaliśmy również położenie ocalałych neuronów ruchowych i wykazaliśmy, że w okresie hodowli uzyskuje się w dużej mierze normalne pozycje podziałów neuronów ruchowych.

Protokół

1. Wprowadź wymagane rozwiązania

  1. 1 M bufor fosforanowy: Odważyć 109,4 g Na2HPO4 i 32 g NaH2PO4. H20, wymieszać i rozpuścić w wodzie do całkowitej objętości 1 litra.
  2. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): Przygotować 0,1 M bufor fosforanowy, 0,15 M NaCl. 100 ml PBS powinno wystarczyć do przetworzenia plastrów z 10 zarodków.
  3. Agaroza: Podgrzej roztwór PBS do około 70 °C i powoli dodawaj stałą agarozę o niskiej temperaturze topnienia, ciągle mieszając. Przygotować roztwór do końcowego stężenia 4% (w/v) agarozy. Zrób zapas 50 ml tego roztworu. Pozostawić ten roztwór w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 48 °C do czasu, gdy będzie on potrzebny. Każdy roztwór agarozy niewykorzystany po doświadczeniu może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
  4. Roztwór bloku przeciwciał: Dodać płodową surowicę cielęcą i tryton X-100 do końcowego stężenia 1% (v/v) płodowej surowicy cielęcej, 0,1% (v/v) Triton X-100 w PBS. 10 ml roztworu blokowego wystarczy do barwienia immunologicznego 5 szkiełek skrawków kriostatu.
  5. Utrwalacz: Przygotować 0,75 mm NaOH, 4% (w/v) paraformaldehydu (UWAGA). Aby przygotować niezbędne ciepło utrwalające ilość wody do 70 °C, dodać skoncentrowany NaOH do wymaganego stężenia końcowego, dodać stały paraformaldehyd i mieszać aż do rozpuszczenia. Schłodzić na lodzie do temperatury 4 °C. 10 ml tego roztworu wystarczy na 20 dołków z plastrami zarodków.
  6. Roztwór sacharozy: Przygotować 10 ml 30% (w/v) roztworu sacharozy zawierającego 0,1 M buforu fosforanowego. 10 ml tego roztworu wystarczy na 10 dołków plastrów zarodka.
  7. 70% (v/v) etanolu. Rozcieńczyć 70 ml bezwzględnego etanolu w 30 ml wody.
  8. Pożywka hodowlana: Przygotować roztwór składający się z 1% ekstraktu z zarodków kurczaka, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,35% L-glutaminy, 0,1% 2-merkaptoetanolu, 4% surowicy kurczaka, 2% suplementu witaminy B27 i 100 ng/ml rzęskowego neurotroficznego czynnika wzrostu (CNTF) rozcieńczonego w pożywce neuropodstawnej; przygotowanej na lodzie i użytej tego samego dnia. Na 20 dołków plastrów zarodków potrzeba 10 ml pożywki hodowlanej.

2. Przygotowanie zarodków piskląt

  1. Zapłodnione jaja kurze należy umieścić najdłuższym bokiem poziomo w inkubatorze z wymuszonym ciągiem w temperaturze 38 °C, aż osiągną stadium15 24. Zwykle wymaga to około 4 dni inkubacji.
  2. W drugim dniu inkubacji wysterylizuj skorupkę jaja, przecierając ją bibułą nasączoną 70% etanolem. Ostrożnie przekłuć płaski koniec skorupki jaja za pomocą igły o rozmiarze 21 dołączonej do strzykawki o pojemności 5 ml i usunąć 5 ml albuminy. Powoduje to obniżenie zarodka z dala od skorupy, dzięki czemu zarodek nie ulega uszkodzeniu po otwarciu skorupy. Umieść jaja z powrotem w inkubatorze i wysiaduj je przez kolejne 2 dni.
  3. Za pomocą stępionych kleszczy dumont #5 ostrożnie przebij górną środkową część skorupy i usuń około 9cm2 skorupy. Przeciąć wokół zarodka i ostrożnie wyjąć zarodek i umieścić w HBSS podczas sekcji. Zarodki powinny być klasyfikowane według Hamburgera i Hamiltona (1992)15. Wszystkie wykorzystane zarodki powinny być w stadium zbliżonym do 24. Wszelkie zarodki, które wykazują jakiekolwiek oznaki nieprawidłowości, należy wyrzucić.
  4. Usuń błonę owodniową, błonę kosmówkowo-omocznikową, głowę i okrzewek za pomocą dwóch kleszczy Dumont #5. Wypatroszyć zarodek, aby usunąć wszystkie narządy wewnętrzne. Aby to zrobić, rozetnij brzuszną linię środkową zarodka za pomocą mikronożyczek preparujących, przytrzymaj zarodek wokół okolicy pnia rostralnego jedną parą kleszczy, chwyć rostralną część jelita i serca i pociągnij doogonowo. Ważne jest, aby odbywało się to czysto. Powinieneś być w stanie wyraźnie zobaczyć zarodki somitów. Przeciąć zarodek na pół, poprzecznie między zawiązkami kończyn górnych i dolnych. Teraz przytnij ścianę klatki piersiowej za pomocą nożyczek do mikrodysekcji.

3. Przygotowanie plastra zarodka

  1. Usunąć roztwór agarozy z łaźni wodnej. Odetnij 5 cm od dna jednorazowej plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml.
  2. Delikatnie usuń lędźwiową połowę wypreparowanego zarodka za pomocą dwóch kleszczy, aby wyciągnąć zarodek z roztworu preparacyjnego i umieścić na suchej szalce Petriego. Za pomocą pipety Pasteura usuń około 2 ml agarozy, odpipetuj około 0,5 ml na wierzch zarodka, a następnie zassaj plasterek zarodka do pipety. Przenieś zarodek i agarozę do plastikowej formy do odklejania, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków do agarozy. Delikatnie opuść zarodek na dno agarozy w plastikowej formie, z częścią piersiową skierowaną w dół. Zarodek należy ustawić tak, aby był prosty za pomocą igły o rozmiarze 21. Plastry będą również zawierały część rozwijającej się kończyny i ważne jest, aby orientacja zarodka w agarozie na to pozwoliła. Umieść łódź na lodzie, aby ustawić agarozę. Należy uważać, aby w tym okresie (około 2 min) zarodek nie zmienił orientacji.
  3. Wibratom Leica VT1000S (prędkość 3, częstotliwość 4, plastry o grubości 400 μm) powinien być ustawiony z komorą krojenia wypełnioną HBSS i otoczony lodowatą wodą. Blok agarozy jest następnie przyklejany do platformy wibratomu za pomocą super kleju. Blok agarozy przycina się żyletką, aby pozostawić kawałek zarodka z otaczającym go 1-3 mm agarozy. Wybiera się plastry, które zawierają sekcje pąków kończyn z wyraźnym wierzchołkowym rygorem ektodermalnym, a następnie umieszcza się je w HBSS. Ogólnie rzecz biorąc, na zarodek przypada tylko jeden do dwóch odpowiednich plasterków. Delikatnie usuń agarozę wokół plasterków tkanki za pomocą dwóch igieł. Ważne jest, aby zrobić to dokładnie i ostrożnie.

4. Hodowla plastrów zarodków

  1. Dodać 500 ml roztworu hodowlanego (opisanego powyżej) do wymaganej liczby dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej poddanej działaniu ultra niskiego przyłączenia. Ostrożnie przenieś plastry z roztworu HBSS do studzienki. Ogólnie rzecz biorąc, staramy się, aby w każdym dołku znajdowały się od dwóch do trzech plasterków. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 24 godziny.

5. Dzielenie plastrów na sekcje do barwienia immunologicznego

  1. Po okresie hodowli dodać 500 μl niebuforowanego roztworu do każdego dołka z plastrów zarodków i pozostawić na lodzie na 20 minut. Cały roztwór jest następnie ostrożnie usuwany i przeprowadzane są trzy płukania PBS w odstępach 5-minutowych. Plastry pozostawia się następnie w roztworze sacharozy w temperaturze 4 °C, aż opadną, około 6 godzin, ale można je pozostawić na dłużej (np. na noc).
  2. Usuń plastry i zetrzyj nadmiar roztworu sacharozy i zrównoważ w około 1 ml OCT przez około 5 minut w temperaturze 20 °C. Zamontuj każdy plasterek płasko w plastikowej foremce wypełnionej O.C.T. Po zamontowaniu umieść foremki pionowo na suchym lodzie do zastygnięcia.
  3. Zamontuj bloki O.C.T. w kriostacie i równowaga w temperaturze -24 °C przez około 20 minut. Pokrój każdy plasterek za pomocą 15-milimetrowych odcinków zamontowanych na szkiełkach Superfrost-Plus. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

6. Immunofluorescencja

  1. Pipetować 1-2 ml PBS na szkiełkach poziomych trzymanych w wilgotnej komorze z szkiełkami podniesionymi od spodu komory (używamy pipet plastikowych o pojemności 1 lub 2 ml przymocowanych taśmą autoklawową). Inkubować skrawki w PBS przez 5 minut w temperaturze 20 °C w celu usunięcia nadmiaru O.C.T. Usunąć roztwór PBS ze szkiełka i dodać 500 ml roztworu blokowego na skrawki, inkubować przez 30 minut w temperaturze 20 °C. Usunąć roztwór blokowy i natychmiast dodać 500 ml rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego dodanego do szkiełek, inkubować w temperaturze 4 °C przez 18-22 godzin.
  2. Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i natychmiast przemyć szkiełka 1 ml PBS przez 5 minut, trzykrotnie w temperaturze 20 °C w celu usunięcia nadmiaru roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. Dodać 500 ml rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego na sekcje. Szkiełka pozostawia się w temperaturze 20 °C na 30 minut. Następnie usuwa się roztwór przeciwciała wtórnego i przemywa szkiełko 3 razy po 5 minut w PBS w temperaturze 20 °C.
  3. Po tych praniach usuń końcowe płukanie PBS, przetrzyj krawędź szkiełka, aby usunąć nadmiar PBS, dodaj dwie krople vectashield na szkiełka i delikatnie połóż szklane szkiełko nakrywkowe na sekcjach, unikając tworzenia się pęcherzyków. Nadmiar preparatu Vectashield należy usunąć z krawędzi szkiełek przed obrazowaniem.

7. Obrazowanie

  1. Wyobraź sobie skrawki wybarwione immunologicznie. Używamy mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse E80i wyposażonego w aparat cyfrowy Hamammatsu ORCA ER oraz soczewki obiektywowe 10 X, 20X i 40X.

Wyniki

Wykorzystanie hodowli skrawków do śledzenia rozwoju interneuronów i neuronów projekcyjnych miało istotny wpływ na postęp w rozumieniu generowania organizacji w obrębie kory mózgowej16. W rdzeniu kręgowym rozwój neuronów ruchowych śledzono, wykorzystując hodowle całych embrionów danio pręgowanego17. Jednakże organizacja neuronów ruchowych rdzenia u danio pręgowanego jest stosunkowo prosta (ze względu na brak dużych mięśni kończyn u ryb). Mechanizmy molekularne sterujące hierarchią organizacji neuronów ruchowych rdzenia podczas rozwoju wyższych kręgowców są obecnie słabo poznane. W związku z tym niezbędne są warunki hodowli ułatwiające przeżycie neuronów i migrację ciał komórkowych w hodowlach skrawków embrionów wyższych kręgowców. Obecnie hodowle skrawków rdzenia kręgowego wyższych kręgowców były wykorzystywane do wysiewania dysocjowanych neuronów na powierzchni skrawków12-14, badania fluorescencyjnie znakowanych aksonów na obrzeżach skrawka18 lub zachowania komórek progenitorowych we wczesnym rozwoju rdzenia kręgowego19. Obecnie brakuje warunków hodowli skrawków dla późniejszych etapów rozwoju rdzenia kręgowego, w szczególności takich, które utrzymują rozwój neuronów ruchowych.

Aby podjąć próbę śledzenia rozwoju neuronów rdzeniowych, w szczególności motoneuronów rdzeniowych, zbadaliśmy różne warunki hodowli, które mogłyby promować przeżywalność motoneuronów oraz nabycie początkowej organizacji motorycznej poprzez migrację boczna neuronów. Wstępne próby z wykorzystaniem skrawków rdzenia kręgowego embrionów kurczęt w stadiach od 18 do 20 okazały się bezowocne; nie udało nam się utrzymać motoneuronów przy życiu dłużej niż przez kilka godzin i nie byliśmy w stanie wykazać generowania znaczącej liczby komórek LMCl w okresie hodowli (dane nie przedstawiono). Zbadaliśmy zatem hodowle skrawków embrionów w stadium 24, czyli w punkcie czasowym, w którym większość neuronów LMCl i LMCm została już wygenerowana, ale migracja neuronów LMCl jest wciąż w początkowej fazie (Rycina 1a-c). Ta migracja boczna neuronów LMCl jest w dużej mierze zakończona do stadium 27, około 24 do 36 h później (Rycina 1 d-f). Nasz test mógł zatem zostać uproszczony do zapewnienia przeżywalności neuronów i ułatwienia ich migracji bocznej do rogu przedniego. Eksperymenty rozpoczęliśmy od stosunkowo prostych warunków hodowli, zawierających jedynie zrównoważony roztwór soli Hanksa z dodatkiem lub bez dodatku surowicy kurzej lub ekstraktu z embrionu kurczęt. W każdym przypadku, mimo że udało nam się utrzymać neurony LMC w skrawku, stwierdzono niewielkie dowody na utrzymanie neuronów LMCl (przynajmniej w oparciu o ekspresję Lhx-1). Ponadto zaobserwowaliśmy nieprawidłową ekspresję genów takich jak HB9 w grzbietowej części rdzenia kręgowego, co jest sytuacją, która nigdy nie występuje in vivo (dane nie przedstawiono). Zatem te proste warunki hodowli nie są odpowiednie do badania procesu nabywania organizacji motoneuronów.

Poszukiwaliśmy zatem bardziej złożonych warunków i jako bazę wykorzystaliśmy sformułowaną w publikacjach mieszankę, która ma ułatwiać przeżycie dysocjowanych embrionalnych neuronów ruchowych czaszki kurczaka. Warunki te20 (1% ekstraktu z zarodka kurczaka, 1% Pen Strep, 0,35% L-glutaminy, 0,1% 2-merkaptoetanolu, 2% surowicy konia, 2% suplementu B27 oraz 50 ng/ml czynnika wzrostu neurotroficznego rzęskowego (CNTF) w podłożu neurobasalnym (zwanym tutaj podłożem Guthrie)) pozwoliły na przeżycie większej liczby neuronów ruchowych niż prostsze pożywki. Dodatkowo nie doprowadziło to do błędnej ekspresji czynników transkrypcyjnych w grzbietowej części rdzenia kręgowego. Jednak przeżywalność neuronów LMCl była słaba (Rysunek 1 g-i, p). Zmienialiśmy zatem czynniki, które uznaliśmy za kluczowe w podłożu Guthrie, a mianowicie gatunek zwierzęcia, z którego pochodziła surowica, stężenie surowicy oraz stężenie CNTF w podłożu. Stwierdziliśmy, że zmiana surowicy konia na surowicę kurczaka oraz zwiększenie stężenia CNTF z 50 ng/ml do 100 ng/ml znacząco zwiększyło przeżywalność komórek LMCl i LMCm, a także umożliwiło ich migrację do rogu przedniego w ciągu 24 h hodowli (Rysunek 1 j-l, p). Całkowita liczba neuronów ruchowych, stosunek LMCm do LMCl, a także migracja komórek LMCl do rogu przedniego wydawały się bardzo podobne do przekrojów embrionów, których pozwolono rozwijać się in ovo, a nie w hodowli plastrów (Rysunek 1 k-o, p). Uważamy zatem, że opierając się na ekspresji czynników transkrypcyjnych, liczbie komórek i pozycji neuronów ruchowych, nasze warunki hodowli plastrów odwzorowują prawidłowy rozwój neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, przynajmniej w okresie 24 h.

Białka Lhx-1 i FoxP1 w embrionie kurczaka; immunohistochemia, hodowla plastrów, analiza ekspresji.
Rysunek 1. a-c. Status generowania LMC (barwienie Foxp1 w b) i LMCl (barwienie Lhx-1 w a) w stadium 24. Panel c przedstawia nałożenie obu kanałów. Linia środkowa jest zaznaczona linią przerywaną w a i D, V wskazuje orientację osi grzbietowo-brzusznej (D, V) rdzenia kręgowego. d-f. Status organizacji LMC (barwienie Foxp1 w d) i LMCl (barwienie Lhx-1 w e) w stadium 27. Panel f przedstawia nałożenie obu kanałów. g-i. Ekspresja Lhx-1 (g) i Foxp1 (h) w przekrojach plastra hodowanego w medium wspierającym przeżycie komórek czuciowych neuronów ruchowych czaszkowych (medium Guthrie, nasze „medium początkowe”, patrz odniesienie 20). Lhx-1 nie jest już eksprimowany w neuronach ruchowych, choć obserwuje się przeżycie niektórych komórek LMC, co potwierdza ekspresja Foxp1. D, V w (g) wskazuje orientację osi grzbietowo-brzusznej (D, V) rdzenia kręgowego. M-L wskazuje orientację osi przyśrodkowo-bocznej (M, L) rdzenia kręgowego. j-l. Komórki LMCl (Lhx-1 w rogu przednim w j) oraz LMC ogólnie (Foxp1 w k) można zaobserwować w plastrach hodowanych w medium zawierającym 4% surowicy kurzej i 100 ng/ml CNTF. Należy zauważyć, że niektóre komórki LMCl znajdują się w pozycji bocznej w rogu przednim. Strzałka w (j) wskazuje boczną pozycję niektórych komórek LMCl. Panel (l) przedstawia nałożenie obu kanałów. m-o. Status ekspresji Lhx-1 (m) i Foxp1 (n) w przekrojach embrionu utrzymywanego in ovo podczas hodowli plastrów embrionu pokazanego w j-l. Panel (o) przedstawia nałożenie obu kanałów. p. Ilościowe oznaczenie procentowego udziału komórek LMCl (Foxp1+ve/ Lhx1+ve) w stosunku do komórek LMC (Foxp1+ve/Lhx1-ve) znalezionych w hodowlach plastrów w różnych warunkach w porównaniu do embrionów kontrolnych utrzymywanych in ovo (które reprezentują 100%). Test t Studenta *** oznacza p<0.01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół pozwala na inkubację wycinka zarodka kurczaka przez więcej niż jeden dzień, przy jednoczesnym utrzymaniu przy życiu neuronów ruchowych i kontynuowaniu migracji w okresie hodowli. Wyjaśniając warunki utrzymania neuronów ruchowych przy życiu, zidentyfikowaliśmy kilka kluczowych wymaganych funkcji. Wydaje się, że do 4% surowicy piskląt ma kluczowe znaczenie dla przetrwania neuronów ruchowych, a jej zastąpienie surowicą innego gatunku nie jest tolerowane. Co ciekawe, odkryliśmy, że obecność wyższych stężeń surowicy była szkodliwa dla plastrów, ponieważ sprzyjała przerostowi tkanki, prowadząc do poważnych zniekształceń w kształcie plasterka. Co ważniejsze, kluczowa okazała się również obecność biodrowego czynnika neurotroficznego. Pozostaje wyraźna możliwość, że plastry mogą być hodowane przez znacznie dłuższe okresy niż tylko 24 godziny, być może nawet umożliwiając wizualizację sensorycznych danych doprowadzających do rdzenia kręgowego. Dodatkowo, tutejsze warunki hodowli mogą również okazać się przydatne do krojenia kultur rozwijającego się pnia mózgu i śródmózgowia/móżdżku.

Być może największą potencjalną korzyścią płynącą ze stosowania tych warunków hodowli plastrów jest to, że ułatwiają one możliwość farmakologicznej manipulacji funkcją białka, jednocześnie minimalizując potencjalny niekorzystny wpływ na resztę zarodka, taką jak serce. Duża liczba inhibitorów i agonistów różnych szlaków sygnałowych może być wykorzystana do oceny migracji różnych podtypów neuronów rdzeniowych i, potencjalnie, ich wpływu na tworzenie się lokalnych obwodów rdzeniowych podczas rozwoju. Ponadto niektóre genetyczne zaburzenia ekspresji białek, takie jak te, które wykorzystują siRNA i oligonukleotydy morfolinooligonukleotydów, cierpią z powodu faktu, że mogą być wprowadzone tylko na wczesnym etapie rozwoju (ze względu na ograniczenia w procedurach elektroporacji in ovo ), a efekty utrzymują się tylko przez krótki czas (zwykle jeden dzień). Nasza hodowla plastrów rozpoczyna się na późniejszych etapach i daje możliwość wykorzystania tej technologii na późniejszym etapie rozwoju na etapie krojenia, aby zobaczyć ich efekty w okresie hodowli plastrów.

Protokół hodowli warstwowej może również umożliwić wizualizację zarówno neuronu ruchowego rdzenia, jak i migracji międzyneuronów grzbietowych w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii filmów poklatkowych. Można to osiągnąć za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w świetle białym lub za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Jeśli ta druga technika miałaby być zastosowana, konieczne jest wprowadzenie etykiet fluorescencyjnych. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI lub DiO, poprzez znakowanie wsteczne z kończyny lub znakowanie następcze z komory, lub elektroporację in ovo konstruktów w celu napędzania białek fluorescencyjnych w podzbiorze neuronów.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Sharon Boast za wiele wnikliwych dyskusji oraz B. Novitch za uprzejmy dar przeciwciał dla Foxp1. Praca ta została sfinansowana ze stypendium Wellcome Trust dla KCT oraz grantu projektowego z Wellcome Trust dla SRP (numer referencyjny grantu 094399/B/10/Z).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
JajaHenry Stewart Farms, Wielka BrytaniaZapłodnione brązowe jaja kurze Bovan Gold (Henry Stewart Farms, Wielka Brytania), przechowywane w temperaturze 14 & deg; C do inkubacji
21 Igła doBD-Microlance-3304432
strzykawka 5 mlBD Plastipak302187
#5 Kleszcze DumontRobozRS 5045
Nożyczki do mikro preparacjiRobozRS 5910SC(3,5 cala prostego)
Formy do osadzania zarodków: Odklejane formyAgar ScientificG3764W kształcie piramidy 22 mm do 12 mm
Super klejPower Flex, Loctite
EtanolSIGMA32221
Diwodorofosforan sodu, monohydratBDH102454R
Di Monowodorofosforan soduVWR/ BDH102494C
Chlorek soduVWR/BDH27810.295
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen16520
Surowica bydlęcaGibco10500-064
Triton X-100SIGMAT8787
Wodorotlenek soduFLUKA71689
ParaformaldehydVWR/BDH28794.295
Plastikowe jednorazowe pipety pasteuraElKay Precyzyjne materiały laboratoryjne127-P503-000Likier o pojemności 3 ml
Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Gibco14170
SacharozaSIGMAS0389
Wodorowęglan soduSIGMAS5761
Ekstrakt z zarodków kurczakaSeralabsCE650-J
Roztwór penicyliny/streptomycynyGibco15070
Roztwór L-glutaminyGibco25030
2-mercapt– tanolGibco21985
Surowica końskaSouthern Group Labs9028B
B27 suplementInvitrogen17504-044
Podłoże neuropodstawoweGibcoCat ~ 2103
Czynnik neurotroficzny Cilliary (CNTF)Systemy R i D557-NT-010
Surowica pisklątSIGMAC5405
pierwszorzędowezakupiono w Developmental Studies Hybridoma Bank, z wyjątkiem przeciwciał anty-foxP1, które były miłym prezentem od Bennetta Novitcha z UCLA. Pierwszorzędowe rozcieńczenia przeciwciał to królik anty-FoxP1 (1/32000), mysie anty-Lhx1/2 (4F2) (1/50), świnka morska anty-FoxP1 (1/1000).
Wszystkie przeciwciała przechowywano w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
drugorzędoweOsioł anty-Świnka morska (cy3) (1:1000) zakupiony w Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Osioł anty-mysz (Alexa Fluor 488) (1:1000), osioł anty-Królik (Alexa Fluor 594) (1:1000) zakupiony od Invitrogen
Wszystkie przeciwciała przechowywano w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Płytka 24-dołkowaCorning COSTAR3473ultraniska płytka 24-dołkowa
O.C.T.Tissue Tek, Sakura4583Optymalna temperatura cięcia
VectashieldVector LabsH1000Vectashield fluorescencyjne medium montażowe
ProwadniceThermo ScientificSuperfrost-Plus z dodatnim ładunkiem, 25 x 75 x 1,0 mm
Szkło osłonoweVWR International631-016725x60 mm
Inkubator z wymuszonym ciągiem: Lyon Electric Companyutrzymywane w stanie wilgotnym poprzez zapewnienie zawsze wystarczającego poziomu wody, utrzymywanego na poziomie 38 stopni; C
CryostatBrite, Huntingdon, Wielka Brytania-36& C
Inkubator do hodowli tkankowychDH AutoflowNuaire 38 ° C, 5% CO2
VibratomeLeicaLeica VT1000-S
MikroskopNikonNikon Eclipse E80i
Aparat cyfrowyNikonNikon DS5M i Hamammatsu ORCA ER
pomiaru płodu Przeciwciała Przeciwciała fluorescencyjny

Bibliografia

  1. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
  2. Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
  3. Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
  4. Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
  5. Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
  6. Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
  7. Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
  8. Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
  9. Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
  10. Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
  11. Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
  12. Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
  13. Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
  14. Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  16. Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
  17. Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
  18. Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
  19. Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920(2012).
  20. Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultura plastr w zarodka kurczakaspinalne neurony ruchowekrojenie w wibrotomiemikroskopia immunofluorescencyjnasekcja zarodkazatapianie w agarozieinkubacja w medium hodowlanymp ukanie w HBSSzatapianie w OCTkrojenie w kriostacie

Powiązane artykuły