In vivo (in vivo) Obrazowanie makrofagów przy użyciu celowanego środka kontrastowego MR do podłużnej oceny septycznego zapalenia stawów

Podsumowanie

Pokazujemy, jak wykonać obrazowanie MR makrofagów za pomocą ultramałego superparamagnetycznego środka kontrastowego (USPIO) w septycznym zapaleniu stawów, umożliwiając wstępną i podłużną nieinwazyjną ocenę infiltracji makrofagów in vivo oraz ocenę skuteczności terapii.

Streszczenie

Makrofagi są kluczowymi komórkami w inicjacji, rozwoju i regulacji odpowiedzi zapalnej na infekcję bakteryjną. Makrofagi są intensywnie i coraz częściej rekrutowane w szambach od wczesnych faz infekcji, a infiltracja ma się cofnąć po uzyskaniu skutecznego usunięcia patogenów. Zdolność do identyfikacji aktywności makrofagów in vivo w zakażonym stawie może zatem zapewnić dwa główne zastosowania: wczesne wykrywanie ostrego zapalenia błony maziowej i monitorowanie terapii.

In vivo nieinwazyjne wykrywanie makrofagów można przeprowadzić za pomocą rezonansu magnetycznego przy użyciu nanocząsteczek żelaza, takich jak ultramały superparamagnetyczny tlenek żelaza (USPIO). Po podaniu donaczyniowym lub dostawowym USPIO są specyficznie fagocytowane przez aktywowane makrofagi i ze względu na swoje właściwości magnetyczne indukują zmiany sygnału w tkankach prezentujących naciek makrofagów. Ilościowa ocena nacieku jest wykonalna, ponieważ obszar z utratą sygnału (liczba ciemnych pikseli) obserwowany na obrazach MR echa gradientowego po wstrzyknięciu cząstek jest skorelowany z ilością żelaza w tkance, a zatem odzwierciedla liczbę komórek obciążonych USPIO.

Prezentujemy tutaj protokół do wykonywania obrazowania makrofagów za pomocą obrazowania MR wzmocnionego przez USPIO w zwierzęcym modelu septycznego zapalenia stawów, pozwalający na wstępną i podłużną nieinwazyjną ocenę infiltracji makrofagów in vivo i ocenę działania terapii.

Wprowadzenie

Rezonans magnetyczny (MRI) jest uważany za metodę obrazowania z wyboru do demonstracji zakaźnego zapalenia błony maziowej ze względu na jego wysoką rozdzielczość przestrzenną i kontrast tkanek miękkich. Zmiany sygnału obserwowane w MRI w zapaleniu stawów o niskim sygnale T1 i wysokim T2 odzwierciedlające zwiększoną obecność zewnątrzkomórkowej zawartości wody oraz wyraźną poprawę po podaniu środka kontrastowego na bazie gadolinu, zgodne z histologicznymi wynikami zwiększonego unaczynienia z powodu rozszerzenia naczyń krwionośnych i angiogenezy¹. Niemniej jednak MRI często nie jest w stanie wykazać ustąpienia infekcji podczas antybiotykoterapii, ponieważ można zaobserwować trwałe wzmocnienie stawów u pacjentów z klinicznie i biologicznie wyleczonym septycznym zapaleniem stawów z powodu utrzymywania się powiększonej przestrzeni zewnątrzkomórkowej (tkanka ziarninowa, blizna zwłóknieniowa)². Oprócz zmian zewnątrzkomórkowych, komórki zapalne, w tym intensywna rekrutacja makrofagów, masowo infiltrują zakażoną błonę maziową. Makrofagi odgrywają główną rolę zarówno w ostrej, jak i przewlekłej fazie infekcji bakteryjnej ³. Indukują one reakcję zapalną wymaganą do wyeliminowania mikroorganizmów chorobotwórczych i koordynują ustępowanie stanu zapalnego, ponieważ stan zapalny wywołany przez makrofagi utrzymuje się tak długo, jak długo nie zostaną usunięte martwicze tkanki, uniemożliwiając rozpoczęcie naprawy⁴. Tak więc zmniejszenie infiltracji makrofagów w zakażonej błonie maziowej po skutecznej terapii może być wiarygodnym wskaźnikiem ustąpienia infekcji. Obrazowanie komórkowe jest w stanie wykazać specyficzną infiltrację komórkową wewnątrz tkanki patologicznej. Specyficzne obrazowanie MR makrofagów przy użyciu celowanego środka kontrastowego zostało szeroko zbadane i wykazało jego zdolność do wykazywania stanu zapalnego stawów lub infekcji^5-7. Po wstrzyknięciu dożylnym takie celowane środki kontrastowe, takie jak cząsteczki USPIO (ultramałe superparamagnetyczne tlenki żelaza) są wychwytywane przez komórki fagocytarne, takie jak makrofagi, i dzięki swoim właściwościom magnetycznym indukują zmiany sygnału w tkankach wykazujących infiltrację makrofagów⁸. Podłużna obserwacja terapii zmian sygnału MR pozwala na nieinwazyjną ocenę infiltracji makrofagów in vivo, a zmniejszenie zmian sygnału związanych z makrofagami USPIO wykazałoby sukces terapii. Celem niniejszego raportu jest przedstawienie, w jaki sposób wykonywać obrazowanie MR makrofagów w celu nieinwazyjnego monitorowania septycznego zapalenia stawów poprzez wykazanie zmniejszenia nacieku makrofagów w błonie maziowej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Szpitala Uniwersyteckiego.

1. Dostawowe szczepienie bakteriami

1. Przed wstrzyknięciem należy znieczulić króliki poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (30 mg/kg masy ciała) zmieszanej z ksylazyną (4 mg/kg) w obrębie mięśnia prostownika grzbietu. Upewnij się, że zwierzęta są w pełni znieczulone, sprawdzając, czy nie reagują na szczypanie łapy. Protokół ten zapewnia wystarczające znieczulenie do dostawowego wstrzyknięcia stawu kolanowego. Umieść zwierzęta pod maską tlenową podczas znieczulenia.
2. Golenie kolan zwierząt. Przygotować kolano do aseptycznego wstrzyknięcia, używając 3 naprzemiennych chusteczek z powidonem i alkoholem, a następnie nałożyć roztwór jodu powidonu.
3. Ręcznie zidentyfikuj ścięgno rzepki jako elastyczną strukturę w przedniej części kolana za pomocą sterylnej nasadki na igłę, jak pokazano, lub sterylnej sondy.
4. Mając kontrolę wzrokową i stosując dostęp przedni, umieść igłę 25 G przezskórnie w prawym kolanie każdego z 12 królików przez ścięgno rzepki.
5. Wstrzyknąć do każdego kolana 1 ml zawiesiny bakteryjnej Staphylococcus aureus (szczep Neumann) o stężeniu^10-6 UFC/ml. Wstrzyknięcie bez oporu potwierdza śródstawowe położenie końcówki igły.
6. Po zabiegach iniekcji należy trzymać zwierzę pod źródłem konwekcyjnym, aby uniknąć utraty ciepła i monitorować częstość oddechów, obserwując ruchy klatki piersiowej. Po przebudzeniu trzymaj zwierzęta w klatkach ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.
7. Radzić sobie z bólem, podając domięśniowo wstrzyknięcie 0,1 mg/kg buprenorfiny co 8 godzin.
8. Obserwuj klinicznie króliki każdego dnia, monitorując spożywane ilości jedzenia i wody, utratę wagi, temperaturę i ogólne zachowanie.
9. Aby zobrazować ostrą fazę infekcji, należy wykonać pierwszą sesję obrazowania MR, gdy tylko zwierzę wykaże znaczną utratę masy ciała (10%); zwykle następuje to po około 2 dniach.
10. Jeśli przed badaniem MRI wymagane jest dożylne podanie leku, można zainstalować dostęp żylny uszny (por. poniżej).

2. Badanie MRI

Podczas obrazowania żywych zwierząt, staranna instalacja zwierząt jest kluczową cechą, aby zapewnić zwierzętom komfort i optymalne znieczulenie. Pozwoli to na uzyskanie najlepszych wyników obrazowania i zapewni akwizycję obrazu reprodukcyjnego do badań podłużnych. Ze względu na wielkość zwierzęcia najbardziej odpowiednie jest użycie unitu MR o rozmiarach klinicznych (1,5 T lub 3 T). Stosowana jest 8-kanałowa kliniczna cewka kolanowa, ponieważ zapewnia odpowiednią rozdzielczość i stosunek kontrastu do szumu do eksploracji kolana królika.

1. Przed zainstalowaniem w systemie obrazowania należy zainstalować obwodowy dostęp żylny przez żyłę uszną. Ten dostęp będzie służył do wstrzyknięcia środka kontrastowego.
   1. Ogol i zdezynfekuj ucho.
   2. Wykonaj znieczulenie miejscowe przez podskórne wstrzyknięcie lidokainy.
   3. Wprowadzić cewnik 25 G do żyły usznej bocznej.
   4. Ocenić przepuszczalność przez wstrzyknięcie 1 ml sterylnej surowicy fizjologicznej.
   5. Utrzymuj cewnik za pomocą klepania.
2. Znieczulić zwierzęta poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (30 mg/kg masy ciała) zmieszanej z ksylazyną (4 mg/kg). Zwierzęta są w pełni znieczulone, gdy nie reagują na szczypanie łapy. Umieść maskę na twarz na króliku, podając mu tlen o natężeniu przepływu 200 ml/min.
3. Po całkowitym znieczuleniu zabierz zwierzęta do jednostki obrazowania MR. Umieść zwierzęta tak, aby kolana znajdowały się pośrodku cewki MR. Ułóż nogi zwierząt w pełnym wyprostowaniu, tak aby długa oś kości piszczelowej była równoległa do stołu unitu do obrazowania MR. Używaj zapięć na rzepy lub worków z piaskiem, aby utrzymać optymalną pozycję nóg.
4. Monitorowanie układu krążeniowo-oddechowego zwierząt nie jest wymagane, ponieważ protokół anestezjologiczny pozwala na głębokie znieczulenie przy spontanicznym oddychaniu, ale zwierzęta muszą być przykryte, aby uniknąć utraty ciepła wywołanej znieczuleniem.
5. Protokół MR jest szczegółowo opisany w Tabeli 1. Średni czas całkowitej akwizycji wraz z optymalną instalacją wynosi około 20 minut.
6. Wykonuj obrazowanie MR w różnych płaszczyznach. Niemniej jednak płaszczyzna poprzeczna kolan (prostopadła do kości piszczelowej) jest planem odniesienia, ponieważ zapewnia anatomiczną odtwarzalność pozycji obrazu dla sekwencyjnych badań podłużnych i umożliwia optymalną korelację z warstwami histologicznymi.
7. Po zakończeniu niewzmocnionych sekwencji wstrzyknąć środek kontrastowy UPSIO przez małżowinę uszną. Cząsteczki tlenku żelaza należy powoli podawać w pojedynczej dawce 150 μmol Fe/kg. Przepłukać cewnik przez wstrzyknięcie 1 ml sterylnej surowicy fizjologicznej.
8. Powtórzyć rozszerzoną sekwencję ważoną GRE 24 godziny po wstrzyknięciu. To opóźnienie pozwala na fagocytyzację cząstek przez makrofagi.
9. W przypadku badań podłużnych oceniających działanie leków (antybiotyki, sterydy, przeciwciała antymakrofagowe itp.) należy powtórzyć sekwencyjne badania MR przy użyciu wyżej opisanego protokołu.

3. Analiza obrazu

1. W celu oceny podłużnej wykonaj pomiary na tym samym poziomie anatomicznym i zdefiniuj łatwy do zidentyfikowania punkt orientacyjny. Na przykład akwizycja przez płaszczyznę osiową, w której obserwuje się największą średnicę rzepki, jest niezawodnym sposobem na uzyskanie powtarzalnego pomiaru (ryc. 1).
2. Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą oprogramowania opartego na standardzie DICOM (takiego jak Osirix) lub oprogramowania do przetwarzania obrazów (ImageJ).
3. Korzystając z oprogramowania ImageJ, wykonaj segmentację obszaru maziowego, która wykazuje utratę sygnału na obrazie GRE T2-weighted wzmocnionym USPIO, za pomocą narzędzia do rysowania "nieregularnego obszaru". Po obrysowaniu błony maziowej z ciemnym sygnałem kliknij "Analizuj", aby uzyskać obszar/liczbę pikseli (ryc. 2).

Wyniki

Na obrazach niezkontrastowanych błona maziowa zainfekowanych kolan wykazuje rozlane obrzęki o sygnale pośrednim, który nie jest rozróżnialny od otaczających tkanek miękkich, podczas gdy kość udowa i rzepka jawią się jako struktury o niskim sygnale (Rysunek 1).

Na obrazach wzmocnionych USPIO, 24 h po podaniu środka kontrastowego, obszar błony stawowej zawierający makrofagi obciążone USPIO wykaże utratę sygnału (Rysunki 1 i 2).

Dyskusja

Podczas gdy niespecyficzne środki kontrastowe na bazie gadolinu dostarczają informacji o objętości i perfuzji przestrzeni zewnątrzkomórkowej, obrazowanie makrofagów za pomocą rezonansu magnetycznego wzmocnionego USPIO umożliwia precyzyjną lokalizację anatomiczną i jakościową ocenę infiltracji makrofagów w zakażonej błonie maziowej bez konieczności pobierania próbek tkanek⁹. Ze względu na ich wysoką czułość, USPIO może wykazać nawet subtelny naciek komórkowy obecny we wczesnych fazach infekcji. W przypadku skut...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa odczynnika/materiału	Firma	katalogowy	Komentarze
P904	Guerbet		Dawka: 150 μ mol Fe/kg
Ketamina (500 mg/ml ketaminy)	Virbac		Dawka: 30 mg/kg
Rompun (20 mg/ml ksylazyna)	Axience Dawka		: 4 mg/kg
Buprenorfina	Wetochinol		Dawka: 0,1 mg/kg/8 godz
BD 22 G, 1 cal	BD Biosciences	381423
BD 25 G, 5/8 cala	BD Biosciences	305122

Numer .