Selektywne śledzenie włókien słuchowych w ptasim embrionalnym nerwie przedsionkowo-ślimakowym

Michelle R. Allen-Sharpley; Michelle Tjia; Karina S. Cramer

doi:10.3791/50305

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Selektywne śledzenie włókien słuchowych w ptasim embrionalnym nerwie przedsionkowo-ślimakowym

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50305

⸱

18 marca 2013

Michelle R. Allen-Sharpley¹ , Michelle Tjia¹ , Karina S. Cramer¹

¹Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy technikę mikrodysekcji, po której następuje wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do zwoju akustycznego wczesnych zarodków piskląt w celu selektywnego śledzenia włókien aksonu słuchowego w nerwie i tyłomózgowiu.

Streszczenie

Pisklę embrionalne jest powszechnie używanym modelem do badania projekcji obwodowych i centralnych komórek zwojowych. W układzie słuchowym selektywne znakowanie aksonów słuchowych w obrębie VIII nerwu czaszkowego wzmocniłoby badania nad rozwojem centralnego obwodu słuchowego. Takie podejście jest trudne, ponieważ wiele narządów zmysłów ucha wewnętrznego przyczynia się do rozwoju VIII nerwu ¹. Co więcej, markery, które wiarygodnie odróżniają słuchowe i przedsionkowe grupy aksonów w obrębie ptasiego VIII nerwu, nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Ścieżki słuchowe i przedsionkowe nie mogą być funkcjonalnie rozróżnione we wczesnych zarodkach, ponieważ reakcje wywołane czuciowo nie są obecne przed utworzeniem obwodów. W niektórych badaniach śledzono centralnie wystające osiii aksony nerwowe, ale znakowaniu aksonów słuchowych towarzyszyło znakowanie z innych VIII komponentów nerwowych ^2,3. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia następczego od zwoju akustycznego w celu selektywnego oznaczania aksonów słuchowych w rozwijającym się VIII nerwie. Po pierwsze, po częściowym rozbiorze przedniego obszaru głowowego 8-dniowego zarodka pisklęcia zanurzonego w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym, przewód ślimakowy jest identyfikowany za pomocą anatomicznych punktów orientacyjnych. Następnie umieszcza się cienką szklaną mikropipetę, aby wstrzyknąć niewielką ilość rodaminy i dekstranu aminy do przewodu i przyległego głębokiego obszaru, w którym znajdują się akustyczne komórki zwojowe. W ciągu trzydziestu minut po wstrzyknięciu aksony słuchowe są śledzone centralnie w tyłomózgowiu i mogą być później uwidocznione po przygotowaniu histologicznym. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do badań rozwojowych nad powstawaniem obwodów słuchowych od obwodowych do ośrodkowych.

Protokół

1. Przygotuj następujące narzędzia i odczynniki do preparowania

Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF; 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 20 mM NaHCO₃, 3 mM HEPES, 10 mM Glukoza, 2 mM CaCl₂, 1,3 mM_MgSO4) w sposób ciągły podawany z 95% O₂ / 5% CO₂ w temperaturze pokojowej. Do infuzji napełnij do 2/3 500 ml słoik Nalgene z szerokim otworem wywierconym w pokrywce. Zbiornik zostanie przymocowany za pomocą rurki do bełkotki ze szklaną łodygą, która przenika do CSF przez otwór w pokrywie słoika. Dostosuj ciśnienie, aby uzyskać stały strumień bąbelków, które docierają do około 1/3 cieczy, ale nie są wystarczająco silne, aby spowodować rozpryskiwanie się na obręczy. Zanurzyć szklane fiolki o pojemności 5 ml (do 6) w słoiku Nalgene w celu oddzielenia poszczególnych próbek od siebie i od turbulencji przepływu gazu. ACSF powinien być natleniany przez co najmniej 20 minut przed jakąkolwiek inkubacją tkanek.
Mała silikonowa naczynie preparacyjne (35 mm x 10 mm Petriego pokryte za pomocą zestawu elastomerów Sylgard) z dwoma kołkami preparacyjnymi umieszczonymi w małej sześciokątnej łódce do ważenia polistyrenu (47 mm na dole).
Dwa kleszczyki z cienką końcówką, jeden kleszcz z zakrzywioną końcówką, zlewka o pojemności 50 ml i pojemnik na odpady tkankowe.
Wyciągnięta szklana mikropipeta (1,2 OD / 0,9 ID) rozbita do około 20-50 μm otwór na końcówce i wypełniona rodamino-dekstranoaminą (RDA, MW = 3,000, Invitrogen) w 6,25% roztworze z 0,4% Triton X-100 w PBS. Przymocuj za pomocą cienkiej rurki do pikospritzera i ustabilizuj do mikromanipulatora.

2. Mikropreparacja w celu odsłonięcia brodawki podstawnej w E8 ^4,5

Za pomocą zakrzywionych kleszczy odetnij zarodek E8 tuż pod pniem mózgu, umieszczając głowę bezpośrednio na pokrytym silikonem naczyniu preparacyjnym w łodzi do ważenia.
Za pomocą szpilek do preparowania ustaw głowę tak, aby ucho po stronie zainteresowania było lekko widoczne, głowa lekko pochylona grzbietowo i skierowana 10-30 stopni od środka (ryc. 2A). Natychmiast zabezpiecz głowę szpilkami. Jeśli pożądane jest śledzenie obustronne, wyśrodkuj głowę pod kątem 0 stopni lub pełny widok brzuszny, aby można było uzyskać dostęp po obu stronach. Podobnie, w przypadku wstrzyknięcia lewostronnego, należy zabezpieczyć głowę pod kątem od -10 do -30 stopni od środka, tak aby lewa strona była dostępna.
Za pomocą zlewki o pojemności 50 ml przenieść 30 ml natlenionego płynu CSF do naczynia, całkowicie zanurzając tkankę.
Delikatnie chwyć i oderwij dolną szczękę za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, a następnie zdejmij dolną powiekę po stronie zainteresowania.
Usuń leżącą nad nim tkankę naczyniową, w tym pozostałe podniebienie i przełyk. Te tkanki miękkie powinny się złuszczać, odsłaniając gładką powierzchnię rozwijającego się chondroczaszki z charakterystycznymi tętnicami kręgowymi na jej powierzchni. W tym momencie powinna być widoczna charakterystyczna biała masa otoconialna.
Ostrożnie przeanalizuj skórę wokół przewodu zewnętrznego, chrząstki stawu szczękowego i ucha środkowego, pozostawiając ucho wewnętrzne nienaruszone. Użyj kleszczy, aby delikatnie odciąć te chrzęstne struktury.
Usuń tętnice kręgowe i gromadzącą się krew delikatnym ruchem zamiatającym cienkimi końcówkami kleszczy. Krew może zasłaniać widok, a krzepnięcie może zatkać otwór pipety iniekcyjnej.
Przewód ślimakowy z przylegającym nabłonkiem czuciowym (brodawką podstawną) i zwojem akustycznym leży bezpośrednio pod chondroczaszką ⁶ i może być wizualizowany jako wydłużona projekcja przypominająca palec rozciągająca się od ucha wewnętrznego brzusznie, z dystalnym końcem (wierzchołkiem) w pobliżu przedniej linii środkowej ⁵. Może wystąpić niewielka kałuża krwi (czerwona) z sekcji i/lub zwapnienia otolityczne (białe) na wierzchołku przewodu ślimakowego (ryc. 2B), które mogą pomóc w wizualizacji. Na wierzchołku znajduje się plamka krzgowata, plama czuciowa, o której uważa się, że pełni funkcję przedsionkową ^7,8.

3. Selektywne znakowanie włókien słuchowych CN VIII

Umieścić pipetę do wstrzykiwań w pobliżu powierzchni zarodka w przewodzie ślimakowym i okolicy brodawki podstawnej.
Powoli opuść mikropipetę, aby najpierw nakłuć czaszkę. Ten obszar czaszki jest cieńszy niż otaczające go obszary i wymaga mniejszej siły do penetracji. Mikropipeta powinna teraz znajdować się w przewodzie ślimakowym. Opcjonalnie: w tym miejscu można wykonać mały zastrzyk barwnika śledzącego, aby pomóc w wizualizacji brodawki podstawnej.
Bez zmiany położenia mikropipety kontynuuj opuszczanie, aż dotrze ona do głębokiej granicy przewodu ślimakowego (Rysunek 1). Wykonaj wstrzyknięcie w tym miejscu i powtórz w wielu regionach wzdłuż brodawki podstawnej (ryc. 2C, 2D), z wyjątkiem najbardziej proksymalnego końca, w którym znajduje się lagena przedsionkowa. Przy ciśnieniu pikospritzera ustawionym na 10-30 psi wykonuje się kilka wstrzyknięć. Objętość wstrzykiwanego płynu barwiącego jest różna i zależy od pożądanego zakresu etykietowania. Każde wstrzyknięcie powinno skutkować powstaniem plamki znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym o średnicy około 200 - 400 μm (ryc. 2D).
Po zakończeniu wstrzyknięcia użyj kleszczy, aby przeciąć próbkę powyżej pnia mózgu i użyj pipety do przenoszenia, aby umieścić część ogonową w małym słoiku w pojemniku z CSF, który jest stale perfuzjowany 95% O₂ / 5% CO_{2 .}
Dla każdego zarodka należy odczekać 20-30 minut na transfer barwnika, w zależności od pożądanej odległości środkowego śledzenia.
Usuń tkankę i przygotuj się do cięcia histologicznego. W przedstawionym przykładzie tkanka jest zanurzana w 4% paraformaldehydzie (w 1X PBS) na noc, 30% sacharozy (w 1X PBS) na noc.

4. Przeciwbarwienie i analiza

Barwienie przeciwstawne jest przydatne, aby pomóc obserwatorowi zorientować się w położeniu anatomicznym, a także zidentyfikować określone obszary zainteresowania. Skutecznym przeciwbarwnikiem w tym preparacie jest immunoznakowanie neurofilamentów (ryc. 1, 3B, 3E), które silnie znakuje aksony i pozwala na rozgraniczenie dróg aksonalnych w OUN.
Analizę należy przeprowadzić w całym oznaczonym obszarze, ponieważ wypustki mogą rozciągać się na kilkaset mikronów lub więcej wzdłuż osi ostroogonowej. Oto kilka przykładów analiz podstawowych: docelowe poziomy błędów, czas lub zmiany rozbieżności w wzorcach projekcji. Aksony znakowane RDA są wizualizowane w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym z wysoką rozdzielczością (ryc. 3A, 3D).