Artykuł metodologiczny

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

DOI:

10.3791/50308

⸱

10 kwietnia 2013

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Długotrwała niepełnosprawność poznawcza po TBI jest związana z wywołaną urazem neurodegeneracją w hipokampie - regionie w przyśrodkowym płacie skroniowym, który jest krytyczny dla uczenia się, pamięci i funkcji wykonawczych. 1,2 Dlatego nasze badania koncentrują się na analizie ekspresji genów w określonych populacjach neuronów w różnych podregionach hipokampa. Technika mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM), wprowadzona w 1996 roku przez Emmert-Buck i wsp.3, pozwoliła na znaczny postęp w analizie ekspresji genów pojedynczych komórek i wzbogaceniu populacji komórek z heterogenicznych tkanek, takich jak mózg ssaków, który zawiera tysiące funkcjonalnych typów komórek. 4 Używamy LCM i dobrze znanego szczurzego modelu urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) do zbadania mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw patogenezy TBI. Po TBI z płynną interakcją mózgi są usuwane w określonym czasie po urazie, natychmiast zamrażane na suchym lodzie i przygotowywane do sekcji w kriostacie. Mózgi szczurów mogą być osadzone w OCT i natychmiast podzielone na sekcje lub przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C przed sekcją w celu wychwytywania laserowego mikrodysekcji. Dodatkowo używamy LCM do badania wpływu TBI na rytmy okołodobowe. W tym celu wychwytujemy neurony z jąder nadskrzyżowaniowych, które zawierają główny zegar mózgu ssaków. Tutaj demonstrujemy zastosowanie LCM do uzyskania pojedynczych zidentyfikowanych neuronów (uszkodzonych i degenerujących, fluoro-jadeitowo-dodatnich lub nieuszkodzonych, fluoro-jadeitowych) oraz wzbogaconych populacji neuronów hipokampa do późniejszej analizy ekspresji genów za pomocą PCR w czasie rzeczywistym i / lub mikromacierzy całego genomu. Te badania z wykorzystaniem LCM ujawniły, że selektywna podatność anatomicznie odrębnych regionów hipokampa szczura znajduje odzwierciedlenie w różnych profilach ekspresji genów różnych populacji neuronów uzyskanych przez LCM z tych odrębnych regionów. Wyniki naszych badań na pojedynczych komórkach, w których porównujemy profile transkrypcyjne umierających i sąsiednich neuronów hipokampa, które przeżyły, sugerują istnienie reostatu przeżycia komórki, który reguluje śmierć i przeżycie komórki po TBI.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza ekspresji genów w heterogenicznych tkankach zawsze była problematyczna; jest to szczególnie prawdziwe w mózgu ssaków, który ma około 5 000 różnych typów komórek. 4 Przed opracowaniem techniki mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) badania genomiczne skutków TBI in vivo opierały się na analizie ekspresji genów w mieszanej populacji komórek mózgowych składającej się nie tylko z różnych typów komórek neuronalnych, ale także z komórek podtrzymujących glejowo i immunomodulujących. Uzyskane w ten sposób złożone profile ekspresji genów uzyskane z tych heterogenicznych tkanek oraz często sprzeczne wzorce sygnałów komórkowych wywołanych urazem mogą być jednym z wyjaśnień niepowodzenia w badaniach klinicznych na ludziach strategii terapeutycznych, które okazały się skuteczne w badaniach przedklinicznych TBI. 5

Aby uzyskać jasne zrozumienie ekspresji genów wywołanych urazami w wrażliwych populacjach neuronów z hipokampa szczura, zastosowaliśmy technikę LCM, po raz pierwszy opisaną przez Emmert-Buck i wsp. 3 Następnie zmodyfikowaliśmy i zoptymalizowaliśmy tę technikę mikrodysekcji w celu skutecznego wychwytywania wzbogaconych populacji neuronów i pojedynczych neuronów do profilowania mRNA za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym i analizy mikromacierzy. Aby zachować integralność mRNA w zamrożonych odcinkach tkanki mózgowej do analizy genomicznej, zmodyfikowaliśmy istniejące protokoły utrwalania, barwienia i szybkiego wychwytywania neuronów z zamrożonych odcinków mózgu szczura. W celu identyfikacji i izolacji uszkodzonych i umierających neuronów hipokampa zoptymalizowaliśmy również technikę barwienia fluoro-jadeitowego dla LCM. Jadeit fluorowy nie rozróżnia apoptozy i martwiczej śmierci komórek. W ten sposób wszystkie typy degenerujących się neuronów mogą być wykryte przez to barwienie. 6,7

Tutaj opisujemy protokół używany w naszym laboratorium do uzyskiwania pul pojedynczych umierających lub ocalałych neuronów, a także połaci wzbogaconych populacji różnych typów komórek neuronalnych (np. neuronów CA1-CA3 do analizy ekspresji genów po TBI). Procedura uszkodzenia mózgu spowodowanego płynną udarem płuc wykonywana w naszym laboratorium jest szczegółowo opisana w Shimamura i wsp.8 i jest bardzo podobna do protokołu bocznego uszkodzenia płynu i wsp. dla myszy opublikowanego w JoVE przez Aldera i wsp. 9 Ponieważ wykazano, że technika LCM ma minimalny lub żaden wpływ na integralność DNA, RNA i białka w tkankach, jest to doskonałe narzędzie do analizy molekularnej i białkowej określonych typów komórek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zabiegi chirurgiczne i płynowa stymulacja TBI

  1. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są najpierw zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksańskiego w Galveston w Teksasie oraz przez Przewodnik Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczący opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (wydanie 8, Krajowa Rada ds. Badań Naukowych).
  2. Szczury (dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley, 400-500 g uzyskane od sprzedawcy Charlesa Riversa, Portland, Maine) są trzymane po dwa w klatce i dostarczane są pożywienie i wodę ad libitum w wiwarium w następujących stałych warunkach: cykl światła (600 godzin do 1800 godzin), temperatura (21 °C do 23 °C) i wilgotność (40% do 50%) na tydzień przed użyciem.
  3. Znieczulić szczury 4% izofluranem, zaintubować i mechanicznie przewietrzyć (NEMI Scientific; New England Medical Instruments, Medway, MA) szczury z 1,5-2,0% izofluranem w tlenie: powietrze (70:30) i przygotowują je do przystrzałkowego urazu płynowo-uderzeniowego, jak opisano wcześniej. 8,10
  4. Składanie ofiar ze szczurów w odpowiednim momencie po zranieniu, w zależności od projektu eksperymentalnego. Szybko wyjmij mózgi, natychmiast zamroź na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze -80 °C w probówce o pojemności 50 ml lub natychmiast przystąp do zatopienia w OCT w celu zamrożonego podziału.

2. Podział i barwienie mózgu szczura

  1. Tkanka mózgowa, która nie jest natychmiast wykorzystywana, może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez okres do jednego miesiąca, jeśli jest przechowywana w stałej temperaturze. Mózgi, które są zamrażane w temperaturze -80 °C, następnie rozmrażane do -20 °C w celu podziału, a następnie ponownie zamrażane, nie dają wysokiej jakości RNA po drugim rozmrożeniu. Po rozmrożeniu mózgu, zamontowaniu w OCT i pocięciu na sekcje, szkiełka należy wybarwić w ciągu 24 godzin i użyć do LCM w ciągu 30 minut do jednej godziny od barwienia. Zapewni to dobrą jakość RNA. Po LCM wychwycone komórki na czapeczkach LCM mogą być przechowywane w buforze do lizy w temperaturze -80 °C przez okres do jednego tygodnia, ale RNA powinno być izolowane w odpowiednim czasie, aby zapewnić najwyższą jakość.
  2. Przed sekcją mózgu przetrzyj kriostat RNase-Zap i wyczyść szczoteczki ETOH (wymień jednorazowe ostrze między każdym mózgiem).
  3. Pobrać mózg z probówki o pojemności 50 ml z zamrażarki o temperaturze -80 °C; umieścić go w kriostacie w temperaturze -22 °C i rozmrażać w probówce przez około 10 minut. Usunąć mózg z probówki i umieścić na scenie, na gazie, brzuszną stroną do góry.
  4. Za pomocą żyletki pokrój mózg, aby usunąć tylną część mózgu tylko rostralną do móżdżku i przednią część na skrzyżowaniu wzrokowym. Napełnij kriomold podłożem montażowym OCT (Tissue Tek) i umieść mózg w formie przednią stroną do dołu. Pozwól tkance mózgowej zamrozić się w podłożu mocującym, aż zmieni kolor na biały (około 10 min).
  5. Zamroź krążek próbki (Tissue Tek) na mózgu za pomocą OCT. Usuń mózg z formy. Włóż mózg do głowicy próbki i dokręć.
  6. Włóż jednorazowe, niskoprofilowe ostrze (Fisher Scientific) do uchwytu noża i dokręć dźwignię.
  7. Rozpocznij krojenie mózgu na 20 μm, aby usunąć zewnętrzną warstwę OCT. Po osiągnięciu obszaru hipokampa ustaw pokrętło mikronowe na 10. Zbierz koronalne odcinki szeregowe, umieszczając szkiełko podstawowe lub szkiełko z plusem na przekroju tkanki (Fisher Scientific). Szkiełka są przechowywane w temperaturze -20 °C w stojaku do barwienia bez RNaz do czasu zakończenia cięcia.
  8. Aby usunąć wszystkie RNazy ze szkła, w którym przetwarzane są skrawki tkanki, przetrzyj wszystkie pojemniki do barwienia i cylindry z podziałką Eliminase (Fisher Scientific) i spłucz w wodzie Milli Q. Przygotuj wszystkie roztwory wodą wolną od RNaz i przefiltruj plamę fioletu krezylowego (Sigma-Aldrich) i fluorojadeitu (Histo-chem) za pomocą filtra 0,2 μm przed użyciem.
  9. Rozmrażaj skrawki mózgu w RT przez 30 sekund i utrwalaj w 75% ETOH (1 min).
  10. W przypadku LCM pojedynczych uszkodzonych neuronów po fiksacji spłukać szkiełka w wodzie wolnej od RNaz (1 min), przeciwbarwieć 1% fioletem krezylowym (15-20 sek), spłukać w wodzie wolnej od RNaz (2 × 30 sek.), zabarwić Fluoro-Jade (4 min), spłukać w wodzie wolnej od RNaz (3 × 1 min), odwodnić 95% ETOH wykonanym z wody wolnej od RNaz (30 sek.), 100% ETOH (30 sek.), i ksylenu (2 × 3 min).
  11. W przypadku LCM połaci neuronów po utrwaleniu spłucz szkiełka w wodzie wolnej od RNaz (1 min), zabarwij 1% fioletem krezylowym (1 min), spłucz wodą wolną od RNaz przez (3 × 1 min), odwodnij 95% ETOH (2 × 30 s), 100% ETOH (2 × 30 s) i ksylenem (2 × 3 min).
  12. Wysuszyć wszystkie sekcje na powietrzu w dygestorium przez 15 minut przed LCM. Szkiełka można przechowywać sekcjami do góry, w pudełku na slajdy wyłożonym środkiem osuszającym, jeśli zachodzi potrzeba przenoszenia z pokoju do pokoju. Jednak optymalne wyniki uzyskuje się, jeśli LCM wykonuje się natychmiast po wyschnięciu sekcji. LCM powinien być ograniczony od 30 minut do 1 godziny. W następnej sekcji opiszemy najpierw, jak uchwycić ciągłe połacie komórek, co jest najłatwiejsze do opanowania dla tych, którzy uczą się tej techniki. Następnie opisujemy, jak precyzyjnie uchwycić pojedyncze neurony. W naszej procedurze identyfikujemy umierające neurony na podstawie ich powinowactwa do Fluoro-Jade-markera degeneracji neuronów. Zakłada się, że komórki fluoro-jadeitowo-ujemne są neuronami, które przeżyły.

3. Mikrodysekcja laserowa (LCM)

LCM połaci wzbogaconych populacji neuronów hipokampa

  1. LCM wykonywany jest przy użyciu mikroskopu PixCell IIe z laserem diodowym na podczerwień (Life Technologies).
  2. Ustaw środkowy joystick w pozycji pionowej. Obróć i zablokuj obiektyw 4X na swoim miejscu.
  3. Umieść szkiełko na środku stolika mikroskopu i ręcznie wyreguluj, aż obszar hipokampa będzie widoczny. Użyj zgrubnej i precyzyjnej regulacji ostrości, aby ustawić ostrość obrazu.
  4. Aktywuj uchwyt podciśnieniowy, naciskając przycisk podciśnienia na sterowniku. Obróć i zablokuj obiektyw 10X na miejscu. Ponownie ustaw ostrość za pomocą zgrubnych i precyzyjnych regulacji.
  5. Załaduj nasadki CapSure Macro LCM (Life Technologies) do modułu kasety CapSure i umieść nasadkę w pozycji linii ładowania. Obróć ramię do umieszczania nasadki i ustaw wokół nasadki. Podnieś ramię do umieszczania nasadki, aby zdjąć nasadkę CapSure z modułu kasety.
  6. Obróć ramię do umieszczania nasadki nad suwakiem i opuść ramię w dół nad suwakiem; spowoduje to umieszczenie nasadki na suwaku. Dostosuj precyzyjną ostrość i przesuń joystick, aby sprawdzić, czy komórki znajdują się w czarnym kółku na nasadce. Wszystkie przechwycone komórki powinny znajdować się w tym czarnym okręgu.
  7. Ustaw parametry lasera. Najpierw naciśnij przycisk włączania lasera na kontrolerze. Plamka celu laserowego będzie widoczna jako różowa kropka w polu view na monitorze komputera.
  8. Ustaw rozmiar plamki lasera na mały (7,5 μm), aby ustawić ostrość lasera i dostosuj moc i czas trwania do 65 - 75 mW, przez 1,0-2,0 ms w razie potrzeby dla optymalnego wychwytywania komórek.
  9. Aby przetestować laser, użyj joysticka, aby przesunąć plamkę lasera do obszaru, w którym nie ma komórek do podniesienia. Odpal laser za pomocą przełącznika kciukowego. Użyj joysticka, aby odsunąć plamkę lasera od plamki stopionego polimeru i sprawdź, czy widoczny ciemny pierścień otacza czysty obszar, w którym laser został wystrzelony.
  10. Aby przechwycić komórki, użyj joysticka, aby przesunąć plamkę lasera nad obszarem komórek, które chcesz przechwycić. Odpal laser za pomocą przełącznika kciukowego. Poruszaj joystickiem podczas odpalania lasera, aby uchwycić duży obszar komórek. Po wystrzeleniu laser topi termoplastyczną folię polimerową na nasadce na powierzchni komórek docelowych. Polimer pochłania promieniowanie laserowe, nie zmieniając w ten sposób RNA, DNA ani białka, zapewniając integralność próbki do przyszłych zastosowań molekularnych.
  11. Po wystrzeleniu wszystkich interesujących komórek podnieś ramię umieszczania nasadki. Uchwycone komórki oddzielą się od części tkanki i przylgną do nasadki CapSure. Pozostała tkanka i brakujące komórki będą widoczne w polu widzenia. Komórki na nasadce można również wyświetlić, umieszczając nasadkę na pustej części szkiełka.
  12. Podnieś ramię do umieszczania nasadki i obróć je do stacji rozładunku nasadki. Opuść nasadkę do stacji i obróć ramię do umieszczania nasadki z powrotem do poprzedniej pozycji.
  13. Przesuń narzędzie do wkładania CapSure wzdłuż platformy i na nasadkę. Podnieś narzędzie z platformy. Nasadka pozostanie przymocowana. Delikatnie przyłóż nasadkę do wkładki CapSure clean, aby usunąć niechcianą tkankę.
  14. Umieść nakrętkę w 0,5 ml probówce wolnej od RNaz wypełnionej 100 μl buforu do lizy uzyskanego z zestawu do mikroizolacji RNAqueous. Natychmiast wiruj nasadkę przez 30 sekund, aby zlizować komórki. Próbki inkubować w temperaturze 42 °C przez 30 minut i zamrażać w temperaturze -80 °C do czasu izolacji RNA.

LCM pojedynczych neuronów FJ+ w hipokampie

  1. Aby przechwycić pojedyncze ogniwa, załaduj nasadki CapSure HS LCM do modułu kasety CapSure i umieść nasadkę w pozycji linii ładowania. Obróć ramię do umieszczania nasadki i umieść je wokół nasadki. Podnieś ramię do umieszczania nasadki, aby zdjąć nasadkę CapSure z modułu kasety.
  2. Ustaw rozmiar plamki lasera na mały (7,5 μm), aby ustawić ostrość lasera i dostosuj moc i czas trwania lasera do 65 -75 mW przez 0,45 do 0,50 ms, aby uzyskać optymalne wychwytywanie pojedynczych komórek.
  3. Obróć ramię do umieszczania nasadki nad suwakiem i opuść ramię w dół w kierunku suwaka. Spowoduje to umieszczenie nasadki na szkiełku. Powierzchnia nasadki Capsure HS znajduje się uniesiona w stosunku do próbki podczas LCM.
  4. Użyj joysticka, aby przesunąć laser nad pojedynczymi ogniwami FJ+. Wszystkie przechwytywane komórki muszą znajdować się wewnątrz małego czarnego pierścienia na nasadce. Odpal laser za pomocą przełącznika kciukowego.
  5. Gdy wszystkie komórki w obszarze czarnego koła zostaną wystrzelone laserem, podnieś ramię umieszczania nasadki. Uchwycone komórki oddzielą się od części tkanki i przylgną do nasadki CapSure HS.
  6. Umieść kolejny szkiełko na stoliku mikroskopu i zbieraj komórki FJ+, aż nasadka HS będzie pełna. Umieść nakrętkę w 0,5 ml probówce wolnej od RNaz wypełnionej 40-50 μl buforu do lizy. Natychmiast wiruj nasadkę przez 30 sekund, aby zlizować komórki. Próbki inkubować w temperaturze 42 °C przez 30 minut i zamrażać w temperaturze -80 °C do czasu izolacji RNA.

4. Całkowita izolacja RNA z próbek LCM (Ta sekcja zostanie opisana w prezentacji wideo)

  1. Całkowite RNA z komórek izoluje się za pomocą zestawu RNAqueous-Micro Kit (Ambion) zgodnie z protokołami producenta. Wszystkie odczynniki i roztwory myjące znajdują się w tym zestawie. Wstępnie zwilż zespół wkładu mikrofiltra, dodając do filtra 30 μl buforu roztworu do lizy. Po 5 minutach odwirować filtr przez 30 sekund przy 10 000 × g.
  2. Dodać 3 μl dodatku LCM do lizatu próbki, odpipetować do wymieszania i odwirować.
  3. Dodać 52 μl 100% ETOH (1/2 objętości) do lizatu próbki; odpipetować do wymieszania i przenieść lizat do kolumny filtrującej.
  4. Odwirować kolumnę filtrującą o stężeniu 10 000 × g przez 1 minutę, aby związać RNA z kolumną. Jeżeli na jedną próbkę przypada wiele nasadek, należy oddzielnie przepuścić każdy lizat przez tę samą kolumnę.
  5. Wykonaj procedurę izolacji RNA zgodnie z opisem w zestawie RNAqueous Micro.
  6. Przeprowadzić obróbkę DNazą i inaktywację DNazy próbek RNA LCM zgodnie z opisem w zestawie, przenieść RNA do probówki wolnej od RNaz i przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Kwantyfikacja RNA i dalsze zastosowania

Ocena jakości RNA i kwantyfikacji jest przeprowadzana za pomocą Bioanalizatora Agilent przy użyciu odczynników z zestawu Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) zgodnie z protokołem producenta.

  1. Całkowite RNA jest analizowane na bioanalizatorze Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Oprogramowanie ocenia stężenie i integralność próbki RNA, przypisując każdej próbce numer integralności RNA (RIN) w zakresie od 1 do 10. 1-5 oznacza zdegradowany RNA, a 7-10 oznacza RNA dobrej jakości.
  2. Niezdegradowany, nienaruszony RNA zostanie wykorzystany do Real-Time PCR; indywidualnych testów Taqmana lub matryc profilujących RT2 przy użyciu chemii Sybr-green. RNA może być również używany do analizy mikromacierzy mRNA i analizy mikromacierzy mikroRNA.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszym pierwszym badaniu LCM udało nam się wykazać, że funkcjonalnie odrębne podregiony (CA1 i CA3) hipokampa szczura mają profile ekspresji genów, które odzwierciedlają ich podatność na TBI. 8 Rycina 1A-1C przedstawia laserowe przechwytywanie neuronów piramidowych hipokampa (CA1-CA3), neuronów zakrętu zębatego i neuronów SCN przed i po LCM. Czyste przechwycone neurony piramidowe, ziarniste lub SCN, odpowiednio, są pokazane na makro czapkach. Rycina 2A-2B ilustruje umierające, fluoro-jadeitowe neurony piramidowe dodatnie i przeżywające, fluoro-jadeiowe neurony piramidowe ujemne przed i po LCM. Czyste uchwycenie umierających lub ocalałych neuronów jest pokazane poprzez oglądanie przechwyconych komórek na czapeczkach LCM.

Po LCM, całkowite RNA może być wykorzystane do różnorodnych badań molekularnych, w tym ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym ekspresji genów przy użyciu TaqMan lub SYBR green chemistry (Rysunek 3A), małych skoncentrowanych matryc PCR z zielonymi sondami SYBR (Rysunek 3B) lub badań mikromacierzy całego genomu (Rysunek 3C).

figure-results-1
Rysunek 1. Mikrodysekcja laserowa połaci zdefiniowanych populacji komórek z mózgu szczura. Zamrożone 10 μm odcinki koronalne mózgu szczura utrwala się w etanolu, barwi barwnikiem nissl (fiolet krezylowy) i przygotowuje do LCM. Pokazano zdjęcia hipokampa szczura i jądra nadskrzyżowaniowego przed i po LCM oraz przechwycone komórki, jak pokazano na czapeczkach makro. A. Neurony piramidowe z podpól CA1-CA3 hipokampa szczura. Ur. Komórki ziarniste w zakręcie zębatym hipokampa. C. Obustronne jądra nadskrzyżowaniowe zlokalizowane po obu stronach trzeciej komory i zlokalizowane powyżej skrzyżowania wzrokowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-results-2
Rysunek 2. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji pojedynczych neuronów z hipokampa szczura. Pokazano A. Degenerujące, fluoro-jadeitowo-dodatnie (barwione) neurony CA3 hipokampa i B. Przeżywające, fluoro-jadeitowo-ujemne (niebarwione) neurony CA3 przed i po LCM. Przechwycone komórki są wizualizowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-results-3
Rysunek 3. Analiza ekspresji genów całkowitego RNA wyizolowanego z neuronów wychwyconych laserowo. ZA. Ilościowe dane PCR w czasie rzeczywistym dotyczące ekspresji genów zegara okołodobowego w SCN. Ur. Mapa cieplna ekspresji genów w umierających i ocalałych neuronach hipokampa pokazująca ekspresję genów związanych z apoptozą przy użyciu zogniskowanych matryc PCR. C. Analiza całogenomowej mikromacierzy Agilent ekspresji genów w neuronach CA1-CA3 hipokampa od szczurów, które otrzymały pozorowane urazy, TBI lub TBI plus rekombinowany wirus siRNA związany z adeno, zaprojektowany w celu obniżenia ekspresji genów wywołanych uszkodzeniem mózgu (neuronalna syntaza tlenku azotu i peroksydaza glutationowa-1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta technika LCM umożliwiła nam poczynienie znacznych postępów w zrozumieniu mechanizmów molekularnych TBI. 8,10,11,12,13 Byliśmy pierwszymi badaczami, którzy wykorzystali tę technikę do wykazania, że różne podregiony hipokampa szczura mają profile ekspresji genów, które korelują z ich selektywną podatnością na uszkodzenia. Nasze badania wykazały, że możemy określić ilościowo ekspresję genów za pomocą qPCR z zaledwie 10 komórek wychwyconych laserowo i że możemy przeprowadzić analizę mikromacierzy całego genomu z zaledwie 600 przechwyconych komórek. LCM byłby cennym narzędziem w podobnych badaniach innych regionów mózgu, o których wiadomo, że są zaangażowane w różne zaburzenia neurologiczne i neuropsychiatryczne. Na przykład, badania z użyciem LCM rzuciły światło na patogenezę choroby Parkinsona w neuronach dopaminowych istoty czarnej i pomogły w badaniach profilowania całego genomu jądra półleżącego, które jest zaangażowane w obwody nagrody związane z zaburzeniami związanymi z nadużywaniem substancji. 15

Heterogeniczność neuronów znajduje odzwierciedlenie na poziomie genomu16 i może przyczyniać się do braku powodzenia eksperymentalnych metod leczenia TBI w badaniach klinicznych. Dlatego naszym celem jest wykorzystanie tej techniki do zbadania krytycznych elementów wpływających na przeżycie neuronów po TBI. Nasze niedawne badanie profilowania całego genomu umierających i sąsiednich neuronów hipokampa, które przeżyły po TBI, sugerowało, że reostat komórkowy, który odzwierciedla stosunek poziomów ekspresji genów przeżycia komórki do śmierci komórki, reguluje los komórki po TBI. Trwające badania przyczynią się do zaprojektowania i opracowania strategii farmakoterapeutycznych, które mogą pozytywnie wpłynąć na reostat przeżywalności komórek. Co więcej, obecnie używamy LCM do śledzenia i monitorowania efektów potencjalnych terapii lekowych w neuronach hipokampa po TBI. W związku z tym nasze badania pokazują, że przy ostrożnych technikach obchodzenia się z RNazami i pewnych modyfikacjach istniejących protokołów, możliwe jest uzyskanie wysokiej jakości próbek RNA z LCM w celu dokładnej ilościowej analizy ekspresji genów.

Istnieje jednak kilka pułapek związanych z technikami LCM. Na przykład pobranie tylko komórek neuronalnych bez zanieczyszczenia mikroglejem może być prawie niemożliwe. Szacuje się, że w piramidalnej warstwie komórkowej hipokampa 95% komórek to neurony, przy czym 90% tej populacji to komórki piramidalne, a 10% to interneurony, pozostawiając niewielki odsetek komórek glejowych i innych typów komórek. 8,17,18 W naszych badaniach używamy fluoro-jadeitu, barwnika fluorescencyjnego, który specyficznie znakuje tylko uszkodzone neurony w tkance mózgowej. Do barwienia mikrogleju potrzebna byłaby inna plama, która jest markerem GFAP. 19 Zbieranie tylko pojedynczych ciał neuronalnych barwionych fluoro-jadeitem zapewnia bardziej jednorodną populację neuronów. Innym częstym problemem, który może wymagać rozwiązania problemu, jest to, że okrąg nie jest zdefiniowany podczas wystrzeliwania lasera. W takim przypadku należy sprawdzić ustawienia lasera i w razie potrzeby dostosować moc i czas trwania. Ważne jest również, aby upewnić się, że nasadka jest umieszczona płasko na tkance i prawidłowo osadzona w ramieniu. Czasami konieczne będzie zapoznanie się z instrukcją techniczną LCM lub skontaktowanie się z pomocą techniczną. Po izolacji LCM i RNA jakość RNA powinna być zawsze oceniana za pomocą bioanalizatora przed jakąkolwiek analizą ekspresji genów.

Obecnie na rynku dostępnych jest kilka rodzajów przyrządów do przechwytywania laserowego, w tym instrumenty do cięcia laserowego (Life Technologies, Leica Microsystems) i katapultowania laserowego (Zeiss). Nasz system LCM dobrze sprawdza się w przypadku przechwytywania niewielkiej liczby komórek. Inne wysokowydajne i bardziej zautomatyzowane systemy mogą być bardziej odpowiednie do uzyskiwania większej liczby komórek do analizy genomicznej, a zwłaszcza proteomicznej. Rzeczywiście, LCM wykorzystujący te zautomatyzowane systemy ma ogromny potencjał w zakresie analizy ekspresji białek w zidentyfikowanych komórkach lub wzbogaconych populacjach komórek. Co więcej, LCM może ułatwić analizę ekspresji genów w komórkach znakowanych immunologicznie,21 co pozwala nam badać ekspresję genów w zdefiniowanych typach komórek, niezależnie od złożoności w najbardziej heterogenicznych tkankach. Tym samym LCM jest doskonałym narzędziem do najnowocześniejszych badań molekularnych pojedynczych lub wzbogaconych populacji komórek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest finansowana przez R01 NS052532 (do HLH), Fundację Moody'ego i Dział Anestezjologii. Dziękujemy Laurie Bolding, Christine Courteau Butler i Christy Perry za ich pomoc redakcyjną oraz Christy Perry za układ i doskonałą produkcję wszystkich rysunków, tabel i grafiki.

Materiały

Mikroskop laserowy #1FJUTMB

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PixCell IIeLife Technologies (Arcturus)
Bioanalizator Agilent 2100Agilent Technologies
RNAqueous Micro- KitLife Technologies (Ambion)AM1931
Zestaw Agilent 6000 PicoAgilent Technologies5067-1513
Capsure LCMApplied BiosystemsLCM0211/LCM0214
Fluoro-JadeHisto-chem Inc.
Octan fioletu krezylowegoSigma-aldrichC5042-10G
Ksylen (klasa histologiczna)Fisher ScientificX3P-1GAL
Etanol 200 proof (klasa histologiczna)UTMB apteka
Barierowe końcówki do pipet bez RNazFisher Scientific2123635, 212364, 212361, 21-236-2A
System mikrodysekcji laserowej Arcturus (Life Technologies)
Mikrodysekcja laserowa Zeiss Rodzina PALM
Leica Microsystems

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
  2. Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
  3. Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  4. Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
  5. Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
  6. Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
  7. Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
  8. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
  9. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063(2011).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).
  11. Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
  12. Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
  13. Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311(2011).
  14. Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
  15. Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98(2011).
  16. Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  17. Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
  18. Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
  19. Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
  20. Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
  21. Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neurony hipokampabarwienie fluoro jadePCR w czasie rzeczywistymmikromacierze ca ego genomuci cie w kriotomaciezatapianie w OCT

Powiązane artykuły