Artykuł metodologiczny

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/50310

⸱

4 kwietnia 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki mogą wyczuwać i migrować w kierunku wyższych stężeń adhezyjnych sygnałów, takich jak glikoproteiny macierzy zewnątrzkomórkowej i rozpuszczalnych sygnałów, takich jak czynniki wzrostu. W tym miejscu przedstawiamy metodę tworzenia przeciwstawnych gradientów adhezyjnych i rozpuszczalnych wskazówek w komorze mikroprzepływowej, która jest kompatybilna z obrazowaniem żywych komórek. Kopolimer poli-L-lizyny i glikolu polietylenowego (PLL-PEG) jest stosowany do pasywacji szklanych szkiełek nakrywkowych i zapobiegania niespecyficznej adsorpcji biomolekuł i komórek. Następnie druk mikrokontaktowy lub litografia zanurzeniowa są wykorzystywane do tworzenia śladów streptawidyny na pasywowanych powierzchniach, które służą jako punkty zakotwiczenia dla biotynylowanego peptydu kwasu argininowo-glicynowo-asparaginowego (RGD) jako wskazówki adhezyjnej. Urządzenie mikroprzepływowe umieszcza się na zmodyfikowanej powierzchni i wykorzystuje do tworzenia gradientu wskazówek adhezyjnych (100% RGD do 0% RGD) na ścieżkach streptawidyny. Wreszcie, to samo urządzenie mikroprzepływowe jest używane do tworzenia gradientu chemoatraktantu, takiego jak płodowa surowica bydlęca (FBS), jako rozpuszczalna wskazówka w przeciwnym kierunku niż gradient adhezyjnych wskazówek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukierunkowana migracja komórek jest podstawową właściwością wielu komórek i jest kluczowym aspektem wielu normalnych procesów fizjologicznych, w tym rozwoju embrionalnego, obrony przed infekcją i gojenia się ran. Ponadto migracja komórek odgrywa również znaczącą rolę w wielu chorobach, takich jak choroby naczyniowe, przerzuty do komórek nowotworowych i przewlekłe stany zapalne1,2. Podczas gdy klasyczne stany migracji komórek - polaryzacja, wydłużenie wypukłości, tworzenie adhezji, generowanie siły i wycofanie tylne - są ogólnie akceptowane3,4 , wyjaśnienie mechanizmów czasoprzestrzennych, za pomocą których koordynowana jest integracja sygnału, było trudniejsze.

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) służy jako substrat do adhezji komórek, a dzięki wrodzonej różnorodności chemicznej5 i fizycznej6, dostarcza wskazówek kierunkowych dla nawigacji komórkowej7,8. Oprócz tych adhezyjnychwskazówek 9, rozpuszczalne czynniki10-12, takie jak chemokiny i czynniki wzrostu, mogą indukować ukierunkowaną migrację komórek przez receptory chemoatraktantu i ich dalszą sygnalizację motogenną. Obecnie nie wiadomo, czy zaangażowanie i sygnalizacja poprzez receptory adhezyjne (tj. integryny) czy receptory chemoatraktantowe, takie jak receptorowa kinaza tyrozynowa (RTK), są dominujące. Nie wiadomo też, czy hierarchie systemów receptorowych są specyficzne dla typu komórki.

Mikroskopia żywych komórek dostarcza bogactwa informacji, które nie są dostępne w masowych testach i mogą być łączone z urządzeniami mikroprzepływowymi w celu generowania gradientów unieruchomionych 13,14 i rozpuszczalnych wskazówek15 16. Opisana tutaj metoda wykorzystuje szereg prostych i uznanych kroków modyfikacji powierzchni w połączeniu z dostępną na rynku komorą mikroprzepływową w celu stworzenia testu obrazowania migracji komórek, który można łatwo wdrożyć w laboratorium biologii komórki (ryc. 1). Zmontowane urządzenie mikroprzepływowe ma właściwości optyczne porównywalne ze szkłem17, a gradienty dyfuzyjnych cząsteczek są stabilne przez co najmniej 16 godzin. System może być stosowany do epifluorescencji i zaawansowanych technik mikroskopowych. W przeciwieństwie do innych konfiguracji chemotaksji18, ten system nadaje się do nagrywania wolno migrujących, przylegających komórek. Co ważne, system jest modułowy i w łatwy sposób pozwala na wprowadzenie alternatywnych adhezyjnych lub rozpuszczalnych sygnałów migracji oraz badanie różnych typów komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pasywacja szkiełek nakrywkowych za pomocą PLL-PEG-biotyny

Ten krok ma na celu pasywację powierzchni, tak aby komórki przylegały i migrowały do określonych obszarów na szkiełku nakrywkowym, które są tworzone za pomocą druku mikrokontraktowego (Krok 2-3a) lub litografii piórkiem (Krok 3b). Do pasywacji stosuje się kopolimer poli-L-lizyny (PLL) i glikolu polietylenowego (PEG), w którym 20% cząsteczek PEG jest szczepionych biotyną (PLL-PEG-biotyna).

  1. Aby wyczyścić szkiełka nakrywkowe (18 mm x 18 mm), zanurz je w stojaku w 100% etanolu i umieść ruszt w kąpieli dźwiękowej na 30 minut. Wysusz szklane szkiełka nakrywkowe na powietrzu lub pod strumieniem azotu.
  2. Następnie sonikować szklane szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w 1 M NaOH. Następnie spłucz szklane powierzchnie, ostrożnie zanurzając ruszt w zlewce wypełnionej 1,5 L Milli-Q H2O. Powtórz proces płukania trzy razy, używając za każdym razem świeżego Milli-Q H2O. Szkiełka nakrywkowe wysuszyć w suszarce w temperaturze 60 °C.
  3. Umieść połowę czystych szklanych szkiełek nakrywkowych pojedynczo w wilgotnej komorze, która jest wykonana z 24-dołkowej płytki częściowo wypełnionejH2O. Na każde szklane szkiełko nakrywkowe wrzuć 15 μl PLL-PEG-biotyny (1 mg/ml) w PBS. Weź drugą połowę pozostałych czystych szklanych szkiełek nakrywkowych i ostrożnie ułóż warstwę z roztworem PEG. Pozostaw szkiełka nakrywkowe na 1 godzinę w wilgotnej komorze. Delikatnie odsuń szkiełka nakrywkowe od siebie, nie zdrapując powierzchni pokrytej PEG, a następnie spłucz je środkiem Milli-Q H2O. Woda powinna łatwo zsuwać się po stronie pokrytej PEG. W razie potrzeby wysusz szklane szkiełka nakrywkowe na ręczniku papierowym tak, aby obrabiana powierzchnia była skierowana do góry. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w eksykatorze próżniowym do czasu dalszego użycia.

2. Produkcja stempli do druku mikrokontaktowego

Opisujemy dwa procesy wzorowania ścieżek streptawidyny na pasywowanych szklanych szkiełkach nakrywkowych. Pierwsza, druk mikrokontaktowy, zazwyczaj wymaga wytworzenia wzorca krzemowego, z którego odlewany jest stempel PDMS. W naszym przypadku wzór na stemplu PDMS to linie o szerokości 100 μm, które są rozmieszczone w odstępach 290 μm od środka do środka z wysokością elementu 25 μm. Poniżej opisujemy pokrótce, jak wytworzyć odpowiedni master krzemowy (Krok 2.1-2.3) i stempel PDMS (Krok 2.4). Istnieje jednak wiele protokołów drukowania mikrokontaktowego opisanych w literaturze19-23, które są odpowiednie do drukowania wzorów białkowych na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Mistrzowie mogą być również wykonywani na zamówienie i kupowani ze źródeł komercyjnych.

  1. Najpierw oczyść płytkę krzemową (o średnicy 4 cali), inkubując ją w roztworze piranii (3:1 v:v kwasu siarkowego i 30% nadtlenku wodoru) przez 20 minut. Dokładnie opłucz wafel 10 razy za pomocą MilliQ H2O. Wysusz wafel w piekarniku w temperaturze 150 °C O/N.
  2. Opłucz czystą i wysuszoną płytkę silikonową 100% acetonem, a następnie 100% alkoholem izopropylowym. Następnie nałóż 2 ml fotorezystu GM1070 SU-8 (Gersteltec Sarl) na płytkę z prędkością 3 100 obr./min przez 40 sekund, aby utworzyć warstwę o grubości 25 μm. Próbkę piecze się następnie na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie przez kolejne 5 minut w temperaturze 95 °C.
  3. Wystawić fotorezystor SU-8 na działanie promieniowania UV przez 60 sekund pod fotomaską z pożądanym wzorem (na przykład za pomocą nakładki do maski Quintel Q6000) i powtórzyć proces pieczenia opisany w ppkt 2.2. Następnie próbka jest wywoływana poprzez zanurzenie płytki w wywoływaczu SU-8 (Gersteltec Sarl) na 4 minuty, płukanie w 100% alkoholu izopropylowym i suszenie pod przepływem azotu. Obszar fotorezystu SU-8, który nie był wystawiony na działanie światła UV, jest w ten sposób usuwany, tworząc odwrotny wzór stempla PDMS.
  4. Następnym krokiem jest odlanie stempla PDMS z wzorca krzemowego. Najpierw dokładnie wymieszaj 1 część (w/w) utwardzacza z 10 częściami prepolimeru elastomerowego (Sylgard 184). Aby usunąć pęcherzyki powietrza, należy odgazować mieszaninę w eksykatorze podłączonym do przewodu próżniowego na 1 godzinę. Następnie wylać elastomer PDMS na wzorzec silikonowy wewnątrz szalki Petriego na wysokość około 1 cm i utwardzić mieszaninę wzorca i PDMS w piecu w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę. Na koniec stempel PDMS jest usuwany z wzorca krzemowego i przycinany do odpowiedniego rozmiaru.

3. Wzorowanie streptawidyny lub adhezyjnych wskazówek na pasywowanych szkiełkach nakrywkowych

Po pasywacji szklanych szkiełek nakrywkowych, wzory białek są drukowane za pomocą druku mikrokontaktowego (Krok 3a) lub litografii metodą dip-pen (Krok 3b). W naszym przypadku streptawidyna jest drukowana jako linie, które stanowią podstawę gradientów RGD (krok 4). Ta sama procedura może być również stosowana do drukowania białek macierzy w celu tworzenia wzorów adhezyjnych.

Alternatywną metodą dla druku mikrokontaktowego do modelowania biomolekuł na powierzchniach jest litografia piórem zanurzeniowym. W litografii zanurzeniowej wspornik służy do przenoszenia niewielkiej objętości roztworu na powierzchnię. Wielkość wsporników, lepkość roztworu, czas kontaktu wspornika z powierzchnią, hydrofobowość powierzchni i wilgotność w komorze drukowania decydują o wielkości drukowanych elementów. Zaletą tej metody jest to, że dla każdego eksperymentu można wydrukować różne wzory, ponieważ nie ma potrzeby wytwarzania wzorców i stempli. Wadą jest to, że wydrukowanie danego wzoru zajmuje więcej czasu, a litografia zanurzeniowa wymaga specjalistycznego instrumentu, który może nie być dostępny w wielu laboratoriach. Przyrząd do litografii piórem, którego użyliśmy, to NanoeNabler firmy Bioforce Nanoscience. Tutaj wydrukowaliśmy małe kropki o średnicy <10 μm, do których użyliśmy wsporników SPT10.

3a. Technika druku mikrokontaktowego (μCP)

  1. Aby wyczyścić stempel PDMS i uczynić go bardziej hydrofilowym, należy poddać wzorzystą stronę stempli PDMS działaniu promieniowania UV i ozonu (na przykład UV Ozone Procleaner firmy Bioforce Nanoscience) przez 1,5 godziny. Alternatywnie, użyj środka do czyszczenia plazmowego przez krótszy czas w tym samym celu. W procesie tym powstaje utleniona powierzchnia PDMS24, która usprawnia proces drukowania.
  2. Natychmiast po poddaniu działaniu ozonu lub osocza należy umieścić i rozprowadzić 10 μl streptawidyny (1 mg/ml w PBS) na stemplach PDMS i pozostawić na 1 godzinę w wilgotnej komorze (takiej jak częściowo wypełniona płytka 6-dołkowa, patrz krok 1.3). Jeśli ślady powinny być widoczne pod mikroskopem fluorescencyjnym, należy użyć streptawidyny, która jest sprzężona z fluoroforem, takim jak streptawidyna-AlexaFluor350.
  3. Usuń nadmiar streptawidyny ze stempla za pomocą bibuły i wysusz stempel na powietrzu przez około 1 minutę. Lekko dociśnij stempel do szkiełka nakrywkowego pokrytego PLL-PEG-biotyną.
  4. Jeśli w kroku 3.a2 użyto fluorescencyjnej streptawidyny, zbadaj wzór pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Przechowuj zadrukowane powierzchnie w eksykatorze.

3b. Litografia metodą zanurzania pióra

  1. Najpierw zmieszać 1 część 1 mg/ml streptawidyny lub streptawidyny-AlexaFluor350 z 10 częściami glicerolu (v/v) i załadować 5 μl mieszaniny na wspornik. Następnie rozpocznij proces drukowania zgodnie z opisem w instrukcji obsługi przyrządu do litografii z użyciem pióra zanurzeniowego. Aby zmniejszyć rozmiar plamki do około 5 μm, dostosuj prędkość drukowania, czas kontaktu wspornika z powierzchnią lub pionową odległość wspornika od powierzchni. W przykładzie pokazanym na rysunku 2c kropki zostały wydrukowane w linii z separacją rzędów i kolumn ustawioną na 10-15 μm. Odległość ta jest wystarczająca, aby zapobiec łączeniu się punktów ze sobą, ale umożliwia oglądanie wielu punktów w jednym polu widzenia przy większości ustawień mikroskopu.
  2. Przechowuj zadrukowane powierzchnie w eksykatorze.

4. Tworzenie gradientów adhezyjnych na powierzchniach ze wzorem streptawidyny

Tworzymy gradienty kleju biotyny-RGD na szklanych szkiełkach nakrywkowych, które są pokryte streptawidyną (Rysunek 3) lub zawierają wzory streptawidyny na pasywowanych szkiełkach nakrywkowych (Rysunek 5). Aby stworzyć gradient powierzchni, użyliśmy dostępnego na rynku urządzenia mikroprzepływowego (o nazwie sticky-Slide Chemotaxis 3D firmy Ibidi), które tworzy stabilny gradient roztworu poprzez dyfuzję pasywną. Aby konkurować o miejsca wiązania streptawidyny, zastosowaliśmy dwa przeciwstawne gradienty biotyny-RGD i biotyny, która nie była sprzężona z RGD (patrz ryc. 1).

  1. Przyklej szkiełka nakrywkowe pokryte streptawidyną lub wzorzyste szkiełka nakrywkowe do lepkiej strony urządzenia Sticky-Slide Chemotaxis 3D. Aby zapewnić, że nie ma wycieku przez kilka godzin, krawędzie urządzenia uszczelnia się cienką warstwą podgrzanej wazeliny oraz drugą warstwą mieszaniny 1 części wazeliny na 1 część wosku parafinowego (w/w).
  2. Napełnij kanał urządzenia 6 μl PBS w kanale. Następnie napełnij oba zbiorniki odpowiednio 70 μl 0,03 μg/μl biotyny-4-fluoresceiny w PBS i 70 μl 0,03 μg/μl biotyny-RGD w PBS. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.
  3. Usuń roztwory biotyny i ostrożnie spłucz powierzchnię, będąc nadal podłączoną do urządzenia mikroprzepływowego, dwukrotnie za pomocą PBS. Zaznacz kierunek gradientu kleju i w razie potrzeby przechowuj urządzenie napełnione PBS w temperaturze 4 °C, ale upewnij się, że urządzenie nie wyschnie. W razie potrzeby przeanalizować gradient kleju za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

5. Znakowanie komórek za pomocą fluoroforów do obrazowania żywych komórek

Komórki są oznaczone barwnikami fluorescencyjnymi, które pomagają śledzić komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Typowymi sondami są fluorescencyjne markery organelli, takie jak Syto 64 Red, które oznaczają jądro komórkowe. W tym celu komórki są najpierw trzykrotnie przemywane PBS, następnie inkubowane z 1 μM Syto 64 Red w pożywkach hodowlanych przez 45 minut, a na koniec przemywane kolejne trzy razy PBS. Należy pamiętać, że komórki nie powinny być przechowywane w PBS przez długi czas.

Alternatywnymi barwnikami do śledzenia komórek są serie CellTracker, które barwią cytoplazmę i są zatrzymywane podczas migracji i podziału komórek. Transfekcja komórek za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego jest szczególnie przydatna do rejestrowania subkomórkowej dystrybucji białka będącego przedmiotem zainteresowania podczas migracji. Jednak białka fluorescencyjne zazwyczaj wybielają się szybciej niż barwniki organiczne, więc długoterminowe obserwacje mogą nie być możliwe.

6. Wczytywanie komórek z rozpuszczalnym gradientem do urządzenia mikroprzepływowego

  1. Policz fluorescencyjnie znakowane komórki i podziel na dwie probówki o równej liczbie komórek. Umyj i ponownie zamieszaj jedną probówkę komórek z pożywką zawierającą chemoatraktant, taką jak Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o niskim poziomie glukozy z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Umyj i ponownie wymieszaj drugą probówkę komórek w pożywce bez chemoatraktantu, tj. DMEM z 0% FBS. Końcowe stężenie komórek w każdej probówce powinno wynosić 5 x 105 komórek/ml.
  2. Usuń wszystkie roztwory z urządzenia mikroprzepływowego (z kroku 4.3) i umieść je na stoliku mikroskopu (patrz krok 7). Załaduj 70 μl komórek (5 x 105 komórek/ml w 0% FBS DMEM) do jednego zbiornika i 70 μl komórek HeLa (5 x 105 komórek/ml w 10% FBS DMEM) do drugiego. Luźno umieść taśmę na zbiornikach, aby uniknąć parowania. Jeśli komórki na powierzchni są wstępnie inkubowane przed obrazowaniem, zaleca się, aby komórki zostały załadowane do urządzenia w pożywce wzrostowej bez gradientu. Urządzenie jest następnie umieszczane na stoliku mikroskopowym, a media zastępowane są mediami gradientowymi, tj. DMEM bez FBS w jednym zbiorniku i DMEM z 10% FBS w drugim.

7. Obrazowanie komórek na żywo i analiza danych

  1. Włącz mikroskop (Nikon Ti-E) i rozgrzej stage co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Upewnij się, że kanał urządzenia mikroprzepływowego znajduje się w polu viewa a komórki są ostre. Wybierz parametry akwizycji obrazu, takie jak czasy naświetlania i filtry fluorescencyjne, sekwencja obrazu jasnego pola i fluorescencja, która rejestruje komórki i ścieżki, a także punkty czasowe i długość nagrania (np. co 15 minut przez 16 godzin).
  3. Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak ImageJ Manual Tracking lub Ibidi Chemotaxis and Migration Tool.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć, w jaki sposób komórka integruje sygnały migracyjne25, opracowaliśmy metodę obrazowania komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, które migrują w środowisku o konkurencyjnych gradientach adhezyjnych i rozpuszczalnych (Rysunek 1). Ścieżki adhezyjne, które zawierały fluorescencyjną streptawidynę i biotynylowany RGD, stworzono za pomocą mikrokontaktowych drukowanych ścieżek i litografii długopisem zanurzeniowym (ryc. 2). O udanym drukowaniu mikrokontaktowym św...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole użyliśmy dostępnego na rynku urządzenia mikroprzepływowego (sticky-Slide Chemotaxis 3D firmy Ibidi) do zbadania wpływu chemicznie modyfikowanych powierzchni i gradientów chemoatraktantu na migrację komórek. Ten układ mikroprzepływowy nie wymaga przepływu, ponieważ gradient jest ustalany przez dyfuzję wzdłuż kanału. Jest to ważne, ponieważ przepływ może w różny sposób wpływać na wolno migrujące komórki, takie jak fibroblasty, które tworzą stabilne zrosty ogniskowe, i szybko migrujące komórki, ta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy żadnych interesów komercyjnych do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za finansowanie ze strony Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych oraz Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii, a także dziękują Australian National Fabrication Facility za mistrza SU-8 za druk mikrokontaktowy. SHN jest wspierany przez Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego Malezji i Universiti Sains Malaysia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestawy do barwienia szkła nakrywkowegoThomas Scientific8542 E40Stojak na szkiełka nakrywkowe
Spoiwo do piekarnikaSeriaED 53
Wafel krzemowySilicon Quest708-007Domieszkowany borem < 100> Wafel, średnica 4", 500 μ m, jednostronnie polerowany
GM1070 SU-8 fotorezystorGersteltec Sarl
SU-8 wywoływaczGersteltec Sarl
Sylgard 184 utwardzaczDow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolimerDow Corning
PLL-PEG-biotyna (20%)SuSos AGPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotyna (20%)1 mg/ ml w PBS
FluoresceinSigma469551 mM w PBS
Streptavidin-AlexaFluor350InvitrogenS-112491 mg/ml w PBS
Biotyna-4-fluoresceinaInvitrogenB-13700,03 μ g/μ l w PBS
Biotin-RGDGenScriptSC12080,03 mg/ml w PBS
Syto 64 RedInvitrogenS-113461 μ M w PBS
Lepkie szkiełko chemotaksja 3DIbidi80328
200 μ l Greiner żółta fazowana końcówkaGreiner Bio-One739261
WazelinaSigma16415
Wosk parafinowy, mp 55-57 ° CSigma327204
Nano eNabler 10 μ m cantilever BioForceSPT-S-C-10s
Image J oprogramowanieNational Institute of Healthrsbweb.nih.gov/ij/download.html
Wtyczka do śledzenia ręcznegoFabrice Cordeliè resrsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration ToolIbidi GmbHwww.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106(2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128(2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271(2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255(2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412(2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Adhesive GradientSoluble GradientMicrofluidic ChamberPLL PEG PassivationMicrocontact PrintingDip Pen LithographyStreptavidin PatterningBiotinylated RGDFBS GradientLive Cell Imaging

Powiązane artykuły