Artykuł metodologiczny

Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

DOI:

10.3791/50311

⸱

21 sierpnia 2013

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Wells Center for Pediatric Research, IU Simon Cancer Center, Indiana University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karcynogeneza to proces obejmujący interakcje między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem nowotworu. Aby przeanalizować zdarzenia molekularne, należy wyizolować różne populacje komórek na różnych etapach rozwoju raka. Korzystając z mysiego modelu raka podstawnokomórkowego, opisujemy protokół analizy komórek podczas kancerogenezy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój raka to wieloetapowy proces obejmujący wiele typów komórek, w tym komórki prekursorowe raka, komórki odpornościowe, fibroblasty i komórki śródbłonka. Każdy typ komórek ulega zmianom sygnalizacyjnym i funkcjonalnym podczas kancerogenezy. Obecnym wyzwaniem dla wielu badaczy nowotworów jest przeanalizowanie tych zmian w każdym typie komórek podczas wieloetapowego procesu in vivo. W ciągu ostatnich kilku lat autorzy opracowali zestaw procedur izolowania różnych populacji komórek podczas rozwoju raka skóry przy użyciu myszy K14creER/R26-SmoM2YFP. Procedura podzielona jest na 6 części: 1) wygenerowanie odpowiednich myszy do badania (myszy K14creER+ i R26-SmoM2YFP+ w tym protokole); 2) indukowanie ekspresji SmoM2YFP w skórze myszy; 3) przygotowanie biopsji skóry myszy; 4) izolowanie naskórka od skóry; 5) przygotowanie pojedynczych komórek z naskórka; 6) znakowanie pojedynczych populacji komórek do analizy cytometrii przepływowej. Wygenerowanie wystarczającej liczby myszy o odpowiednim genotypie jest krokiem granicznym w tym protokole, który może potrwać do dwóch miesięcy. Reszta kroków trwa od kilku godzin do kilku dni. W tym protokole znajduje się również sekcja dotycząca rozwiązywania problemów. Chociaż skupiamy się na raku skóry, protokół ten może zostać zmodyfikowany tak, aby miał zastosowanie do innych zwierzęcych modeli chorób ludzkich.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako najczęstszy rodzaj ludzkiego nowotworu, rak podstawnokomórkowy (BCC) dotyka około 2 milionów Amerykanów rocznie 1. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że nieprawidłowa aktywacja sygnalizacji hedgehog (Hh) jest siłą napędową leżącą u podstaw rozwoju BCC (przegląd w 2,3). Zmiany sygnalizacji Hh w BCC obejmują inaktywujące mutacje PTCH1 4-6, mutacje wzmocnienia funkcji SMO 7-9 i nieprawidłową ekspresję czynników transkrypcyjnych szlaku Hh GLI1 10 i GLI2 11 lub rzadkie inaktywowane mutacje negatywnego regulatora Su (Fu) 12. Dzięki tym wszystkim i innym badaniom Federalna Agencja ds. Leków (FDA) zatwierdziła niedawno stosowanie inhibitora sygnalizacji Hh Wismodegibu w leczeniu przerzutowych i miejscowo zaawansowanych BCC13-15.

Pomimo tych wszystkich osiągnięć 16, nadal nie rozumiemy molekularnych i komórkowych mechanizmów, za pomocą których sygnalizacja Hh napędza kancerogenezę. Tworzenie modeli zwierzęcych przy użyciu specyficznej tkankowo aktywacji sygnalizacji Hh jest nadal ważne dla tych badań i dla naszego zrozumienia oporności na leki. U myszy typu dzikiego nie rozwijają BCC, nawet pod wpływem dużych dawek czynników rakotwórczych, promieniowania UV lub jonizującego. Natomiast myszy Ptch1 +/- są podatne na rozwój BCC 17,18. Penetracja rozwoju BCC u myszy Ptch1 +/- wynosi ponad 50% 18,19, chociaż myszy Ptch1 + / - rzadko rozwijają w pełni rozwinięte BCC, jeśli są trzymane w normalnych warunkach. Ze względu na śmiertelność embrionalną Ptch1-/-, w badaniu zwykle stosuje się specyficzny tkankowo nokaut PTCH1 20. Ponadto, warunkowa, specyficzna dla skóry ekspresja onkogennego SmoM2YFP (Krt14-creER:R26-SmoM2YFP lub Krt14-cre:R26-SmoM2YFP) prowadzi do powstawania wielu mikroskopijnych BCC w bardzo młodym wieku, zapewniając łatwy test genetyczny na sygnalizację Hh za SMO 21.

Są trzy główne problemy w naszej wiedzy na temat biologii BCC. Po pierwsze, komórkowe pochodzenie BCC nie jest do końca jasne. Podczas gdy niektóre badania potwierdzają pączek mieszków włosowych jako miejsce komórek macierzystych 22-24, Youssef i in. 25 zlokalizowali mysią komórkę pochodzenia nowotworów skórnych wywołanych przez Hh w obszarze naskórka między mieszkami włosowymi, a nie w mieszku włosowym, używając specyficznego dla komórki Cre do aktywacji ekspresji transgenicznego mutanta SMO napędzanego przez ROSA26. Po drugie, interakcje komórkowe podczas rozwoju raka podstawnokomórkowego nie są dobrze poznane. Wiadomo, że keratynocyty z aktywowaną sygnalizacją Hh mogą prowadzić do powstawania BCC, ale inne zmiany komórkowe nie są dobrze poznane. Ponadto leczenie antagonistami Smo u myszy może prowadzić do oporności na leki 26-28. W związku z tym bardzo potrzebne są nowe cele dla BCC. Zrozumienie tych trzech zagadnień wymaga analizy zmian komórkowych u myszy podczas kancerogenezy. Chociaż opublikowano kilka metod hodowli keratynocytów, cytometrii przepływowej i izolacji komórek macierzystych skóry 29-31, obecnie nie ma kompleksowych procedur analizy komórek w mysich BCC. Łącząc metody mysiego modelu BCC, separacji naskórka, generowania pojedynczych komórek z tkanek i analiz komórkowych, dostarczymy czytelnikom zestaw procedur do badania sygnalizacji komórkowej, interakcji komórkowych i molekularnych podczas rozwoju BCC. Wierzymy, że ten protokół pozwoli czytelnikom zobaczyć, jak przebiega każda procedura. Ponadto przedstawiliśmy kilka danych, aby zilustrować, jak powinny wyglądać wyniki, oraz rozwiązywanie problemów, aby pomóc czytelnikom przezwyciężyć trudności podczas wykonywania tych procedur.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet IACUC w Indiana University School of Medicine.

1. Generuj myszy z prawidłowymi genotypami

  1. Ustal mysi model BCC. Połącz myszy K14-CreER (numer zapasów laboratorium Jacksona 005107) z myszami R26-SmoM2YFP (numer zapasów laboratorium Jackson 005130) (18) w celu wygenerowania myszy K14-creER+ i R26-SmoM2YFP+.
  2. Wykonaj genotypowanie. Zanurzyć próbki ogonów (o długości 0,5 cm) w roztworze do lizy ogona metodą directPCR z 1 mg/ml proteinazy K w temperaturze 55 °C przez noc z wytrząsaniem. Następnego dnia usuń resztki tkanek przez odwirowanie z maksymalną prędkością w mikrowirówce (aby zachować supernatant do genotypowania). Użyć 1 μl supernatantu do każdej reakcji PCR ze starterami i warunkami zalecanymi przez dostawcę. Wybierz myszy z odpowiednimi genotypami (w wieku 3-6 tygodni buprenorfina w dawce 0,05-0,1 mg/kg będzie podawana przez SQ co 8-12 godzin przez 2-3 dni po wycięciu ogona) dla kroku 2.

2. Indukuj ekspresję SmoM2 w keratynocytach skóry

Indukuj ekspresję SmoM2 w keratynocytach poprzez doustne podawanie tamoksyfenu (5 μg/kg masy ciała w 50 ml oleju roślinnego w każdym karmieniu) przez 5 kolejnych dni przez doustny zgłębnik z igłą do karmienia (zakrzywiona 20 gauge).

3. Przygotowanie próbek skóry

Ogólnie, fenotypy są bardziej dotkliwe dla ucha i ogona u myszy K14creER/R26SmoM2GFP. Aby przygotować się do analiz komórkowych, najpierw pobieramy skórę myszy po uśmierceniu zwierzęcia za pomocą zatwierdzonej przez instytucję procedury (CO2 plus zwichnięcie szyjki macicy).

4. Izolacja naskórka

  1. Po uśmierceniu myszy za pomocą zatwierdzonej procedury (patrz krok 3), usuń sierść za pomocą trymera. Zanurzyć próbki skóry w roztworze dyspazy (5 mg/ml w DMEM z 10% FBS) w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny (1 godzina dla myszy w wieku poniżej 8 tygodni i 2 godziny dla myszy w wieku poniżej 8 tygodni).
  2. Po leczeniu dispazy należy oddzielić naskórek od skóry właściwej za pomocą kleszczy.

5. Generuj pojedyncze komórki

  1. Aby uzyskać populację pojedynczych komórek, zmiel naskórek nożyczkami, a następnie zanurz w roztworze kolagenazy dożylnej (1 mg / ml w DMEM z 10% FBS) na 1-2 godziny w temperaturze 37 °C w probówce o pojemności 50 ml. Staraj się delikatnie obracać rurki co 20 minut, aby pomóc w dysocjacji komórek.
  2. Sprawdź dysocjację komórek pod mikroskopem. Gdy pojedyncze komórki można wykryć w pożywce kolagenazy, należy inkubować próbkę przez dodatkowe 30 minut, aby zwiększyć wydajność komórek. Ogólnie rzecz biorąc, naskórek jednej myszy może dać do 107 komórek.
  3. Przefiltrować mieszaninę tkanek przez sitko komórkowe (wielkość porów 70 μm), odwirować komórki z prędkością 1,500 obr./min za pomocą wirowania na stole i przemyć raz PBS.

6. Oznaczanie komórek i wykonywanie analiz cytometrii przepływowej

  1. Ponownie zawiesić komórki w 10% FBS w PBS przy 2,5 x 106 komórek/ml, aby zablokować niespecyficzne wiązanie (na lodzie przez 30 min)
  2. Pobrać porcję komórek do każdej z mikroprobówek o pojemności 1,5 ml w celu znakowania przeciwciał. Dodać różne przeciwciała do każdej probówki w końcowym stężeniu 2 μg/ml. Mieszać przeciwciała z komórkami przez delikatny wierzchołek przez kilka sekund i pozostawić je na lodzie na 30 minut, a następnie przemyć 1 ml PBS. W przypadku próbek BCC użyliśmy przeciwciał dla następujących biomarkerów: CD11b-PE plus Gr1-APC (komórki szpikowe lub komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego); wimentyna-FITC (fibroblast) (szczegółowe informacje można znaleźć w odczynnikach).
  3. Do barwienia wewnątrzkomórkowego używamy zestawu i postępujemy zgodnie z instrukcją dostawcy (szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Odczynniki). Używamy świeżych komórek do analizy markerów powierzchniowych komórek. Po wybarwieniu markerem powierzchniowym umyj komórki i ponownie zawieś je w PBS. Dodać DAPI do mieszaniny komórek w końcowym stężeniu 1 μg/ml. DAPI wybarwi martwe komórki, które zostaną wykluczone z dalszych analiz.
  4. Analizuj dane za pomocą specjalnego oprogramowania. Najpierw wybieramy pojedyncze komórki na podstawie wykresu FSC vs. SSC i używamy ujemnej populacji DAPI (żywych komórek) do dalszej analizy.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że u myszy nie rozwijają się raki podstawnokomórkowe, chyba że po aktywacji sygnalizacji Hh. Rycina 1 przedstawia fenotyp skóry po indukowanej ekspresji onkogennego wygładzonego SmoM2YFP. Rycina 2 przedstawia analizę komórek szpikowych u myszy normalnych i z nowotworem. Komórki CD11b + Gr1 + pochodzą z komórek szpikowych, a niektóre z nich to komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego. W normalnej sytuacji populacja komórek CD11b + Gr1 + jest ledwo wykrywalna, ale wzrośnie w odpowiedzi na stan zapalny lub rozwój guza. Wykazaliśmy, że indukowana ekspresja SmoM2YFP w skórze powoduje wzrost komórek CD11b + Gr1 +. Obecnie mechanizmy molekularne leżące u podstaw tej zmiany w BCC nie są jasne.

figure-results-1
Rysunek 1. Zmiany morfologiczne po indukcji SmoM2YFP w skórze myszy. Na górze znajduje się diagram genotypów myszy. Środkowy panel: mysz K14creER+ i R26-SmoM2YFP+ leczona tamoksyfenem wykazała rażące nieprawidłowości w skórze (po prawej), a także guzy skóry w sekcji H&E (po lewej). Dolny panel: mysz bez indukcji SmoM2YFP wykazywała normalnie wyglądającą skórę (po prawej) i brak nieprawidłowej morfologii w sekcji H&E (po lewej).

figure-results-2
Rysunek 2. Analiza przepływu komórek CD11b+Gr1+. Aby zbadać zmianę komórek CD11b + Gr1 + podczas rozwoju raka skóry, wyizolowaliśmy pojedyncze komórki i wybarwiliśmy przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie przeciwko CD11b i Gr1. Po analizie za pomocą FlowJo zauważyliśmy wzrost tej populacji komórek w tkankach skóry myszy leczonych tamoksyfenem.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy metodę analizy populacji komórek w BCC. Tkanki nowotworowe są spójne dla wielu typów komórek, a każdy typ komórek zachowuje się inaczej w danym momencie kancerogenezy, co jest bardzo trudne do odtworzenia nawet w najlepszych warunkach in vitro . Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że rozwojowi raka podstawnokomórkowego towarzyszy ekspansja komórek macierzystych naskórka, a także rekrutacja komórek szpikowych. W porównaniu z analizami immunohistochemicznymi lub immunofluorescencyjnymi, analizy populacji komórek dają bardziej ilościową ocenę zmian populacji komórek, ponieważ obecnie dostępne są specyficzne przeciwciała przeciwko różnym typom komórek.

W przypadku tego protokołu potrzeba 10 tygodni na ukończenie badania, ponieważ zmiana fenotypowa spowodowana indukcją genów wymaga czasu. Dlatego ważne jest, aby zaplanować eksperyment z wyprzedzeniem. Do izolacji komórek i analiz mogą być potrzebne całe dwa dni. Ponieważ do analiz używa się żywych komórek, ważne jest, aby zarezerwować FACSCalibur z wyprzedzeniem. Wymieniliśmy również typowe problemy podczas pracy z tym protokołem (patrz poniżej).

Z naszego doświadczenia wynika, że poniżej znajdują się typowe problemy, które napotkaliśmy:

  1. Słabe oddzielanie się naskórka: Może to być spowodowane niepełnym leczeniem dypazą (należy wydłużyć czas leczenia diapazą) lub niewystarczającą ilością roztworu dypazy (skóra musi być całkowicie zanurzona w roztworze dypazy). Na jedną mysz używamy co najmniej 5 ml roztworu dispazy. Objętość może się różnić w zależności od wielkości skóry.
  2. Niska wydajność liczby komórek: Może to być spowodowane niepełnym trawieniem kolagenazą IV. Najpierw sprawdź stężenie kolagenazy lub datę ważności. Może to być również spowodowane niewystarczającą ilością użytego naskórka. Ponadto trawienie enzymatyczne powinno odbywać się w temperaturze do 37 °C z wytrząsaniem (przed przystąpieniem do mineralizacji należy dostosować temperaturę).
  3. Zbrylenia komórek: Jest to bardzo powszechne w przypadku komórek skóry (pipeta komórek kilka razy po przejściu przez sitko (przed wirowaniem) lub obecność Mg2+ i Ca2+ w roztworze (należy użyć PBS wolnego od Mg2+ i Ca2+ do płukania komórek).
  4. Zbyt wiele martwych komórek: Może to być wynikiem degradacji tkanek (należy używać świeżych tkanek) lub nadmiernego trawienia (unikać długotrwałej inkubacji z dypazą i kolagenazą IV).

Protokół ten można połączyć z przeszczepem szpiku kostnego lub przeszczepem tkanek w celu zbadania pochodzenia komórek. Na przykład przeszczepienie komórek szpiku kostnego wykazujących ekspresję GFP śmiertelnie napromieniowanym myszom pozwoli nam zbadać udział komórek szpiku kostnego w fibroblastach i komórkach szpikowych związanych z nowotworem. Podobnie, guzy skóry można przeszczepić do nowego gospodarza myszy w celu zbadania interakcji guz-gospodarz.

Oprócz badania zmian populacji komórek podczas kancerogenezy, protokół ten pozwoli również naukowcom na zbadanie wpływu leczenia farmakologicznego na komórki w środowisku guza. Chociaż protokół ten jest przeznaczony do wykorzystania do analiz populacji komórek podczas kancerogenezy skóry, w przypadku innych typów raka można wprowadzić niewielkie modyfikacje.

Podsumowując, analizy populacji komórek w mysich modelach raka skóry mogą dostarczyć nam informacji na temat dynamicznych zmian komórkowych podczas kancerogenezy, prowadząc do lepszego zrozumienia biologii komórki w transformacji nowotworowej i różnych zdarzeń komórkowych w procesie transformacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez NCI (R01-94160 i R01-155086), IU Simon Cancer Center i Wells Center for Pediatric Research.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik do lizy directPCR (ogon) Viagen Biotech102-Tstore @ 4 ° Białkowa C
K SigmaP2308sklep @ -20 ° C
ApliTag 360 taq polimeraza Zastosowane biosystemyN8080155 sklep @ -20 ° C
Tamoxifen SigmaT5648 sklep @ 4 ° C
Igła do karmienia (rozmiar 20) Fisher scientific01-290-9B
Dispase Roche Diagnostic04942078001sklep @ 4 & deg; C
Collagenase IV WorthingtonLS004189sklep @ -20 ° C
Sitko do komórek Fisher scientific08-771-2
Anty-CD11b-PE eBioscience12-0112-81sklep @ 4 & deg; C
Anty-Gr1-APC eBioscience17-5931-81sklep @ 4 & deg; C
Anti-vimentin-FITC eBioscience11-9897-80sklep @ 4 ° Z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
  2. Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
  3. Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
  4. Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
  5. Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
  6. Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
  7. Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
  8. Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
  9. Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
  10. Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
  11. Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
  12. Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
  13. Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
  14. Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
  15. Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
  16. Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
  17. Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
  18. Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
  19. Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
  20. Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
  21. Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
  22. Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
  23. Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
  24. Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
  25. Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
  26. Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
  27. Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70(2010).
  28. Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
  29. Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561(2011).
  30. Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937(2011).
  31. Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668(2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza populacji kom rekizolacja nask rkazawiesina pojedynczych kom rekanaliza cytometrycznabiopsja sk ry mysiejtraktowanie kolagenazprzerywanie kom rek przez sitoznakowanie przeciwcia amiindukcja tamoksyfenem

Powiązane artykuły