Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie aktywności elektrycznej ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych

DOI:

10.3791/50312

⸱

30 kwietnia 2013

 , 
1Department of Physiology, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym filmie pokażemy, jak rejestrować aktywność elektryczną z zidentyfikowanych pojedynczych neuronów w całym preparacie mózgu, który zachowuje złożone obwody neuronowe. Używamy transgenicznych ryb, u których neurony hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) są genetycznie znakowane białkiem fluorescencyjnym w celu identyfikacji w nienaruszonym preparacie mózgu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie fizjologii obwodów nerwowych regulujących złożone zachowania jest znacznie lepsze dzięki zastosowaniu systemów modelowych, w których ta praca może być wykonywana w nienaruszonym preparacie mózgu, gdzie obwody nerwowe OUN pozostają nienaruszone. Używamy transgenicznych ryb, u których neurony hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) są genetycznie znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym w celu identyfikacji w nienaruszonym mózgu. Ryby mają wiele populacji neuronów GnRH, a ich funkcje zależą od ich lokalizacji w mózgu i genu GnRH, który wyrażają1 . Skoncentrowaliśmy naszą demonstrację na neuronach GnRH3 zlokalizowanych w nerwach końcowych (TN) związanych z opuszkami węchowymi przy użyciu nienaruszonego mózgu transgenicznej ryby medaka (Figura 1B i C). Badania sugerują, że neurony medaka TN-GnRH3 są neuromodulujące, działając jako przekaźnik informacji ze środowiska zewnętrznego do ośrodkowego układu nerwowego; nie odgrywają bezpośredniej roli w regulacji funkcji przysadkowo-gonadalnych, tak jak dobrze znane neurony GnRH1 podwzgórza2, 3 . Toniczny, spontaniczny potencjał czynnościowy wystrzeliwania neuronów TN-GnRH3 jest właściwością wewnętrzną4-6, której częstotliwość jest modulowana przez sygnały wizualne od współplemieńców2 i neuropeptydu kisspeptyny 15. W tym filmie używamy stabilnej linii transgenicznej medaki, w której neurony TN-GnRH3 wyrażają transgen zawierający region promotorowy Gnrh3 połączony ze wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji7, aby pokazać, jak identyfikować neurony i monitorować ich aktywność elektryczną w całym preparacie mózgu6.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sekcja mózgów dorosłego Medaka

  1. Znieczulić dorosłego mężczyznę lub kobietę (ryc. 1A) przez zanurzenie w 5 ml MS-222 (150 mg/l, pH 7,4); odczekaj kilka minut po ustaniu ruchów skrzeli przed dekapitacją. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles.
  2. Odciąć ryby w soli fizjologicznej na ogonowym końcu wieczka nożyczkami na szalce Petriego o średnicy 60 mm.
  3. Przenieś głowę ryby na szalkę Petriego o średnicy 35 mm, wypełnioną do połowy solą fizjologiczną dla ryb i wyłożoną Sylgardem, który ma w sobie wgłębienie, aby ustawić i zabezpieczyć głowę do sekcji mózgu. Ustaw i zabezpiecz głowę grzbietem do góry za pomocą szpilek przeciw owadom.
  4. Ostrożnie przeciąć grzbietową część czaszki na całym jej obwodzie drobnymi nożyczkami i delikatnie usunąć ją kleszczami, całkowicie odsłaniając grzbietową część mózgu, w tym przednią część rdzenia kręgowego.
  5. Delikatnie podnieś rdzeń kręgowy kleszczami z cienką końcówką i przetnij obustronne nerwy łączne nożyczkami z cienką końcówką: nerwy czaszkowe, nerwy rdzeniowe i nerwy wzrokowe po brzusznej stronie mózgu oraz nerwy węchowe w przedniej części mózgu.
  6. Umieść w pełni wypreparowany mózg na świeżej szalce Petriego wypełnionej solą fizjologiczną dla ryb i dokładnie sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że cały mózg jest nienaruszony (w tym przysadka mózgowa) bez żadnych nacięć lub nakłuć. Uszkodzone mózgi nie są używane do eksperymentów.

2. Montaż mózgu w komorze nagraniowej

  1. Umieść małą kroplę cyjanoakrylanu lub innego szybko działającego kleju za pomocą igły na środku komory nagraniowej i rozprowadź klej na około 1cm2.
  2. Szybko przenieś mózg i przyklej go w pozycji brzusznej do góry.
  3. Dodać 1 ml soli fizjologicznej z ryb, aby wypełniła komorę zapisu i przykryła mózg. Stale perfować mózg napowietrzoną solą fizjologiczną z ryb z szybkością co najmniej 200 μl/min.
  4. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie usuń opony mózgowe nad powierzchnią obszaru nagrywania mózgu.

3. Elektrofizjologia

  1. Luźny zapis łatek wyzwalania potencjału czynnościowego
    1. Mikroelektrody szklane (6-10 MΩ) są zbudowane z pipet ze szkła borokrzemianowego (1B150F-4, World Precision Instruments) za pomocą ściągacza elektrod (np. Sutter P-87) i z powrotem wypełnione roztworem do zapisu luźnej łaty w połowie wysokości elektrody.
    2. Używając pionowego mikroskopu fluorescencyjnego z chłodzoną kamerą ze sprzężeniem ładunkowym (CCD), znajdź neurony TN-GnRH3 wyrażające GFP przez 10-krotne (ryc. 1B), a następnie 40-krotne zanurzenie w wodzie (ryc. 1C). Znajdują się na brzusznej powierzchni opuszki węchowej lub w jej pobliżu, tuż przed kresomózgowiem.
    3. Przełącz się na monitor wideo, który dostarcza obrazy z mikroskopu w czasie rzeczywistym, aby zlokalizować klaster neuronów TN-GnRH3 (ryc. 1C).
    4. Umieść mikroelektrodę w kąpieli tak, aby końcówka elektrody znajdowała się nad celem neuronu. Wywieraj stały, lekki dodatni nacisk na mikroelektrodę, aby nie została zatkana, i delikatnie zbliż się do docelowego neuronu końcówką elektrody.
    5. Sprawdzaj i monitoruj rezystancję elektrody w trybie cęgów napięciowych za pomocą oprogramowania AxoGraph i wzmacniacza Axoclamp 200B z oprogramowaniem Axograph (Axon Instruments). Kiedy widzisz na monitorze wideo, że końcówka elektrody znajduje się na powierzchni neuronu, a na wyświetlaczu AxoGraph, że rezystancja zmienia się nieznacznie, zwolnij nadciśnienie i w razie potrzeby zastosuj lekkie podciśnienie, aby uzyskać uszczelnienie o niskiej rezystancji na neuronie (<100 MΩ).
    6. Przełącz się w tryb cęgów prądowych i rejestruj napięcie membrany w sposób ciągły bez żadnego prądu, dostosowując skalę napięcia i szybkość nagrywania, jeśli to konieczne. Dane są gromadzone i analizowane przez oprogramowanie Powerlab (ADInstruments Inc.).
    7. Rejestruj wyjściową aktywność elektryczną w normalnym roztworze soli fizjologicznej dla ryb przez około 5 minut przed jakimkolwiek zabiegiem (ryc. 2A). Perfuzja leków, hormonów, peptydów itp. Dodawanie do soli rybnej jest kontynuowane w ilości 200 μl/min, po czym następuje okres wymywania w normalnym roztworze soli fizjologicznej 5, 6, 11.
  2. Zapis potencjału błonowego całej komórki
    Procedura elektrofizjologii całego patch clampu komórkowego jest taka sama, jak w przypadku procedury pozakomórkowego zapisu luźnych plam opisanej powyżej, z kroków 3.1.1 - 3.1.4. Następnie procedury różnią się odpowiednio:
    1. Sprawdź i monitoruj rezystancję elektrody w trybie cęgów napięciowych. Kiedy widzisz na monitorze wideo, że końcówka elektrody znajduje się na powierzchni neuronu, a na oscyloskopie, że rezystancja zmienia się nieznacznie, zwolnij nadciśnienie i zastosuj niewielkie podciśnienie, aby uzyskać uszczelnienie o wysokiej rezystancji na neuronze (~ 3 Giga Ω). Zastosuj delikatne ssanie doustnie, aby rozerwać załataną membranę; zobaczysz nagły spadek rezystancji do około 120-250 MΩ.
    2. Przełącz się w tryb cęgów prądowych i rejestruj napięcie membrany w sposób ciągły bez żadnego prądu, dostosowując skalę napięcia i szybkość nagrywania, jeśli to konieczne.
    3. Zapisywać wyjściową aktywność elektryczną w normalnym roztworze soli fizjologicznej dla ryb przez około 5 minut przed jakimkolwiek zabiegiem, jak opisano powyżej w ppkt 3.1.7 (rysunek 2B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykład obustronnych skupisk neuronów TN-GnRH3 znakowanych GFP z wyekscydowanego mózgu ryby medaka przedstawiono na Rysunkach 1B i 1C. Każde skupisko zawiera około 8-10 neuronów GnRH. Spontaniczną aktywność neuronalną docelowych neuronów TN-GnRH3 rejestrowano w trybie clampingu prądowego (I=0), przy typowych częstotliwościach wyładowań od 0,5 do 6 Hz. Wzór generowania potencjałów czynnościowych ma zazwyczaj charakter toniczny lub rytmiczny (beating pattern), z dość regularnymi odstępami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgeniczne ryby GnRH3:GFP dostarczają unikalnych modeli do badania neurofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw integracji i regulacji neuronów w centralnej kontroli zachowań, które są zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio zaangażowane w reprodukcję3, 8-10. Jedną z istotnych zalet tego systemu modelowego jest to, że wiele neuronów GnRH3 wyrażających GFP znajduje się blisko brzusznej powierzchni mózgu, co pozwala na stosunkowo łatwy dostęp do neuronów w celu zapisu elektrofizjologicznego bez ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Meng-Chin Lin i Pani Yuan Dong za pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte grantem z National Institutes of Health HD053767 (podwykonawstwo dla NLW) oraz ze środków z Wydziału Fizjologii i Biura Prorektora ds. Badań Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (NLW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MikroskopOlympusBX50W (Pionowy)
WzmacniaczAxon InstrumentsAxoclamp 200B
Przetwornik A-DComputer Interference Corp.Digidata ITC-18
Chłodzona kamera CCDPCO Optyka komputerowa Lampa
ksenonowaSensicam Sutter Instruments Co.
Zestaw filtrów GFPChroma Technologies
Oprogramowanie do obrazowaniainteligentnego obrazowaniaOprogramowanie do slajdów
Oprogramowanie do akwizycji danych elektrofizjologicznychOprogramowanie Axon InstrumentsOprogramowanie do aksografii
Oprogramowanie do akwizycji danych elektrofizjologicznychAD Instruments Inc.PowerLab
Headstage do elektrofizjologiiAxon InstrumentsCV 203BU
MicromanipulatorSutter Instrument CoMP-285
Platforma komory nagraniowejWarner Instrument Corp.
P1 Komora nagraniowaWarner Instrument Corp.RC-26G
Ściągacz elektrodInstrumentySutter P87
Filament do ściągacza elektrodSutter InstrumentsFB330BŻarnik korytkowy o szerokości 3,0
mm Kapilary szklane 1,5 mmWorld Precision Instruments1B150-4Micr– lektroda do nagrywania
StrzykawkaBecton Dickinson3095863 ml
MS-222 SigmaE10521-10GSól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu Sól fizjologiczna
rybmM: 134 NaCl; 2,9 KCl; 2,1 CaCl2; 1,2 MgCl2; 10 HEPES
Roztwór elektrody (luźna plama) mM: 150 NaCl; 3,5 KCl; 2.5 CaCl2; 1,3 MgCl2; 10 HEPES; 10
glukoza Roztwór elektrody (plaster na całe komórki) mM: 112,5 K-glukonian; Zawartość NaCl; 17,5 KCl; 0,5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0,1 leupeptyny; 10 foskreatyna
Innowacje w zakresie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909(2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurony GnRHrejestracja elektrofizjologicznaznakowanie GFPpatch clampmikroskopia fluorescencyjnapotencja czynno ciowypotencja b onowysekcja m zgu

Powiązane artykuły