Artykuł metodologiczny

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

DOI:

10.3791/50313

⸱

18 marca 2013

 ,  ,  , 
1Département Nociception et Douleur, Institut des Neurosciences Cellulaires et Intégratives, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), 2Departments of Anesthesiology and Pharmacology, Columbia University , 3Department of Anesthesiology, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intraparenchymalne wstrzyknięcie wektora wirusowego umożliwia warunkową manipulację genami w różnych populacjach neuronów lub poszczególnych regionach ośrodkowego układu nerwowego. Demonstrujemy technikę wstrzykiwania stereotaktycznego, która umożliwia ukierunkowaną ekspresję genów lub wyciszenie w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego myszy. Zabieg chirurgiczny jest krótki. Wymaga laminektomii pojedynczego kręgu, co zapewnia szybki powrót zwierzęcia do zdrowia i niezaburzoną motorykę kręgosłupa. Kontrolowane wstrzyknięcie małej objętości zawiesiny wektorowej przy niskiej prędkości i użycie mikrostrzykawki ze skośną szklaną kaniulą minimalizuje uszkodzenie tkanki. Miejscowa odpowiedź immunologiczna na wektor zależy od swoistych właściwości zastosowanego wirusa; Z naszego doświadczenia wynika, że jest ona niewielka i krótkotrwała, gdy stosuje się rekombinowany wirus związany z adenowirusem. Gen reporterowy, taki jak wzmocnione białko zielonej fluorescencji, ułatwia monitorowanie przestrzennego rozmieszczenia wektora oraz skuteczności i swoistości komórkowej transfekcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaawansowane technologie warunkowej manipulacji genami u myszy umożliwiają wieloaspektowe podejście do eksploracji szlaków synaptycznych i funkcjonalnych połączeń w ośrodkowym układzie nerwowym. Transgeny mogą być regulowane przez małocząsteczkowe efektory, takie jak doksycyklina działająca na transaktywator kontrolowany przez tetracyklinę, który może być zaprojektowany do działania jako represor lub aktywator transkrypcji genu, lub tamoksyfen rozpoznający zmutowaną domenę wiążącą ligand receptora estrogenowego 1. Nieodwracalna modyfikacja transgenu jest powszechnie osiągana przez rekombinazy kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA). Cre (powoduje rekombinację) i Flp (enzym rekombinacji flippazy) katalizują wycinanie, inwersję lub translokację fragmentów DNA, które są otoczone odpowiednio przez miejsca loxP (locus of crossing x over, P1) lub Frt (cel rozpoznawania flippazy) 1. Zastosowania obejmują aktywację lub wyciszanie genów oraz interferencję indukowalnego kwasu rybonukleinowego (RNA) 2. Warunkowa ekspresja reporterów fluorescencyjnych lub enzymatycznych, takich jak β-galaktozydaza lub fosfataza alkaliczna, może być wykorzystana do znakowania neuronów i badania ich miejscowej organizacji i łączności 3. Zakrojone na szeroką skalę projekty mutagenezy w Ameryce Północnej (http://www.norcomm.org/index.htm) i Europie (http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm) produkują biblioteki klonów embrionalnych komórek macierzystych myszy z warunkowymi celami genowymi i pułapkami, które ostatecznie pokryją cały genom myszy. Myszy wygenerowane z tych klonów mogą być krzyżowane z rosnącą liczbą linii myszy, które wyrażają rekombinacje DNA pod promotorami lub loci specyficznymi dla określonej populacji neuronów do selektywnej manipulacji genami (http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php).

Jednakże, ograniczenie manipulacji genami do odrębnych populacji neuronów lub poszczególnych regionów zainteresowania może nie być osiągnięte przez samo celowanie genetyczne, jeśli promotor specyficzny dla populacji neuronów będących przedmiotem zainteresowania nie jest znany lub nie jest wyrażany przez wszystkie neurony w obszarze zainteresowania. W rdzeniu kręgowym projekty eksperymentalne mogą wymagać przestrzennego ograniczenia manipulacji genami do jednego lub dwóch segmentów czaszkowo-ogonowych. Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego, który ulega ekspresji Cre lub Flp, pozwala ograniczyć rekombinację genów do regionów w rdzeniu kręgowym myszy, w których fragmenty DNA są otoczone miejscami loxP lub Frant, tak zwanymi allelami floxowanymi lub flrowanymi. W przeciwieństwie do konstytutywnej rearanżacji DNA, która wynikałaby z krzyżowania zwierząt z myszami wykazującymi ekspresję rekombinazy, strategia ta zapewnia również czasową kontrolę nad aktywacją lub wyciszaniem genów. Wektory wirusowe kodujące floksowane lub flirtowane transgeny oferują odwrotną opcję manipulacji genami u myszy wykazujących ekspresję odpowiedniej rekombinazy poniżej promotora specyficznego dla neuronu. Dostępnych jest kilka wektorów rekombinowanych o powinowactwie do neuronów 4. Adenowirus o dużej pojemności (bez jelit), wirus związany z adenowirusem, wirus opryszczki pospolitej i lentiwirus są powszechnie stosowanymi wektorami neurotropowymi. Wybór odpowiedniego wirusa do pytania badawczego jest kluczową częścią projektu eksperymentalnego. Należy wziąć pod uwagę wielkość transgenu, drogę dostarczania, specyficzność infekcji dla neuronów w przeciwieństwie do komórek glejowych, skuteczność infekcji, zapalne i toksyczne skutki uboczne 4.

Tutaj opisujemy stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do grzbietowego rogu rdzenia kręgowego, technikę, którą stosujemy do warunkowej regulacji genów w naszych badaniach nad neurobiologią bólu. Róg grzbietowy otrzymuje aferentne dane wejściowe z pierwotnych neuronów somatosensorycznych, w tym neuronów nocyceptywnych. Lokalne interneurony przetwarzają informację, zanim neurony projekcyjne przekażą ją z rogu grzbietowego do mózgu 5. Wykazujemy zakażenie neuronów rogu grzbietowego na poziomie segmentu rdzenia L4 neurotropowym rekombinowanym wirusem związanym z adenowirusem (rAAV), który wykazuje ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGfp) pod konstytutywnie aktywnym promotorem wirusa cytomegalii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana procedura chirurgiczna została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Columbia.

1. Przygotowanie sprzętu i zawiesiny cząsteczek wirusa

  1. Wyczyść i zdezynfekuj sprzęt, wysterylizuj narzędzia chirurgiczne i kolce z wycięciem w kształcie litery V, które będą używane do mocowania kręgu L1.
  2. Wyciągaj i ukosuj szklane pipety. Używamy pipet o średnicy końcówki 40 μm i są fazowane pod kątem 20°. Wysterylizuj szklane pipety.
  3. Ustaw ramkę stereotaktyczną, zamontuj wtryskiwacz mikrostrzykawkowy na manipulatorze i podłącz wtryskiwacz do sterownika.
  4. Przymocować jedną ze szklanych pipet do mikrostrzykawki za pomocą zestawu złączek zaciskowych.
  5. Wyjąć tłok z mikrostrzykawki i napełnić strzykawkę olejem mineralnym. Do oleju mineralnego można dodać czerwony olej O (1-(2,5-dimetylo-4-(2,5-dimetylofenyloazo)fenyloazo)-2-naftolow) w celu zwiększenia jego widoczności. Ponownie włóż tłok i dociśnij go aż do końcówki. Ostrożnie unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.
  6. Przygotować zawiesinę cząstek wirusa w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zamrożony wirus należy rozmrozić na lodzie i tuż przed użyciem rozcieńczyć go sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami do pożądanego stężenia cząstek.
  7. Włożyć mikrostrzykawkę do uchwytu na wtryskiwaczu.
  8. Odpipetować 5 μl zawiesiny wirusa na mały arkusz z tworzywa sztucznego, np. Parafilm. Zanurzyć szklaną końcówkę pipety w kropli i pociągnąć tłok, aby napełnić mikrostrzykawkę. Na końcówce pipety utworzy mały pęcherzyk powietrza, aby zapobiec jej zatkaniu.

2. Laminektomia

  1. Przygotuj obszar operacji, przecierając ławkę i poduszkę grzewczą środkiem dezynfekującym.
  2. Znieczulij mysz. Stosujemy znieczulenie wziewne z izofluranem (3% podczas indukcji, 2%-3% podczas podtrzymującej).
  3. Umieść lubrykant na każdym oku, aby chronić oczy przed wysuszeniem podczas operacji.
  4. Ogol sierść od dolnej części pleców do szyi myszy i zdezynfekuj skórę naprzemiennymi chusteczkami z miejscowym środkiem antyseptycznym, takim jak chlorheksydyna lub powidon-jod i 70% etanolu. Odizolować aseptyczne miejsce za pomocą serwety chirurgicznej i naciekać miejsce nacięcia bupiwakainą (0,25%, rozcieńczoną w stosunku 1:10 solą fizjologiczną).
  5. Naciąć skórę na ogonowym końcu klatki piersiowej wzdłuż linii środkowej (2-3 cm) i oddzielić powięź pokrywającą kręgosłup.
  6. Ponieważ rdzeń kręgowy przestaje rosnąć wcześniej w okresie poporodowym niż kręgosłup, odcinek kręgowy L4 leży pod pierwszym kręgiem lędźwiowym (L1). Kręg L1 znajduje się ogonowo do kręgu, który podtrzymuje ostatnią parę żeber. Zidentyfikuj i odsłoń kręg L1, usuwając małe mięśnie rdzeniowe i więzadła przyczepione do jego powierzchni grzbietowej.
  7. Lekko podnieś i przytrzymaj kręg L1 za pomocą kleszczy Adson. Użyj dedykowanych kleszczy do laminektomii, aby usunąć grzbietową część kręgu (kręgosłup i blaszkę) i odsłonić rdzeń kręgowy. Unikaj uszkodzenia rdzenia kręgowego.
  8. Przenieś mysz na płytę grzewczą w ramce stereotaktycznej. Monitoruj temperaturę myszy podczas kolejnej operacji.

3. Wtrysk

  1. Zamocuj kręg L1 za pomocą kolców z wycięciem w kształcie litery V. Kolce muszą stabilizować kręgosłup, aby kręg nie poruszał się podczas oddychania.
  2. Przysunąć mikrostrzykawkę bliżej tak, aby końcówka pipety znajdowała się powyżej miejsca laminektomii. Opuścić tłok do momentu, gdy zawiesina wirusa wydostaje się z pipety. Usuń kroplę za pomocą sterylnej bawełnianej końcówki.
  3. Umieść końcówkę pipety w najbardziej rostralnej części odsłoniętego rdzenia kręgowego. Wyśrodkuj pipetę powyżej tylnej bruzdy środkowej, a następnie przesuń końcówkę o 500 μm w bok. Opuść końcówkę na powierzchnię sznurka i nakłuj oponę twardą lub, jeśli pracujesz z nieskośną szklaną pipetą, użyj skośnej stalowej kaniuli do przebicia opony twardej. Opuść końcówkę szklanej pipety na 300 μm do rdzenia kręgowego.
  4. Wstrzyknąć 1 μl zawiesiny wirusa z szybkością 200 nl/min.
  5. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać co najmniej 2 minuty przed powolnym wyjęciem pipety.
  6. Powtórz kroki od 3,3 do 3,5 w najbardziej ogonowej części odsłoniętego rdzenia kręgowego, aby uzyskać pełną dystrybucję wektora wirusowego w segmencie rdzenia L4. Dwa miejsca wstrzyknięcia znajdują się rostralnie i ogonowo segmentu L4, aby uniknąć uszkodzenia tkanki w obszarze docelowym.

4. Zamykanie ran

  1. Zwolnij kręg L1 z zacisków z wycięciem w kształcie litery V i wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej.
  2. Zszyj powięź vicrylem 5.0. Zamknięta powięź zapewnia osłonę dla miejsca laminektomii.
  3. Zamknij skórę nylonowymi szwami lub zszywkami chirurgicznymi.

5. Opieka pooperacyjna

  1. Przenieś mysz do klatki regeneracyjnej z miękką, nieszczególną ściółką. Połóż go na boku, aby wygodnie oddychać. Monitoruj zwierzę, dopóki nie będzie w pełni przytomne, nie zacznie chodzić i nie zacznie pić.
  2. Zapewniamy analgezję pooperacyjną przez 72 godziny z codziennymi podskórnymi iniekcjami karprofenu (5,0 mg/kg).
  3. Monitoruj rekonwalescencję pooperacyjną poprzez codzienną inspekcję przez pierwsze 3 dni, a następnie co drugi dzień lub 3 dni w tygodniu, aż do zakończenia eksperymentu.
  4. Usuń szwy lub zszywki skórne 7 do 10 dni po operacji, gdy gojenie się rany jest zakończone.
  5. Poddaj zwierzę eutanazji po zakończeniu eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana transfekcja daje silną ekspresję genów w neuronach wstrzykniętego rogu grzbietowego (Rysunek 1), oszczędzając róg grzbietowy po stronie przeciwnej, róg brzuszny i zwoje korzenia grzbietowego.

figure-results-1
Rysunek 1. Transfekcja neuronów rogu grzbietowego. (A) Ekspresja fluorescencyjnego reportera eGfp (zielonego) w lewym rogu grzbietowym rdzenia kręgowego L4, dwa tygodnie po stere...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Iniekcja wektora stereotaktycznego umożliwia celowanie w neurony rdzenia kręgowego do zastosowań takich jak mapowanie sieci neuronalnych w oparciu o transsynaptyczne rozprzestrzenianie wirusa 6,7 lub optogenetyczne rozwarstwienie 8, prowadzenie aksonów podczas regeneracji po urazie 9,10 lub terapia genowa w celu zapobiegania lub leczenia neurodegeneracji 11,12. Wektory wirusowe zostały wykorzystane do manipulacji genami w rdzeniu kręgowym w celu zbadania szlaków somatosensorycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Bakhos A. Tannous, Ph.D., Dyrektorowi ds. Rozwoju i Produkcji Wektorów w Centrum Neuronauki Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, za dostarczenie nam wektora rAAV-eGfp, oraz Johnowi Whangowi za pomoc techniczną. Praca ta została wsparta grantem R01 NS050408 (dla J.S.) z National Institute of Neurological Disorders and Stroke.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podstawa kręgosłupaDavid Kopf Instruments912
Instrument stereotaktyczny dla małych zwierzątDavid Kopf Instruments900
Uchwyt na głowę do znieczulenia gazem dla myszyDavid Kopf Instruments923-B
Regulowane mocowania podstawyDavid Kopf Instruments982
V Kolce do wycinaniaDavid Kopf Instruments987
System kontroli temperatury małych zwierzątDavid Kopf InstrumentsTCAT-2LV
Kleszcze AdsonFine Science Tools11006-12
Kleszcze do laminektomiiFine Science Tools11223-20
UltraMicroPump (jeden) ze sterownikiem SYS-Micro4 WorldPrecision InstrumentsUMP3-1
Mikrostrzykawka, 65RNHamilton7633-01
RN złączka zaciskowa, 1 mmHamilton55750-01
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instruments1B100F-4
MikroszlifierkaNarishigeEG-44

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
  2. Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
  3. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
  4. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
  5. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
  6. Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
  7. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
  8. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
  9. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
  10. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
  11. Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
  12. Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
  13. Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
  14. South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
  15. Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
  16. Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
  17. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834(2011).
  18. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
  19. Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52(2009).
  20. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Procedura laminektomiipipeta szklanamikrosstrzykawkaulepszone zielone bia ko fluorescencyjner g tylnytechnika chirurgiczna

Powiązane artykuły