Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

DOI:

10.3791/50320

⸱

29 października 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genome Stability Laboratory, Oncology Axis, Hôtel-Dieu de Québec

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym protokole demonstrujemy wysoce efektywną i opłacalną metodę oczyszczania białek na małą skalę, która pozwala na oczyszczanie rekombinowanych białek poprzez unikalne połączenie rozszczepialnego znacznika GST i małego znacznika His.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe testy enzymatyczne do biochemicznej charakterystyki białek in vitro wymagają wysokich stężeń oczyszczonego białka, które jest przedmiotem zainteresowania. Protokoły oczyszczania białek powinny łączyć w sobie skuteczność, prostotę i opłacalność1. Tutaj opisujemy metodę GST-His jako nowy system oczyszczania powinowactwa na małą skalę dla białek rekombinowanych, oparty na N-końcowym znaczniku sefarozy glutationu (GST)2,3 i C-końcowym znaczniku 10xHis4, które są połączone z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Ten ostatni konstrukt jest używany do generowania bakulowirusów, do infekcji komórek zakażonych Sf9 w celu ekspresji białka5. GST to dość długa etykieta (29 kDa), która służy do zapewnienia skuteczności oczyszczania. Może jednak wpływać na właściwości fizjologiczne białka. W związku z tym jest on następnie odcinany od białka za pomocą enzymu PreScission6. Aby zapewnić maksymalną czystość i usunąć rozszczepiony podatek od towarów i usług, dodaliśmy drugi etap oczyszczania powinowactwa oparty na stosunkowo małym His-Tagu. Co ważne, nasza technika opiera się na dwóch różnych znacznikach flankujących dwa końce białka, co jest skutecznym narzędziem do usuwania zdegradowanych białek, a tym samym wzbogaca białka o pełnej długości. Przedstawiona tutaj metoda nie wymaga drogiego zestawu instrumentalnego, takiego jak FPLC. Dodatkowo zastosowaliśmy myjki MgCl2 i ATP w celu usunięcia zanieczyszczeń białkowych szoku cieplnego oraz obróbkę nukleazą w celu zniesienia zanieczyszczających kwasów nukleinowych. Podsumowując, połączenie dwóch różnych znaczników otaczających N- i C-koniec oraz zdolność do odcięcia jednego ze znaczników gwarantuje odzyskanie wysoce oczyszczonego i pełnowymiarowego białka, które jest przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie białek rekombinowanych jest kluczowe dla odpowiedzi na fundamentalne pytania w biochemii. Konwencjonalne metody oczyszczania białek, takie jak chromatografia jonowymienna i chromatografia wykluczania wielkości, opierają się na właściwościach fizycznych białka docelowego, takich jak odpowiednio jego punkt izoelektryczny i ładunek lub rozmiar. Te ostatnie cechy białek są wspólne dla różnych białek, co znacznie zwiększa szansę na zanieczyszczenie białek w konwencjonalnych strategiach oczyszczania białek. Problem ten można obejść za pomocą wielu kolumn oczyszczających, co jest czasochłonne. Jednocześnie te ostatnie metody chromatograficzne wymagają kosztownej konfiguracji eksperymentalnej. Oczyszczanie znacznika powinowactwa silnie zwiększa swoistość docelową, ponieważ w większości przypadków znacznik będzie unikalny dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. W ostatnich badaniach szeroko stosowane jest oczyszczanie z powinowactwem do flagi lub HA.

W przeciwieństwie do istniejących protokołów oczyszczania białek rekombinowanych, w których używane są pojedyncze znaczniki, ustaliliśmy unikalną kombinację dwóch znaczników. Nasza metoda polega na fuzji znacznika GST na końcu N i znacznika Hisa na końcu C białka będącego przedmiotem zainteresowania, w celu uzyskania optymalnego stosunku między ilością a czystością pożądanego białka. GST to długa etykieta (29 kDa), która jest bardzo skuteczna w oczyszczaniu kulek glutationu Sepharose. Co więcej, stosowanie podatku od towarów i usług gwarantuje opłacalność naszej metody1. Możliwość odszczepienia GST za pomocą enzymu PreScission (z sekwencją rozpoznającą LeuGluValLeuPheGln/GlyPro, co skutkuje dodaniem tylko dwóch aminokwasów) ma wiele zalet, na przykład strategia ta pozwala uniknąć zmian fizjologicznych funkcji białek z powodu przeszkody allosterycznej. Mały znacznik Hisa połączony z drugim końcem białka służy w drugim etapie oczyszczania do zwiększenia czystości białka poprzez zmycie rozszczepionego GST, a także zdegradowanych białek i innych zanieczyszczeń. Dodatkowo protokół nie wymaga etapu dializy przy przełączaniu z kolumny etapowej GST na kolumnę etapową oczyszczania His (żywica TALON). Powszechnymi zanieczyszczeniami w takich procesach oczyszczania są białka szoku cieplnego (HSP). Dodanie etapu inkubacji z MgCl2 i ATP pozwala na usunięcie tych zanieczyszczeń (ryc. 1).

Szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC) i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) są powszechnymi technikami, które polegają na drogim oprzyrządowaniu, aby uzyskać wysoką wydajność oczyszczonego białka. Z kolei prezentowany przez nas protokół oczyszczania wsadowego jest ręczny i nie wymaga drogiej konfiguracji instrumentalnej. Wysoką wydajność białka można osiągnąć poprzez zwiększenie skali protokołu. Jednocześnie, dzięki protokołowi oczyszczania partii, objętość elucji można dostosować w celu zwiększenia stężenia białka, czego nie podaje się za pomocą FPLC lub HPLC.

Ponadto, dzięki protokołowi oczyszczania partii GST-His, białka o zakresie wielkości ~10-300 kDa mogą być oczyszczane. Jedną z największych zalet jest fakt, że można oczyścić kilka białek jednocześnie, na przykład zarówno białko typu dzikiego, jak i jego zmutowane. Powodzenie przedstawionego protokołu zależy wyłącznie od poziomu ekspresji i rozpuszczalności białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja rekombinowanego bakulowirusa

Baculowirusy są generowane przy użyciu Systemu Ekspresji Baculowirusa Bac-to-Bac firmy Invitrogen głównie zgodnie z protokołem producenta, z niewielkimi tylko modyfikacjami:

  1. Stworzono zmodyfikowany wektor pFastBac1 (Gibco, life) zawierający znaczniki GST i His (rysunek 2). MultiKlonowanie Ośrodka (MCS) wektora pET-52b(+) (Novagen), zawierającego znacznik 10xHis, zostało wstawione do MCS wektora pFastBac1 w celu wygenerowania pFastBac1-Strep-10xHis. Sekwencja MCS pET-52b (+) została amplifikowana PCR między miejscami restrykcyjnymi XbaI i BlpI, dodając miejsce restrykcyjne BglII na końcu 5' i miejsce restrykcyjne HindIII na końcu 3'. Produkt PCR został następnie sklonowany między miejscem restrykcji BamHI i HindIII pFastBac1, wykorzystując kompatybilność sekwencji restrykcyjnych BamHI i BglII. Ponieważ celem było wygenerowanie pFastBac1 umożliwiającego ekspresję rekombinowanego białka ze znacznikami streptawidyny i 10xHis, nie wykorzystano miejsca restrykcyjnego BamHI sekwencji MCS pET-52b(+). Ponadto miejsce ograniczenia XbaI nie zostało użyte, aby uniknąć redundancji miejsc restrykcyjnych występujących między miejscami już w MCS pFastBac1 a tymi wstawionymi z MCS pET-52b(+). Sekwencja kodująca GST z miejscem rozpoznawania proteazy PreScission (LeuGluValLeuPheGln/GlyPro) została następnie wprowadzona do pFastBac1-Strep-10xHis. Sekwencja cDNA GST z pGEX-6P-2 (GE Healthcare) została amplifikowana PCR starterami zawierającymi miejsca restrykcyjne NcoI i KpnI odpowiednio na końcach 5' i 3'. Miejsce NcoI pozwala na dodanie kodonu startowego, ale także alaniny do GST. Produkt PCR został następnie sklonowany do pFastBac1-Strep-10xHis między miejscami restrykcji NcoI i KpnI, co spowodowało usunięcie znacznika Streptawidyny. Otrzymany w ten sposób nowy wektor fuzyjny został nazwany pFastBac1-GST-10xHis.
  2. Sklonuj cDNA kodujące interesujące białko do wektora pFastBac-GST-10xHis między GST (N-końcem) a znacznikiem His (C-końcem). Uważaj, aby usunąć kodon stop cDNA, aby umożliwić fuzję z C-końcowym znacznikiem His.
  3. Przekształć E. coli DH10Bac za pomocą rekombinowanego pFastBac (otrzymanego w kroku 1.2) w celu wytworzenia bakmidu. Pozostawić kolonie do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C i przez kilka godzin w temperaturze 30 °C na płytkach selekcyjnych zawierających Bluo-gal i IPTG (10 μg/ml tetracykliny, 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 100 μg/ml Bluo-Gal, 40 μg/ml IPTG).
  4. Wybierz i ponownie umieść 2 białe kolonie (z kroku 1.3) na płytkach selekcyjnych, aby potwierdzić biały fenotyp.
  5. Zaszczepić 2 ml LB zawierającego 10 μg/ml tetracykliny, 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml gentamycyny dwiema białymi koloniami z kroku 1.4 i pozostawić je do wzrostu przez noc pod wpływem mieszania (250 obr./min) w temperaturze 37 °C.
  6. W celu oczyszczenia DNA bakterii należy otoczkować bakterie z kroku 1.5, ponownie zawiesić komórki w 300 μl roztworu I i dodać 300 μl roztworu II (zestaw Maxiprep firmy Qiagen). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, dodać 300 μl 3 M KOAc pH 5,5 i inkubować przez 10 minut na lodzie. Odwirować próbki w temperaturze 4 °C, maksymalna prędkość przez 10 minut. Dodać 800 μl izopropanolu do supernatantów i inkubować przez 10 minut na lodzie. Odwirować próbki przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przepłukać osad 500 μl 70% etanolu. Pozostawić granulkę do wyschnięcia i ponownie zawiesić ją w sterylnych warunkach w 40 μl Tris-EDTA pH 8,0. DNA bakterii powinno być przechowywane w temperaturze 4 °C.
  7. Generuj bakulowirusy zgodnie z opisem w protokole producenta. Bakulowirusy mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.

2. Ekspresja białka rekombinowanego

  1. Aby wybrać najskuteczniejszego bakulowirusa do oczyszczenia i monitorować, w którym czasie osiągany jest szczyt ekspresji białka, należy przeprowadzić test mini-infekcji w następujący sposób: Zainfekuj 2 x 107 komórek zakażonych Sf9 hodowanych w temperaturze 27 °C w pożywce Grace'a (uzupełnionej 10% FBS i 1% P/S) 133 μl (1/150) bakulowirusa. Zbierz porcje po 1,5 ml po 0, 24, 48 i 72 godzinach po zakażeniu. Umieść komórki w osadkach i przeanalizuj poziom ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą western blot przy użyciu przeciwciał anty-tagowych.
  2. Użyj najskuteczniejszego bakulowirusa z kroku 2.1, aby zainfekować spinnera zawierającego 1,0 x 106 komórek Sf9 na ml w 500 ml pożywki w stosunku 1/150 między wirusem a pożywką. Pozwolić zakażonym komórkom rosnąć w zawiesinie w temperaturze 27 °C i zebrać komórki, gdy osiągnięta zostanie maksymalna ekspresja białka (jak określono w kroku 2.1 powyżej). Granulowane komórki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

3. Przygotowanie rozpuszczalnego lizatu komórkowego

Wszystkie poniższe etapy inkubacji są przeprowadzane w temperaturze 4 °C przy łagodnym obrocie.

  1. Lizuj komórki Sf9 wyrażające interesujące Cię białko w ~ 20 ml buforu wiążącego GST (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT w PBS1X dla końcowego stężenia NaCl 250 mM i koktajl inhibitorów proteazy (Roche). W lodowatej kąpieli wodnej zanurz roztwór 20 razy za pomocą homogenizatora z odbiciem, poddaj sonikacji 3 razy po 30 sekund (70% wydajności) i ponownie zanurz 20 razy.
  2. (Opcjonalnie). Inkubować całkowity lizat komórkowy z 1 mM MgCl2 i nukleazą benzonazy7 (2,5 U/ml) przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczenia DNA lub RNA.
  3. Wirować z prędkością 18 000 obr./min przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant.
  4. (Opcjonalnie). Ponownie odwirować supernatant przez 30 minut przy 18 000 obr./min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać klarowny rozpuszczalny lizat. Przepuść supernatant przez filtr 0,2 lub 0,45 μm, aby uniknąć zatkania.

4. Wiązanie białka na koralikach GST

  1. Inkubować rozpuszczalny lizat komórkowy z 1 ml kulek GST (dwukrotnie przemytych 10 ml buforu wiążącego GST) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C przy delikatnych zmianach.

Komentarz: Czas inkubacji musi być zoptymalizowany pod kątem stabilności białka i skuteczności wiązania.

  1. Szybkie wirowanie z prędkością 700 obr./min i usunięcie supernatantu zawierającego niezwiązane białka (można go zachować do dalszej analizy). Przemyć białka związane z GST (rysunek 3B, tor 1) buforem płuczącym GST (bufor wiążący GST z 350 mM NaCl końcowym).
  2. Powtórz krok 4.2 2 razy. Przy ostatnim praniu usuń jak najwięcej supernatantu.
  3. Inkubować kulki z 5 mM ATP i 15 mM MgCl2 (w 10 ml buforu wiążącego GST) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, aby uniknąć niespecyficznego wiązania białek szoku cieplnego8. Umyj koraliki trzykrotnie buforem myjącym GST.

5. Podział GST przed rozcięciem

  1. Odwirować kulki GST, usunąć supernatant i przemyć kulki GST buforem P5 (50 mM NaHPO4 pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glicerol, 0,05% Triton-X-100, 5 mM imidazolu).
  2. Inkubować kulki GST z enzymem PreScission w buforze P5 przez 3 godziny do nocy w temperaturze 4 °C. (Podzielić kulki GST na frakcje po 100 μl i dodać 4-8 jednostek (2-4 μl) enzymu rozcieńczonego w 100 μl buforu P5).

Komentarz: Czas inkubacji etapu PreScission musi być zoptymalizowany zgodnie z masą cząsteczkową oraz stabilnością białka. Jeśli zaobserwuje się degradację, czas inkubacji można skrócić do minimum 2 godzin zamiast przez noc.

  1. Szybko zakręć i zbierz supernatant. Powtórz ten krok dwa razy po dodaniu 100 μl buforu P5 do kulek i zgrupuj wszystkie frakcje (Rysunek 3B, ścieżka 2).

Komentarz: Pozostałe koraliki mogą być użyte do analizy efektywności dekoltu (Rysunek 3B, ścieżka 3). Zwykle 70-80% białka jest rozszczepione.

6. Wiązanie białek z żywicą TALON Metal Affinity

  1. Podzielić elucję od góry na 3 frakcje po 1 ml i inkubować każdą z nich ze 100 μl suchych kulek żywicy o powinowactwie do metalu Talon (wstępnie przemytych dwukrotnie buforem P5) przez 1 godzinę na zmianach.

Komentarz: Dzielenie elucji na kilka frakcji zwiększa skuteczność wiązania/płukania.

  1. Przemyć żywicę przez 5 minut buforem P30 (bufor P5 o końcowym stężeniu 30 mM imidazolu).
  2. Powtórz krok 6.2 2x i zbierz koraliki w jednej tubce. Przed ostatnim praniem usuń jak najwięcej supernatantu.

Komentarz: To odpowiada próbce związanej z TALON (Rysunek 3B, pas 4).

7. Elucja oczyszczonego białka

  1. Żywicę TALON związaną z białkiem inkubować przez 5 minut na zmianę z buforem P500 (bufor P5 o końcowym stężeniu 500 mM imidazolu). Użyj stosunku między buforem a kulkami 1:1 v/v. (Na przykład, jeśli wziąłeś 200 μl suchych kulek, będziesz musiał dodać 200 μl P500). Powtórz ten krok dwa razy i utrzymuj każdą eluowaną frakcję osobno (nazwaną elucją: 1 (E1), elucją, 2 (E2) i elucją3 (E3); Rysunek 3B, pasy 5-7).

Komentarz: Pozostałe koraliki mogą być użyte do analizy skuteczności elucji (Rysunek 3B, ścieżka 8). Zazwyczaj 60-80% białka jest całkowicie eluowane.

  1. Przeanalizuj ilość i jakość oczyszczonego białka, ładując około 20-40 μl każdej frakcji o standardowym stężeniu BSA na SDS-PAGE i barwiąc niebieskim Coomassie (ryc. 3B) lub barwnikiem białkowym SYPRO w celu wizualizacji.

Komentarz: Interesujące białko można również wykryć podczas procedury oczyszczania za pomocą przeciwciał anty-GST i anty-His (Rysunek 3C).

8. Przechowywanie oczyszczonego białka

  1. Oczyszczone białko należy dializować w odpowiednim buforze do przechowywania (np. 20 mM octanu trisu o pH 8,0, 200 mM KAc, 10% glicerolu, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) w temperaturze 4 °C. Ważne jest, aby sprawdzić, czy podczas dializy nie wytrąciło się oczyszczone białko. Zazwyczaj dializujemy 2x przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C przy rotacji mieszania.
  2. Z oczyszczonego białka należy przygotować małe porcje (10–20 μl) i zamrażać na suchym lodzie przez 30 minut. Przechowywać porcje w temperaturze -80 °C i unikać wielu cykli rozmrażania/zamrażania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować skuteczność protokołu oczyszczania GST-His, oczyściliśmy Rec14, białko S. pombe o sile 32,9 kDa. CDNA Rec14 zostało sklonowane w naszym zmodyfikowanym wektorze pFastBac1, co pozwoliło na dodanie znaczników GST i His odpowiednio na końcach N i C (Figura 1A). Następnie przygotowano rekombinowany bakulowirus i wykorzystano go do zakażenia komórek zakażonych SF9 w celu ekspresji białek. Rozpuszczalne lizaty komórkowe inkubowano z kulkami GST, a białka związane eluowano przez rozszcze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół oczyszczania GST-His jest odpowiedni do oczyszczania szerokiego zakresu rozmiarów rekombinowanych białek: Z powodzeniem oczyściliśmy LiRAD51 (41 kDa), piBRCA2 (120 kDa), PALB2 (130 kDa) i niestabilne białko o wysokiej masie cząsteczkowej Leishmania infantum: LiBRCA2 (125 kDa)6,9. Co więcej, białka oczyszczone za pomocą tego protokołu były aktywne biochemicznie6. Sukces tej metody zależy wyłącznie od ekspresji, rozpuszczalności i stabilności po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Anne-Marie Dion-Cote za dyskusje, które doprowadziły do rozwoju metody. J.K. i R.B. są doktorantami FQNRT, M.-M.G. jest stypendystą Vanier CIHR, a J.-Y.M. jest starszym badaczem FRSQ. Prace te były wspierane przez fundusze Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii dla J-Y. M.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
E.Coli DH10Bac (kompetentny)Invitrogen
Bac-to-BacInvitrogen
Maxi Qiagen12163Roztwór I i II
Ultra Pure Bluo-GalGibco (Life)15519028
IPTGGibco (Życie)15529019
Komórki zakażone Sf9ATCCCRL-1711
Enzym PreScissionGE Healthcare27084301
Zakażone podłoże Grace uzupełnioneGibco (Life)11605-094
Płodowa surowica bydlęca charakteryzującasię HyklonSH30396,03
P / S (penicylina-streptomycyna)Gibco (Life)15070-063
Glutation Sepharose żywicaGE bioscience17075605
Koktajl inhibitorów proteazyRoche11873580001
Talon żywicaClontech635504
ImidazoleBioShop288324
GentamycynaGibco (Life)15710064
Poliklonalne przeciwciało GSTProdukcja we własnym zakresie
Przeciwciało monoklonalne 6X-His-Clontech631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizator (tight)Wheaton357546
Sonicator (Fisher dismembrator)FisherModel 150
Torba do dializy (50 mm)Fisher Scientific
System ekspresji bakulowirusa Zestaw przygotowawczy 2115217

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  2. Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
  3. Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
  4. Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
  5. Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
  6. Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
  7. Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
  8. Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
  9. Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
  10. Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

GST His purificationTwo step affinityProtein purificationRecombinant proteinBaculovirus expressionSf9 cellsGlutathione SepharoseHis tag affinityPreScission cleavageSDS PAGE analysis

Powiązane artykuły