Artykuł metodologiczny

Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/50321

⸱

14 kwietnia 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The University of Connecticut Health Center, 2Department of Genetics and Developmental Biology, The University of Connecticut Health Center, 3Stem Cell Institute, The University of Connecticut Health Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura prowadzi do powstania neuronów kresomózgowiowych poprzez przejście przez punkty kontrolne, które są podobne do tych obserwowanych podczas rozwoju człowieka. Komórki mogą się spontanicznie różnicować, są wystawione na działanie czynników, które popychają je w kierunku linii neuronalnej, są izolowane i są powlekane na szkiełkach nakrywkowych, aby umożliwić końcowe różnicowanie i dojrzewanie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisano krok po kroku do efektywnego generowania neuronów glutaminergicznego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Proces różnicowania jest inicjowany przez rozbicie ludzkich PSC na grudki, które zaokrąglają się, tworząc agregaty, gdy komórki są umieszczane w hodowli zawiesinowej. Agregaty są następnie hodowane w pożywce hESC od 1 do 4 dni, aby umożliwić spontaniczne różnicowanie. W tym czasie komórki mają zdolność przekształcania się w dowolny z trzech listków zarodkowych. Od 5 do 8 dnia komórki umieszcza się w pożywce do indukcji neuronów, aby wepchnąć je do linii neuronalnej. Około 8 dnia komórki mogą przyczepić się do 6 dołków i różnicować się, w tym czasie tworzą się komórki neuronabłonkowe. Te komórki neuroepitelialne można wyizolować w 17 dniu. Komórki mogą być następnie przechowywane jako neurosfery, dopóki nie będą gotowe do posiewu na szkiełkach nakrywkowych. Używając podstawowej pożywki bez żadnych czynników kaudalizujących, komórki neuroepiteliczne są określane jako prekursory kresomózgowia, które następnie mogą być dalej różnicowane w grzbietowe progenitory kresomózgowia i neurony glutaminergiczne. Ogólnie rzecz biorąc, nasz system zapewnia narzędzie do generowania ludzkich neuronów glutaminergiczne, dzięki którym naukowcy mogą badać rozwój tych neuronów i choroby, które na nie wpływają.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC), w tym zarówno ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC), jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), mają zdolność do generowania każdego typu komórek w ciele, w tym neuronów1-3. Ukierunkowane różnicowanie różnych podtypów neuronów z ludzkich PSC jest kluczem do zastosowania tych komórek w medycynie regeneracyjnej. Generowanie funkcjonalnych podtypów neuronów podczas rozwoju jest złożonym procesem obejmującym indukcję linii neuronalnej, specyfikację regionalnych komórek progenitorowych wzdłuż osi rostro-ogonowej oraz różnicowanie postmitotycznych typów neuronów od regionalnych progenitorów4,5. Począwszy od 2001 r., stworzono kilka systemów do generowania linii neuronalnej z hESC, które zapewniły platformę dla kolejnej generacji podtypów neuronów6,7. Opierając się na zasadach rozwoju, kilka typów neuronów, takich jak neurony ruchowe rdzenia kręgowego8-12, neurony dopaminergiczne śródmózgowia13-15 i komórki siatkówki nerwowej16,17 zostały skutecznie określone z ludzkich PSC. Dokonano tego poprzez zastosowanie krytycznych morfogenów, które są ważne dla specyfikacji tych typów neuronów podczas rozwoju in vivo. Opracowano również inne protokoły promujące różnicowanie hESC w neurony przy użyciu dodatkowych czynników18-20, takich jak małe cząsteczki, lub poprzez współhodowlę z innymi typami komórek, aby pomóc w promowaniu różnicowania21.

Ludzka kora nowa jest wysoce rozwinięta i zawiera wiele typów komórek, w tym neurony glutaminergiczne, które odgrywają ważną rolę w uczeniu się, pamięci i funkcjach poznawczych22,23. Pierwszym krokiem w generowaniu neuronów glutaminergicznego w hodowli jest określenie komórek progenitorowych kresomózgowia. Grupa Yoshiki Sasai po raz pierwszy poinformowała o ukierunkowanym różnicowaniu prekursorów kresomózgowia od mysich ESC (mESC) przy użyciu hodowli zawiesiny bez surowicy w obecności DKK1 (która hamuje sygnalizację Wnt), a także LeftyA (która hamuje sygnalizację węzłową). Następnie kilka grup, w tym nasza, zgłosiło również specyfikację prekursorów kresomózgowia z ludzkich PSC w pożywce wolnej od surowicy 25-27. Wytwarzanie prekursorów kresomózgowia z ludzkich PSC nie wymaga stosowania egzogennych morfogenów, a wydajność w wytwarzaniu tych prekursorów jest znacznie wyższa niż w przypadku mESC 26,27. Tutaj opisano chemicznie zdefiniowany system indukcji neuronalnej, który został dobrze ugruntowany przez grupę7 Zhanga. Bez dodatku egzogennych czynników kaudalizujących, protokół ten skutecznie generuje prekursory kresomózgowia z ludzkich PSC27. Tych przodków można następnie różnicować na przodków grzbietowych lub brzusznych, regulując sygnalizację Wnt i jeża sonicznego (SHH). Przodkowie grzbietowi mogą dalej efektywnie różnicować się w neurony glutaminergiczne27. Ponadto protokół ten działa również dobrze w przypadku generowania neuronów glutaminergicznego z ludzkich iPSC28, co pozwala na generowanie neuronów specyficznych dla pacjenta, które można wykorzystać do zbadania mechanizmu działania, a także potencjalnych terapii dla szerokiej gamy chorób. Co więcej, nasz system stanowi również platformę do badania rozwoju i specyfikacji różnych typów neuronów w kresomózgowiu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie ludzkich pluripotencjalnych agregatów komórek macierzystych (D1-D4)

  1. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste są hodowane na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w obecności pożywki hESC uzupełnionej podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 4 ng/ml). Po 5-7 dniach w hodowli, kiedy kolonie są duże, ale jeszcze niezróżnicowane, są gotowe do następnego kroku.
  2. Najpierw należy przygotować roztwór enzymu. W probówce o pojemności 50 ml rozpuścić dypazę (lub kolagenazę) w stężeniu 1 mg/ml w pożywce DMEM/F12. Ponieważ roztwory te najlepiej mieszają się po podgrzaniu, umieść probówkę zawierającą pożywkę i enzym w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10-15 minut, a następnie wysterylizuj ją za pomocą filtra Steriflip.
  3. Odessać pożywkę z komórek, przepłukać je DMEM/F12 i również to odessać. Dodać 1 ml dypazy do każdej studzienki i umieścić w inkubatorze na 3-5 minut w przypadku hESC (do 10 minut w przypadku iPSC). Spójrz na komórki pod mikroskopem; Gdy krawędzie lekko się zawijają/wyglądają na nieco ciemniejsze, komórki są gotowe do następnego kroku. Najlepiej sprawdzić ogniwa po 3 minutach i w razie potrzeby włożyć je z powrotem. Używając tego protokołu po raz pierwszy, najlepiej jest zacząć od tylko jednej płytki komórek na raz, ponieważ ważne jest, aby usunąć komórki z papy tak szybko, jak to możliwe.
  4. Odessać dypazę z komórek. Delikatnie (na tym etapie komórki są bardzo wrażliwe i stosunkowo łatwo odklejają się od płytki) dodać 1,5 ml pożywki DMEM/F12 do każdej studzienki, aby spłukać dypazę. Odessać DMEM/F12 i dodać 1,5 ml pożywki hESC do każdej studzienki.
  5. Aby odłączyć i rozbić komórki, umieść końcówkę szklanej pipety o pojemności 10 ml w kierunku prawego dolnego rogu studzienki (dotykając komórek) i przesuwaj pipetę w górę iw dół (w pionie) - pociągnięcie w górę powinno znajdować się w bliskiej odległości od postępującego ruchu w dół. Po dotarciu do drugiej strony studni powtórz w kierunku poziomym.
  6. Gdy wszystkie komórki znajdą się w zawiesinie, umieść je w probówkach o pojemności 15 ml i odwiruj w sile 200 x g przez 2 minuty. Na dnie rurki powinna znajdować się osadka komórek. Odessać pożywkę znad osadu.
  7. Wielkość kolby do hodowli komórkowej, która powinna być wykorzystana do utrzymania agregatów, zależy od pierwotnej ilości komórek. W przypadku 6 dołków (1 płytka) hESC należy użyć jednej kolby T75 poddanej hodowli nietkankowej z 50 ml pożywki hESC. Przenieść komórki z etapu 1.6 do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C.
  8. W celu pozbycia się resztek komórek, podłoże komórkowe i kolbę należy wymienić około 12 godzin później. Aby to zrobić, umieść wszystkie pożywki/komórki w probówce o pojemności 50 ml, odwiruj komórki (200 x g przez 2 minuty) i odessaj stare podłoże. Następnie dodać 50 ml świeżej pożywki hESC do komórek i umieścić w nowej kolbie T75. Komórki mogą być następnie karmione codziennie zgodnie z tą samą procedurą (do 5 dnia).

2. Indukcja komórek neuroepitelialnych (D5-D17)

  1. Przenieść komórki/pożywkę do probówki o pojemności 50 ml i odwirować komórki przez 2 minuty przy 200 x g. Następnie odessać supernatant i przenieść komórki do nowej kolby T75 (niepoddanej działaniu hodowli tkankowej) z 50 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM).
  2. Gdy komórki znajdą się w NIM, połowę pożywki należy wymieniać co drugi dzień. Agregaty powinny stać się na tyle duże, że po kilku minutach same opadną na dno stożkowej probówki o pojemności 50 ml (nie jest wymagane wirowanie). Po 2-3 dniach w NIM (łącznie D7-D8) komórki powinny być gotowe do powlekania. Laminina lub płodowa surowica bydlęca (FBS) może być wykorzystana, aby pomóc komórkom przyczepić się do płytek.
  3. Liczba potrzebnych 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowej zależy od gęstości komórek, ponieważ każdy agregat powinien być w stanie rosnąć na płytce przez kilka kolejnych dni bez dotykania żadnej z pozostałych. Średnio komórki z jednej kolby T75 dadzą około 4-6 6-dołkowych płytek o wartości komórek.
    1. Jeśli używasz lamininy, rozcieńcz ją w NIM do 10-20 μg/ml, aby pokryć płytkę 6-dołkową (~0,5 ml/dołek). Po powlekaniu przez 2-3 godziny, komórki płytkowe agregują się na płytkach 6-dołkowych (~20-30 agregatów na dołek). Po połączeniu kruszyw dodać 1,5 ml NIM.
    2. W przypadku stosowania FBS należy przygotować mieszaninę 90% NIM i 10% FBS (1,5 ml/dołek). Dodać 1,5 ml pożywki z komórkami do każdego dołka, delikatnie potrząsać płytką w przód i w tył, aby rozprowadzić agregaty, i pozwolić komórkom przyłączyć O/N w inkubatorze. Pamiętaj, aby zmienić pożywkę (2 ml / studzienkę NIM) następnego ranka, aby usunąć FBS.
  5. Po dniu lub dwóch powlekania każde kruszywo rozłoży się, tworząc monowarstwę. W ciągu kilku dni środki większości tych komórek będą morfologicznie wyglądać podobnie do komórek kolumnowych (wydłużone). W tym okresie należy zmieniać NIM co drugi dzień. Niektóre linie PSC (zwłaszcza iPSC) mogą mniej efektywnie tworzyć komórki kolumnowe. Jeśli tak się stanie, pomocne może być dodanie inhibitorów BMP i TGF (Dorsomorphin29, SB43154219 przy 2 μM) w stadium 2.
  6. Około 14-17 dni komórki kolumnowe będą wydawać się bardziej zwarte. Czasami komórki te tworzą grzbiety lub pierścienie z widocznym światłem w środku. Oprócz morfologii kolumnowej, komórki na tym etapie wyrażają markery neuronabłonkowe, takie jak PAX6 i SOX112,26.
  7. Przed rozpoczęciem izolacji należy najpierw zbadać komórki, aby ustalić, czy obecne są w nich komórki nieneuronabłonkowe. Obiektywny marker może być wykorzystany do wskazania kolonii nieneuronabłonkowych. Można je następnie wyeliminować, zeskrobując je końcówką do pipety.

3. Generacja przodków kresomózgowia (D17-D24)

  1. Centra kolonii zawierają komórki neuronabłonkowe i powinny być odizolowane od reszty kolonii. Można to zrobić za pomocą mikropipety i sterylnej końcówki do pipety z filtrem o pojemności 1 ml. Kiedy na środkową część kolonii wywiera się niewielki nacisk, na ogół unosi się ona dość łatwo. Uważaj, aby zewnętrzna część kolonii również się nie oderwała. Jeśli kłęby są uparte i nie odpadną samoistnie, można je usunąć, wycinając je za pomocą igły pod mikroskopem w sterylnym kapturze. Przenieś środkowe porcje kolonii do probówki o pojemności 15 ml i wiruj w masie 200 x g przez 2 minuty.
  2. Pożywkę należy odessać z komórek. Dwie płytki z komórkami można następnie przenieść do kolby T25 poddanej działaniu kultury nietkankowej zawierającej 10 ml NIM z dodatkiem witaminy B27 (bez witaminy A, 1:50). Użyj 5-10 ml pożywki na jedną płytkę komórek.
  3. Kiedy komórki są oglądane następnego dnia, powinny mieć wygląd przypominający kulę. Konieczne jest przeniesienie tych komórek do nowej kolby (w obecności NIM i B27, 1:50), ponieważ często to właśnie komórki obwodowe wkradają się i przyczepiają do dna kolby.
  4. Neurosfery powinny być następnie hodowane w zawiesinie przez tydzień przy użyciu NIM uzupełnionego witaminą B27 (1:50). W celu zwiększenia wytrzymałości i proliferacji komórek, cykliczny AMP (cAMP, 1 μM) oraz insulinowy czynnik wzrostu (IGF1, 10 ng/ml) mogą być dodawane do pożywki podczas hodowli zawiesinowej. W tym momencie neurosfery zawierają prekursory kresomózgowia (FOXG1+) i są gotowe do posiewu na szkiełkach nakrywkowych w celu końcowego różnicowania.

4. Dalsze różnicowanie do neuronów kresomózgowia (D25+)

    1. Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poliornityną/lamininą (na płytkach 24-dołkowych) do posiewu komórek. Szkiełka nakrywkowe są najpierw czyszczone, a następnie powlekane ornityną (w stężeniu 0,1 mg/ml, 37 °C, O/N, i przechowywane w zamrażarce).
      Powłoka poliornitynowa:
      1. Wysterylizuj szkiełka nakrywkowe: Umieść szkiełka nakrywkowe w zlewce z kwasem azotowym i delikatnie wstrząsaj w wyciągu przez godzinę. Wylej kwas azotowy, spłucz kilkakrotnie wodą demineralizowaną i pozostaw szkiełka nakrywkowe pod bieżącą wodą demineralizowaną na co najmniej 15 minut. Umieść szkiełka nakrywkowe w 95% etanolu i wstrząsaj przez 30 minut (jeśli używasz natychmiast) lub przechowuj w etanolu w temperaturze pokojowej.
      2. W sterylnym kapturze wylać zawartość 50 ml probówki zawierającej wysterylizowane szkiełka nakrywkowe do pokrywki płytki 6-dołkowej. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy zbieraj po jednym szkiełku nakrywkowym na raz i ustaw pionowo w jednym dołku na 24-dołkowej płytce. Powtórz tę czynność, aby każda studzienka miała szkiełko nakrywkowe.
      3. Po całkowitym wyschnięciu stukaj w płytki, aż szkiełka nakrywkowe opadną płasko w każdym dołku. Następnie dodać 100 μl poliornityny (0,1 mg/ml w sterylnym dH2O) do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.
      4. Następnego dnia wyjmij płytki z inkubatora i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Odessać poliornitynę z każdego szkiełka nakrywkowego (od krawędzi szkiełka nakrywkowego), uważając, aby nie dotknąć ani nie zarysować szkiełek nakrywkowych w tym procesie. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na około 30 minut przed praniem.
      5. Dodać 1 ml sterylnego dH2O do każdej studzienki, odstawić na 10 minut i odessać wodę z każdej studzienki. Powtórz ten krok prania jeszcze dwa razy. Po całkowitym wyschnięciu płytek (pozostaw pokrywki w kapturze) nałóż pokrywki, przykryj folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C.
      1. Aby pokryć szkiełka nakrywkowe lamininą, należy dodać 50 μl mieszaniny pożywki różnicującej neuronalnej i lamininy (końcowe stężenie 20 μg/ml) do każdego szkiełka nakrywkowego poddanego działaniu poliornityny, uważając, aby płyn dotykał tylko samego szkiełka nakrywkowego (i nie rozlewał się). Inkubować je w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny przed przygotowaniem komórek do przyłączenia.
  2. Zebrać i odwirować neurosfery w stężeniu 200 x g przez 2 minuty w probówce o pojemności 15 ml. Odessać supernatant.
    1. Przepłucz komórki za pomocą DMEM-F12 i ponownie odwiruj komórki. Jeśli neurosfery są zbyt duże, aby prawidłowo się przyłączyć, na tym etapie można je zdysocjować za pomocą Accutazy.
    2. W przypadku stosowania Accutase: Po umyciu komórek DMEM-F12, neurosfery są dysocjowane na małe skupiska poprzez dodanie Accutazy (~ 2 ml) i inkubację komórek w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Następnie dodaj taką samą ilość inhibitora trypsyny (~2 ml) i odwiruj komórki w stężeniu 200 x g przez 3 min. Komórki należy następnie ponownie zawiesić w NDM i rozbić za pomocą pipety P200. Małe grona można następnie pokryć na wstępnie powlekanych szkiełkach nakrywkowych.
  4. Odessać większość pożywki i umieścić komórki na 6-centymetrowej szalce Petriego w kilku kroplach pożywki, aby ich wybór stał się łatwiejszy. Dodaj około 4-5 neurosfer do każdego wstępnie pokrytego szkiełka nakrywkowego. Nie ma potrzeby uprzedniego odsysania lamininy.
  5. Pozwól neurosferom przyczepić się przez co najmniej 2-4 godziny. Po ich dobrym utrwaleniu należy dodać więcej podłoża (0,5 ml/szkiełko nakrywkowe). Powinien składać się z pożywki różnicującej neuronalnej uzupełnionej witaminą B27 (1:50), cAMP (1 μM) i czynnikami neurotroficznymi (BDNF, GDNF i IGF, wszystkie w stężeniu 10 ng / ml). W tym momencie połowa pożywki może być wymieniana co drugi dzień, a komórki te mogą być utrzymywane przez kilka miesięcy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj protokół różnicowania ludzkich PSC na neurony glutaminergiczne kresomózgowia poprzez kilka kluczowych etapów: tworzenie agregatów PSC, indukcję komórek neuroepitelialnych, generowanie komórek progenitorowych kresomózgowia i końcowe różnicowanie tych progenitorów w neurony telecefaliczne (Rysunek 1) został opisany. System ten jest solidny i wydajny w generowaniu komórek progenitorowych kresomózgowia i neuronów glutaminergicznym. Na przykład (ryc. 2), bez dodawania czynników kaudaliz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W procesie różnicowania neuronalnego występuje kilka krytycznych etapów. Ważne jest, aby upewnić się, że ludzkie PSC są pluripotencjalne, ponieważ w przeciwnym razie komórki mogą być już skłonne do stania się linią nieneuronalną. Można to potwierdzić poprzez barwienie ludzkich PSC przeciwciałami przeciwko markerom pluripotencji, takim jak Oct4, Sox2, Nanog i Tra-1-60 1-3. Jeśli ludzkie PSC nie przyczepiają się zbyt dobrze po ich pasażowaniu, można dodać inhibitor ROCK (Y27632), aby pomóc. Dla tych, którzy mają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Y. Sasai za hojne dostarczenie przeciwciała FOXG1. Prace te były wspierane przez Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC-022 i 11-SCB24) oraz Spastic Paraplegia Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco z mieszanką składników odżywczych F12 (DMEM/F12)Gibco11330-032
Zamiennik serum nokautującegoGibco10828-028
L-glutamina (200 mM)Gibco25030
Aminokwasy endogenneGibco1140-050
2-Mercapt– tanol (14,3 M)SigmaM-7522
Pożywka neuropodstawowaGibco21103-049
N2Gibco17502-048
B27Gibco12587-010
HeparynaSigmaH3149
Bromowodorek poli-L-ornityny (poliornityna)Sigma116K5103
Laminina (człowiek)SigmaL-6274
Laminin (mysz)Invitrogen23017-015
FBSGemini100-106
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA-7906
DispaseGibco17105-041
CollagenaseInvitrogen17104-019
AccutaseInnovative Cell TechnologieAT104
ROCK InhibitorStemgent04-0012
SB431542Stemgent04-0010
DorsomorphinStemgent04-0024
Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2, bFGF)Invitrogen13256-029
Inhibitor trypsynyGibco17075
0,1% żelatynyPrzeciwciało MilliporeES-006-B
Foxg1Przeciwciało Dr. Y. Sasai
Hoxb4 (1:50)Badania rozwojowe Przeciwciało Hybridoma BankI12
Pax6 (1:5000)Badania rozwojowe Przeciwciało Hybridoma BankPAX6
Nkx2.1 (1:200)ChemiconMAB5460
Przeciwciało Tbr1 (1:2000)ChemiconPrzeciwciało AB9616
vGLUT1 (1:100)Systemy synaptyczne135302
Czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF)PrepoTech Inc.450-02
Neurotroficzny czynnik glejowy (GDNF)PrepoTech Inc.450-10
Insulinowy czynnik wzrostu 1 (IGF1)PrepoTech Inc.100-11
Cykliczny AMP (cAMP)SigmaD-0260
Jeż Soniczny (SHH)R& D1845-SH
Probówki 50 mlBecton Dickinson (BD)352098
Probówki 15 mlBD352097
płytki 6-dołkoweBD353046
24-dołkoweKolby BD353047
T25 (niepoddane obróbce)Kolby 353009
T75 (niepoddane obróbce)BD353133
Szkiełka nakrywkoweChemiglass Life Sciences1760-012
6 cm szalki PetriegoBD353004
Pipety szklane 9''Fisher13-678-20D
Filtry Steriflip (0,22 μ M)Filtry MilliporeSCGP00525
Stericup 1,000 ml (0,22 μ M)MilliporeSCGPU10RE
fazowy (Obserwator A1)ZeissR2625
(Hera Cell 150)Thermo Electron Corporation
(Sterilgard III Advance)Wirówka Baker Company
(5702 R)Eppendorf
Mikroskop kontrastowy Inkubator dwutlenku węgla Kaptur bezpieczeństwa biologicznego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853(2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Medium do indukcji neuronalnejkom rki neuroepitelialnetworzenie neurosferr nicowanie neuron w glutaminergicznychekspresja FoxG1marker TBR1ekspresja VGLUT1analiza immunobarwienia

Powiązane artykuły