Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Podsumowanie

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Streszczenie

Szybka i skuteczna diagnostyka odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu chorób zakaźnych, umożliwiając skuteczne zarządzanie i leczenie pacjentów. W tym miejscu prezentujemy zintegrowany mikroprzepływowy chip termoplastyczny ze zdolnością do amplifikacji wirusa grypy A w wymazach z nosogardzieli (NP) i aspiratach pacjenta. Po załadowaniu próbki pacjenta, urządzenie mikroprzepływowe sekwencyjnie przeprowadza etapy lizy komórek na chipie, oczyszczania i zatężania RNA w ramach ekstrakcji do fazy stałej (SPE), odwrotnej transkrypcji (RT) i reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w komorach RT-PCR. Wykrywanie punktów końcowych odbywa się za pomocą bioanalizatora poza chipem (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). W przypadku urządzeń peryferyjnych użyliśmy pojedynczej pompy strzykawkowej do napędzania odczynnika i próbek, podczas gdy dwie grzałki cienkowarstwowe zostały użyte jako źródła ciepła dla komór RT i PCR. Chip został zaprojektowany tak, aby był jednowarstwowy i odpowiedni do produkcji o wysokiej przepustowości w celu skrócenia czasu i kosztów produkcji. Chip mikroprzepływowy stanowi platformę do analizy szerokiej gamy wirusów i bakterii, ograniczoną jedynie zmianami w konstrukcji odczynników potrzebnymi do wykrywania nowych patogenów.

Wprowadzenie

Miliony zgonów zostały zgłoszone podczas trzech pandemii grypy w XX wieku¹. Co więcej, ostatnia pandemia grypy została ogłoszona przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) ² w 2009 roku, a na dzień 1 sierpnia 2010^{roku WHO poinformowała} o 18 449 zgonach3. Pandemia ta po raz kolejny pokazała wysokie obciążenie chorobami zakaźnymi oraz potrzebę szybkiego i dokładnego wykrywania grypy, aby umożliwić szybkie potwierdzenie choroby, odpowiednią reakcję w zakresie zdrowia publicznego i skuteczne leczenie⁴.

Istnieje kilka metod powszechnie stosowanych do diagnozowania grypy, w tym szybkie testy immunologiczne, bezpośrednie testy antygenowe (DFA) i metody hodowli wirusów. Szybkie testy immunologiczne dramatycznie tracą czułość^5-8, podczas gdy pozostałe dwie metody są pracochłonne i czasochłonne⁹. Testy molekularne oferują wiele korzyści, w tym krótki czas realizacji, wysoką czułość i wyższą swoistość. Kilka podmiotów komercyjnych pracuje nad szybkimi testami molekularnymi (zwanymi również testami kwasów nukleinowych lub NAT) na choroby zakaźne, a kilka z nich ma w planach testy na grypę. Jednak większość z nich wymaga przygotowania próbki poza chipem. Żadna z poprawek do Clinical Laboratory Improvement Improvement (CLIA) nie uchyla testów molekularnych zawierających przygotowanie próbki w kartridżu lub module testowym.

Technologia lab-on-a-chip odgrywa ważną rolę w rozwoju urządzeń do testowania w miejscu opieki nad pacjentem. Po wprowadzeniu pierwszego chipa PCR w 1993 r.¹⁰ włożono wiele wysiłku w opracowanie chipów do testowania kwasów nukleinowych. Jednak tylko kilka z nich zintegrowało przygotowanie próbek surowych z dalszym wzmacnianiem.

Wcześniej pokazaliśmy miniaturyzację kolumny do ekstrakcji fazy stałej (SPE) w plastikowy chip mikroprzepływowy¹¹ oraz rozwój i optymalizację chipa do PCR o ciągłym przepływie¹². W tym miejscu rozszerzamy wcześniejsze prace, aby zintegrować SPE z krokami RT i PCR w jeden chip do diagnostyki klinicznej i wykazać jego zdolność do amplifikacji kwasów nukleinowych z wymazów z nosogardzieli (NP) i aspiratów pacjenta.

Protokół

1. Produkcja chipów¹²

1. Przygotuj dwie blaszki z granulek Zeonex 690R: rozprowadź 8-9 gramów granulek Zeonex równomiernie na środku metalowej płytki, podgrzej na rozgrzanej prasie w temperaturze 198 °C przez 5 minut, a następnie powoli naciskaj do 2,500 psi przez kolejne 5 minut. Aby wykonać ten krok, użyliśmy gorącej prasy Carver.
2. Wytłocz kanał mikroprzepływowy w płytce za pomocą formy epoksydowej. Szczegóły dotyczące produkcji formy przedstawiono w innym miejscu¹² (projekt kanału na rysunku 2b): umieść jedną tabliczkę na formie epoksydowej; Podgrzej je na rozgrzanej prasie w temperaturze 157 °C przez 10 minut, a następnie powoli dociśnij do 1 000 psi przez kolejne 10 minut. Usuń płytkę nazębną z formy ręcznie lub za pomocą szczypiec, zanim ostygnie. (Uwaga: podczas tego kroku noś rękawice termiczne.)
3. Wywierć otwory w wytłoczonym wiórze na wlocie, króćcu odpływowym i wylocie kanału mikroprzepływowego. Do wykonania trzech otworów użyliśmy wiertła o średnicy 1,25 mm.
4. Połącz wytłoczony chip z inną płytką (na górze): Umyj frytki kolejno IPA, RNAse Away i wodą dejonizowaną; Wysuszyć je na powietrzu i podgrzać na rozgrzanej prasie w temperaturze 131 °C przez 10 minut, a następnie prasować pod ciśnieniem 350 psi przez kolejne 10 minut.
5. Przymocuj nanoporty na portach wlotowych, odpływowych i wylotowych oddzielnie za pomocą żywicy epoksydowej J-B Weld; Utwardzaj przez 15 do 24 godzin zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Przepłukać kanał SPE 50 μl RNAse Away, a następnie 100 μl wody wolnej od nukleaz.
7. Załadować kanał SPE 4 μl roztworu do szczepienia (metakrylan metylu z 3% w/v benzofenonu), a następnie usieciować metakrylan przez inkubację przez 10 minut w piecu UV przy długości fali UV 365 nm i 2,000 mJ/^cm2. Usuń resztki roztworu do szczepienia za pomocą próżni. Użyliśmy odkurzacza ściennego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć świeżego roztworu. Zazwyczaj dopuszczalne jest jednak przechowywanie przygotowanego roztworu w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
8. Przygotować roztwór kolumny SPE (wszystkie v/v %): 16% dimetakrylanu etylenu, 24% metakrylanu butylu, 42% 1-dodekanolu, 18% cykloheksanolu i dodać 1% 2-dimetyloamino-4-(metylo-fenyloamino)-fenol jako fotoinicjator.
9. Wyjąć taką samą objętość roztworu mikrosfer krzemionki jak roztwór kolumny SPE (w celu uzyskania mieszaniny 1:1) i całkowicie wysuszyć w temperaturze 70 °C przez noc w piecu próżniowym. Rozdrobnij granulkę, stukając w rurkę przy zamkniętej pokrywie. Dodaj roztwór kolumny SPE do wysuszonej probówki z mikrosfery krzemionki i odwiruj do wymieszania.
10. Załaduj 4 μl roztworu SPE do tego samego kanału, a następnie usieciuj go za pomocą promieniowania UV przez 2,5 minuty. Następnie odwróć chip i naświetlaj przez kolejne 2,5 minuty. Spolimeryzowana kolumna SPE powinna być nieprzezroczystym białym ciałem stałym.
11. Przemyj kanał 500 μl 100% metanolu, aby wypłukać nadmiar reagentów. To płukanie usuwa również wewnątrzpolimerowe rozpuszczalniki porogenne, tworząc w ten sposób otwartą strukturę porów kolumny SPE po wysuszeniu w warunkach otoczenia.
12. Przymocuj dwie cienkowarstwowe grzałki do dolnej części chipa za pomocą taśmy termoprzewodzącej. Boki grzejników należy wyrównać z krawędzią szerokich kanałów w celu oddzielnej denaturacji i wyżarzania (patrz rysunek 1).
13. Umieść pięć termopar w chipie przez ślepe zaułki otwartych kanałów bocznych każdego chipa (patrz rysunek 2b). Termopary pozostają w tych kanałach poprzez pasowanie wtłaczane. Taśma została użyta do dalszego ustalenia położenia termopar.

2. Metoda ekstrakcji do fazy stałej

1. Przygotuj 96 μl 70% etanolu z wodą podprowadzoną DEPC i autoklawowaną (dejonizowaną lub filtrowaną przez milipory).
2. Dodaj 4 μl 25X RNA Secure do 96 μl 70% etanolu w jednej probówce i zduplikuj tę samą mieszaninę ze 100% etanolem w osobnej probówce.
3. Przygotuj 300 μl buforu kanałowego, mieszając następujące elementy: 75 μl 6 M tiocyjanianu guanidyny (GuSCN), 150 μl 2-propanolu, 63 μl wody wolnej od nukleaz i 12 μl 25X RNA Secure.
4. Przygotuj 312 μl buforu do lizy przez zmieszanie: 100 μl 6 M GuSCN, 200 μl 2-propanolu i 12 μl 25X RNA Secure.
5. Podgrzewaj 70% etanol, 100% etanol, bufor kanałowy i do lizy w temperaturze 60 °C przez 10-20 minut, aby aktywować RNA Secure.
6. Aby zrównoważyć kanał mikroprzepływowy, należy przepuścić bufor kanału przez kanał SPE z natężeniem przepływu 0,8 ml/h.
7. Badaną próbkę należy szybko rozmrozić w VTM w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej i natychmiast po rozmrożeniu usunąć próbkę z łaźni wodnej.
8. Odwirować próbkę z prędkością 13 000 obr./min przez 10 minut i przenieść 100 μl supernatantu do 300 μl buforu do lizy. Uzupełnić mieszaninę, dodając 6 μl nośnego RNA o wielkości 1 μg/μl.
9. Wiruj do wymieszania, a po wirowaniu przez 5 sekund załaduj cały lizat do strzykawki Luer-lok o pojemności 1 cm3.
10. Przepuścić lizat przez kanał SPE z natężeniem przepływu 0,8 ml/godz.
11. Przemyj kanał SPE 100 μl 70% etanolu, a następnie 100 μl 100% etanolu w ilości 1 ml / godz. (W końcówce strzykawki znajduje się 50 μl martwej objętości, która nie zostanie wypchnięta, więc w rzeczywistości tylko 50 μl przechodzi przez kanał).
12. Umieścić pustą strzykawkę w miejscu oznaczenia 0,5 ml i przepuścić powietrze przez kanał, aby wysuszyć ją z prędkością 1 ml/h.
13. Przepuść 67,5 μl wody wolnej od nukleaz przez kanał, aby wymyć związane kwasy nukleinowe z prędkością 0,5 ml/godz. i zbierz 13,5 μl z nanoportu w porcie odpadowym. (Utrata płynu jest spowodowana 54 μl martwej objętości w końcówce strzykawki i kanale SPE).

3. RT-PCR

1. Przygotować 36,5 μl głównej mieszanki RT-PCR podczas etapu suszenia na powietrzu (2.12) przy użyciu odczynników znajdujących się w zestawach Qiagen OneStep RT-PCR.
2. Załaduj odczynnik RT-PCR do nanoportu w porcie odpadów i wymieszaj z RNA, aby uzyskać następującą reakcję RT-PCR o objętości 50 μl: 13,5 μl eluowanego RNA w wodzie wolnej od nukleaz, 4 μl mieszaniny enzymów RT-PCR, 10 μl roztworu Q, 10 μl1X jednoetapowy bufor, 2 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl 50 μM starter forward 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3', 1 μl 50 μM reverse primer 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3', 2 μl dNTP, 0,75 μl 1,0% w/v BSA, 0,73 μl PEG8000 i 5,02 μl wody wolnej od nukleaz.
3. Załaduj mieszaninę RT-PCR do kanału RT za pomocą delikatnego podciśnienia (użyliśmy odkurzacza ściennego) i uszczelnij Nanoport zamkniętą złączką.
4. Zastosuj 35 V do grzałki 1. Przechowywać odczynniki w kanale RT przez 30 minut po osiągnięciu równowagi grzałki 1 w temperaturze 50 °C. Przechowywać odczynniki w kanale RT przez 15 minut po osiągnięciu równowagi grzałki 1 w temperaturze 95 °C.
5. Zastosować 27 V do grzałki 1 i 50 V do grzałki 2, odczekać około trzech minut lub do momentu, gdy grzałka 1 osiągnie równowagę w temperaturze 60 °C, a grzałka 2 osiągnie równowagę w temperaturze 95 °C.
6. Wepchnij odczynniki do kanału PCR w tempie 0,5 μl /min. Powinno minąć około 20 minut, zanim odczynniki przepłyną przez kanał serpentynowy.
7. Gdy próbka dotrze do końca kanału serpentynowego, należy zebrać produkty PCR na wylocie za pomocą pipetora i końcówki o odpowiedniej wielkości.

4. Wykrywanie produktów PCR

1. Do wykrywania produktów używamy testu DNA Agilent High Sensitivity. Aby uruchomić ten test, wyjmij zestaw Agilent High Sensitivity DNA Kit z lodówki na 30 minut przed badaniem.
2. Włącz Bioanalyzer i otwórz oprogramowanie 2100 Expert.
3. Załaduj 1 μl produktów PCR do testu i postępuj zgodnie z protokołem Agilent (http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf).
4. Analizuj i rejestruj dane.

Wyniki

Typowy wynik dla próbki z płukania nosogardzieli zakażonej wirusem grypy A przedstawiono na Rysunku 3. Ze względu na różną ilość wirusa grypy w próbkach poszczególnych pacjentów, końcowe stężenie produktu PCR będzie się różnić. Dobry wynik dla próbki dodatniej powinien charakteryzować się niskim poziomem szumów, dwoma wyraźnymi pikami drabinki (35 i 10380 bp) oraz pojedynczym pikiem produktu o zaprojektowanej wielkości (107 bp). Choć w kontrolach ujemnych pik produktu teoretycznie nie powinien wystąpić, ...

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda diagnostyczna wykazała zdolność zintegrowanego mikroprzepływowego chipa z tworzywa sztucznego do amplifikacji RNA grypy A z próbek pacjentów o wysokiej swoistości i niskiej granicy wykrywalności. ¹³ Zaprojektowaliśmy ten chip do potencjalnych testów w miejscu opieki nad pacjentem: (a) kontrola temperatury i płynności została uproszczona, (b) chip jest tani i nadaje się do produkcji o wysokiej przepustowości przy użyciu formowania wtryskowego, oraz (c) chip jest jednorazowy i przeznac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-dodekanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	443816-500G
2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenon	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	196118-50G
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	G2943CA
2-Propanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	19516
Benzofenon	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	239852-50G
BSA	Thermo Fisher Scientific, Pittsburge, PA	A7979-50ML
Metakrylan butylu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	235865-100 ml
Nośnik RNA	Qiagen, Walencja, CA	1017647
Cyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	105899-1L
Etanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Dimetakrylan etylenu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	335861
Dimetakrylan glikolu etylenowego	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	335681-100ML
Szklana strzykawka 250 μ l	Hamilton, Reno, NV	81127
Tiocyjanian guanidyny	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	50981
Zestaw DNA o wysokiej czułości	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	5067-4626
Rzeźbiarka na gorąco	, Wabash, IN	4386
Epoksydy spawalnicze J-B	Mcmaster-Carr, Elmhurst, IL	7605A11
Strzykawki Luer-Lok	BD-Medical, Franklin Lakes, NJ	309628
Chlorek magnezu	Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA	AB-0359
Metanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	494437
Metakrylan metylu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M55909
Nanoport	Upchurch Scientific	N-333-01
Nanoport Montaż	Upchurch Scientific	F-120x
Woda wolna od nukleaz	Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA	PR-P1193
Zestaw OneStep RT-PCR	Qiagen, Walencja, CA	210210
PEG8000	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	41009
Zasilacz	VWR, Radnor, PA	300V
RNAse Away	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	83931-250ML
RNASecure	Applied Biosystems, Foster City, CA	AM7005
Mikrosfery krzemionkowe	Polysciences, Warrington, PA	24324-15
Pompa strzykawkowa	Aparat Harvard, Holliston, MA	HA2000P/10
Taśma przewodząca ciepło	Mcmaster-Carr, Elmhurst, IL	6838A11
Termopara	Omega Engineering, Stamford, CT	5SRTC-TT-J-40-36
Grzejniki cienkowarstwowe	Minco, Minneapolis, MN	HK5166R529L12A
Ultraviolet	Crossreder UPV, Upland, CA	CL-1000
Zeonex	Zeon Chemicals, Louisville, KY	690R