Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

Istnieje ogromne zapotrzebowanie na lepsze systemy do modelowania raka prostaty przez ludzi. W szczególności niezwykle pouczające byłyby odpowiednie ludzkie systemy modelowe normalnych, niezłośliwych tkanek prostaty, które mogą być genetycznie manipulowane w celu bezpośredniego rozpoznania roli określonych genów w inicjacji raka prostaty. Nadejście ery genomicznej zidentyfikowało liczne geny, które mogą odgrywać rolę w powstawaniu raka. Brak eksperymentalnych systemów modelowych dla ludzi poważnie osłabia jednak naszą zdolność do funkcjonalnego testowania i charakteryzowania genów podatności na raka prostaty. Idealny system modelowy ułatwiłby szybkie i szybsze analizy funkcjonalne genów podatności na raka w połączeniu z odpowiednimi transgenicznymi systemami modelowymi gryzoni. Co więcej, taki ludzki system modelowy umożliwiłby molekularną charakterystykę mechanizmów sygnalizacyjnych kancerogenezy prostaty w kierunku odkrycia i walidacji nowych terapii zapobiegających powstawaniu raka prostaty.

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) są zdolne do tworzenia ludzkich tkanek prostaty jako ksenoprzeszczepy. W 2006 roku Taylor i wsp. donieśli, że hESC mogą być indukowane do tworzenia nabłonka gruczołu krokowego in vivo po ponownym połączeniu z mezenchymą zatok moczowo-płciowych (UGSM) gryzoni w okresie 8-12 tygodni. ¹ Badania te opierały się na wcześniejszych pracach laboratorium Cunha, które wykazały, że embrionalny UGSM gryzoni może sprzyjać różnicowaniu komórek macierzystych i populacji komórek nabłonka zarodka in vivo. ^2,3 Gruczoł krokowy rozwija się z zarodka zwanego zatoką moczowo-płciową (UGS), a przed 17. dniem embrionalnym (mysz E17; dzień E18 u szczura) UGS może zostać usunięty i fizycznie podzielony na nabłonek (UGSE) i mezenchymę (UGSM). ⁴ To podejście oparte na rekombinacji tkanek znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat rozwoju i kancerogenezy prostaty, w szczególności czynnika wzrostu i hormonalnych szlaków sygnałowych oraz relacji molekularnych między zrębem prostaty a nabłonkiem. ^5-8 Metoda ta polega na połączeniu ex vivo PMGS z komórkami macierzystymi lub nabłonkowymi tego samego lub odrębnego gatunku, a te rekombinanty komórkowo-tkankowe są wszczepiane i hodowane oraz ksenoprzeszczepy w organizmie gospodarza myszy. ^4,9 Po okresie wzrostu in vivo implant zawiera struktury gruczołowe nabłonka gruczołu krokowego osadzone w tkance zrębu. Można przeprowadzić dalsze barwienie, aby ustalić, czy takie struktury są naprawdę prostaty i są pochodzenia ludzkiego. ^10,11

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, numery protokołów 72066 i 72231). Wszystkie operacje przeprowadzano w znieczuleniu i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie. Ludzka linia embrionalnych komórek macierzystych WA01 (H1; Rejestracja NIH #0043) została uzyskana z WiCell (Madison, WI) i hodowana przy użyciu protokołu niezależnego od zasilania przy użyciu pożywek mTeSR1 (Stem Cell Technologies; Vancouver, Kolumbia Brytyjska). Komórki ES wykorzystano w ciągu dziesięciu przejść rozmrażania.

1. Izolacja zatoki moczowo-płciowej od zarodków myszy lub szczura

1. Poddaj eutanazji mysz w ciąży w czasie (dzień 17,5) lub szczura (dzień 18,5) poprzez wdychanie CO₂ przez 5 minut. Śmierć potwierdza się przez ustanie parametrów życiowych u szczura. Następnie skręć mu kark w sposób humanitarny. W tym momencie szczur zostaje poddany eutanazji. Spryskaj 70% etanolem, aby wysterylizować skórę brzucha i boki. Przetnij warstwę skóry brzucha i mięśni, a następnie przetnij macicę, oddziel zarodki szczura od worka owodniowego i przetnij pępowinę. Przenieś zarodki do 50 ml probówki Falcon zawierającej lodowaty roztwór soli Hanka (HBSS) i trzymaj na lodzie. Płody są poddawane eutanazji poprzez ścięcie głowy nożyczkami chirurgicznymi.
2. Umieścić zarodek na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Przeciąć zarodek na pół nożyczkami na poziomie pępka (ryc. 1A). Usuń żołądek i jelito cienkie. Ujawnij jajniki w zarodku żeńskim i jądra w zarodku męskim (ryc. 1B i 1C). (Jajniki znajdują się na biegunach ogonowych nerek. Jądra znajdują się w przybliżeniu na poziomie pęcherza moczowego). Na tym etapie rozwoju UGSM wyizolowany zarówno z zarodków męskich, jak i żeńskich jest zdolny do indukowania linii nabłonka gruczołu krokowego w obecności testosteronu gospodarza. ⁴ Jednak po tym okresie rozwoju pąki gruczołu krokowego zaczynają formować się w UGSM, a izolacja czystego UGSM jest bardzo trudna. ⁴
3. Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć ścianę brzucha w środkowej linii nożyczkami Vannas, aby odsłonić pęcherz moczowy i tylną ścianę brzucha. Uwolnić górne drogi rodne od przyczepów (w zarodkach męskich należy przeciąć moczowód, przewód Wolffa i przewód Müllera; w zarodkach żeńskich przeciąć moczowód i przewód Müllera). Uwolnij pęcherz moczowy z pępowiny. Przetnij kość łonową i tępo oddziel od przedniej ściany zatoki moczowo-płciowej za pomocą kleszczyków Dumont z cienką końcówką. Na koniec oddziel tylną ścianę zatoki moczowo-płciowej od odbytnicy. Przeciąć zatokę moczowo-płciową z pęcherzem moczowym na dolnym końcu (od cewki moczowej) i przechowywać zatokę moczowo-płciową en bloc (z pęcherzem) w lodowatym HBSS.

2. Oddzielenie mezenchymy zatoki moczowo-płciowej

1. Usunąć pęcherz moczowy z zatoki moczowo-płciowej pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 1D).
2. Przenieś zatokę moczowo-płciową do rurki sokoła zawierającej 1% trypsyny w HBSS wolnym od wapnia (^Ca2+) i magnezu (Mg²⁺). Umieścić probówkę w lodówce w temperaturze 4 °C na 75 minut.
3. Usuń trypsynę i zneutralizuj trypsynizację za pomocą 10% płodowej surowicy Bovin (FBS) w pożywce DMEM/F12.
4. Ostrożnie drażnij lepki rękaw mezenchymalny z rurki nabłonkowej za pomocą igły lub kleszczyków Dumonta z cienką końcówką (utrzymanie rurki nabłonkowej w stanie nienaruszonym zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia mezenchymy komórkami nabłonkowymi; może to spowodować tworzenie się gruczołów gryzoni wraz z ludzkim nabłonkiem gruczołowym pochodzącym z komórek macierzystych) (Ryc. 1D). ¹²
5. Przenieś UGSM do nowej probówki Falcon zawierającej pożywkę DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep; 0,5 mg/ml) + 1% aminokwasów endogennych (NEAA) plus 1nM R1881. Umieścić probówkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 przez} noc.
6. Odwirować tkankę przy sile 200 x g i odrzucić supernatant. Przemyć roztworem soli fizjologicznej z buforu fosforanowego (PBS) (nie naruszać osadu tkankowego).
7. Dodaj 0,2% kolagenazy (w DMEM/F12), aby ponownie zawiesić tkankę. Inkubować w temperaturze 37 °C z delikatnym kołysaniem przez 1 godzinę.
8. Energicznie trzykrotnie przemieszaj tkankę trawienną, aż stanie się jednorodną mieszaniną jednokomórkową i dodaj pożywkę DMEM/F12 + 10% FBS + 1% P/S + 1% NEAA + 1nM R1881, aby zneutralizować kolagenazę.
9. Odwirować przy 200 x g, a następnie przemyć przez ponowne zawieszenie komórek UGSM w HBSS i powtórzyć trzy razy, aby całkowicie umyć UGSM. Na koniec zawiesić komórki mezenchymalne w DMEM/F12 i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub urządzenia do liczenia komórek.
10. Dysocjacja komórek hES hodowanych przy użyciu protokołu bezpodajnego z pożywkami mTeSR1 (Stem Cell Technologies; Vancouver, Kolumbia Brytyjska) za pomocą trawienia Accutase (Millipore; Billerica, Massachusetts). Umyj komórki hES podczas logarytmicznej fazy ich wzrostu w ciepłym podłożu DMEM/F12, następnie dodaj ciepły 1x roztwór Accutase i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut, aż pojedyncze komórki zostaną równomiernie oddzielone od kolonii. Dodaj równą ilość 1x zdefiniowanego inhibitora trypsyny (Invitrogen; Grand Island, NY), aby zneutralizować Accutase i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby wymieszać i rozbić grudki komórek. Pipetować komórki do probówki wirówkowej i wirować przez 3 minuty przy 200 x g, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce DMEM/F12. Ponownie odwirować probówkę przez 3 minuty przy 200 x g i usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić w zimnym HBSS lub DMEM/F12 w żądanej objętości.
11. Dodaj komórki hES o stosunku 1:2,5 komórek hES/mezenchymalnych. ³ Będzie to skład komórkowy komórek 1E⁵ UGSM z 4E⁴ hESC na 10 ml wstrzyknięcia (pojedynczy UGS szczura zwykle daje około 2E⁶ komórek mezenchymalnych). Wirować przy 200 x g przez 5 minut, a następnie wyrzucić supernatant. Zawiesić ponownie z 75% Matrigelem (BD Biosciences, San Jose, CA; zmieszany z 25% zimnym HBSS dla łatwiejszej obsługi) i umieścić rurkę w lodzie w celu wstrzyknięcia kapsułki podnerkowej.

3. Przeszczepienie rekombinowanej tkanki pod torebkę nerkową

1. Przygotuj sterylne pole operacyjne.
2. Znieczulij samca nagiej myszy atymiczną ketaminą/ksylazyną i.p.; użyj świeżej mieszanki zawierającej stosunek 1:1:8 ketaminy:ksylazyny:soli fizjologicznej. Dawkowanie będzie wynosić 100 mg/kg ketaminy i 2,5 mg/kg ksylazyny. Zwierzęta, które nie reagują na szczypanie palcami, powinny znajdować się w pozycji całkowicie pod stopami przez 20-30 minut.
3. Chirurgicznie przygotuj mysz, goląc miejsce operowane (jeśli nie używasz nude myszy), oczyszczając je trzema naprzemiennymi chusteczkami z 70% alkoholem, a następnie roztworem betadyny i nakładając obłożenie chirurgiczne.
4. Nałóż maść nawilżającą do oczu (maść do oczu Altalume) na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
5. Podczas operacji monitorowane jest częstość oddechów i temperatura ciała myszy. Częstość oddechów powinna być stała i utrzymywać się w granicach 40-90 oddechów/min. Temperatura wewnętrzna ciała jest monitorowana poprzez obserwację koloru błon śluzowych i różowych podeszew stóp.
6. Wykonaj podłużne nacięcie skóry o długości 1,0 cm na plecach. Kontynuuj cięcie ściany brzucha w podłużnym nacięciu o długości 0,5 cm.
7. Delikatnie wyciśnij nerkę z brzucha i utrzymuj powierzchnię nerki wilgotną za pomocą kropli sterylnej soli fizjologicznej.
8. Delikatnie nakłuć torebkę nerkową za pomocą pustej igły strzykawkowej o rozmiarze 27G. Wystarczy bardzo płytkie nakłucie. Będzie to miejsce, w którym włożysz igłę, aby wstrzyknąć mieszankę komórkową.
9. Napełnij igłę strzykawki w rozmiarze 28 10 μl mieszaniny komórek. Powoli wprowadzić miejsce nakłucia i wniknąć w miąższ nerki, aby dotrzeć do obszaru pod torebką nerkową. Wstrzyknąć 10 μl mieszaniny komórkowej w celu utworzenia bolusa na nerce pod kapsułką nerkową. Wycofanie igły.
10. Zwróć nerkę do jamy brzusznej. Zabezpiecz warstwę mięśniową otrzewnej za pomocą nylonowych szwów 4-0.
11. Zamknij skórę za pomocą szwu lub zszywki.
12. Oczyść krew ze skóry za pomocą sterylnej soli fizjologicznej.

4. Analgezja pooperacyjna i monitorowanie

1. Wstrzyknąć zwierzęciu buprenorfinę (0,1 mg/kg co 12 godzin) lub ketoprofen (3-5 mg/kg w soli fizjologicznej co 12 godzin) w celu opanowania bólu pooperacyjnego oraz 1 ml soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C i.p., aby utrzymać zwierzę w cieple i zapobiec odwodnieniu.
2. Umieść zwierzę w czystej klatce i umieść je na łagodnej poduszce grzewczej.
3. Wyślij zwierzęta z powrotem do pokoju dla zwierząt, gdy odzyskają przytomność i będą poruszać się w klatce.
4. Obserwuj zwierzę codziennie pod kątem nieoczekiwanych objawów choroby i infekcji przez następne trzy dni. Myszy są monitorowane z obserwacją czynności w klatkach, w tym dostępu do jedzenia i wody, 1 dzień po operacji. Jeśli myszy wykazują mniejszą aktywność, Ketoprofen podaje się ponownie dootrzewnowo raz dziennie.
5. Usuń zszywki lub szwy skóry 2 tygodnie po zabiegu.
6. Tkanki ksenoprzeszczepu można pobrać już po 8 tygodniach od zabiegu. Ksenoprzeszczepy można obrazować in vivo za pomocą ultradźwięków małych zwierząt (ryc. 2A), a utrwalone tkanki można ciąć i barwić pod kątem różnych białek za pomocą immunohistochemii (ryc. 3).

Opierając się na ekscytującym raporcie Taylora i wsp., nasze laboratorium opracowało protokół szczepienia przy użyciu powszechnie używanej linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H1 (NIH-designated WA01, genetycznie męska). 1 Ta linia została rygorystycznie przetestowana pod kątem kontroli jakości i jest normalna kariotypowo. 13 Przy odpowiedniej hodowli komórki hES mogą być utrzymywane, ekspandowane i kriokonserwowane w stanie niezróżnicowanym i pluripotencjalnym przy użyciu metody hodowli bez karmienia (systemy bez karmienia dostępne na rynku za pośrednictwem technologii komórek macierzystych; Vancouver B.C.). 14 Nasz protokół wykorzystuje monokomórkowe zawiesiny hESC w połączeniu z jednokomórkowymi zawiesinami UGSM szczura E18 i wstrzykiwane pod kapsułkę nerkową dorosłych samców myszy z obniżoną odpornością. Jako ważna kontrola, USGM wszczepiony samodzielnie nie daje zauważalnego wzrostu, podczas gdy hESC wszczepione bez UGSM tworzą duże potworniaki (Figura 2B). 15 Z naszego doświadczenia wynika, że implantacja UGSM bez zanieczyszczenia komórek nabłonka szczura nigdy nie powoduje wzrostu tkanki, podczas gdy rekombinacja UGSM i hESC powoduje silny wzrost w ponad 80% przypadków (po 8 tygodniach rozmiary wahają się od 1 mm do 5 mm, przy czym ponad 80% tkanki zawiera nabłonek gruczołowy). W rekombinantach zawierających zarówno hESC, jak i UGSM wczesne tworzenie gruczołów obserwuje się po 4 tygodniach, a po 8 tygodniach w pełni uformowany tworzy się ludzki nabłonek gruczołu krokowego z dodatnim antygenem specyficznym dla prostaty (PSA) (ryc. 3). Gruczoły te zawierają komórki wydzielnicze luminalno-dodatnie z dodatnim receptorem androgenowym (AR), które nie są obecne tydzień po kastracji gospodarza. Co ważne, gruczoły te są dodatnie dla białka PSA specyficznego dla człowieka i prostaty. Dalsze barwienie dokumentuje, że takie ludzkie gruczoły wydają się być niezłośliwe, ponieważ nie wyrażają racemazy alfa-metylocylo-CoA (AMACR), która jest markerem specyficznym dla raka prostaty. 16

Rysunek 1. Izolacja zatoki moczowo-płciowej od zarodka szczura E18.5. ZA. E18.5 zarodek szczura. Biała ciągła linia wskazuje pozycję do przecięcia zarodka na pół. Ur. E18.5 zarodek samca szczura. Czarne przerywane linie wskazują pęcherz moczowy, zatokę moczowo-płciową, odbytnicę i rozwijające się jądra. C. E18.5 zarodek samicy szczura. Czarne przerywane linie wskazują pęcherz moczowy, zatokę moczowo-płciową i macicę. D. Pęcherz moczowy i zatoka moczowo-płciowa usunięte z zarodka szczura E18.5. Linia ciągła while wskazuje pozycję, w której należy wyjąć pęcherz. przerywana linia i biała strzałka wskazują rurkę nabłonkową. Biała strzałka wskazuje mezenchymę zatoki moczowo-płciowej.

Rysunek 2. Obrazowanie ultrasonograficzne i morfologia ogólna ksenoprzeszczepów tkankowych in vivo pochodzących z PMG i hESC. ZA. Obrazowanie ultrasonograficzne rosnących ksenoprzeszczepów pozwala na analizę żywych zwierząt w trakcie trwania eksperymentu. Obraz został wykonany 8 tygodni po operacji za pomocą ultrasonografii Vevo 2100 dla małych zwierząt (Visualsonics; Toronto, ON). Obszar zakreślony reprezentuje rosnący ksenoprzeszczep tkankowy na powierzchni nerki. Ur. W eksperymentalnym punkcie końcowym komórki hES w połączeniu z UGSM szczura (rUGSM) tworzą widoczną masę tkankową na powierzchni nerki (lewy panel); Komórki hES wszczepione samodzielnie tworzą duże potworniaki zgodnie z oczekiwaniami (panel środkowy); a sam PMGS nie tworzy żadnej dostrzegalnej struktury (prawy panel).

Rysunek 3. Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego z ludzkiej embrionalnej linii komórek macierzystych WA01(H1). Komórki ES zostały ponownie połączone z UGSM gryzoni i wszczepione pod torebkę nerkową nienaruszonych samców nagich myszy. Po okresie wzrostu wynoszącym 8 tygodni tworzy się ludzki nabłonek gruczołów gruczołowych prostaty, co udokumentowano za pomocą AR, p63 i barwienia PSA ograniczonego przez człowieka. Tydzień po kastracji gospodarza nie ma warstwy luminalnej AR-dodatniej, PSA-dodatniej, co dokumentuje charakterystyczną zależność od androgenów. Tkanki prostaty nie są złośliwe, o czym świadczy brak barwienia AMACR. Ponadto wykrywalne były komórki neuroendokrynne ChrA-dodatnie. Niezłośliwa ludzka tkanka prostaty została użyta jako kontrola dla AR, PSA i p63; guz gruczołu krokowego zastosowano jako pozytywną kontrolę dla AMACR specyficznego dla raka.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów z prezentowaną pracą.