Ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej

Podsumowanie

W miografii ciśnieniowej, nienaruszony mały fragment naczynia jest montowany na dwóch małych kaniulach i podbudowywany do odpowiedniego ciśnienia świetlnego. Tutaj opisujemy metodę pomiaru odpowiedzi wazorelaksacyjnej myszy tętnic krezkowych 3. rzędu u myszy c57 i sGCα₁^-/- myszy za pomocą miografii ciśnieniowej.

Streszczenie

Systemy miografu ciśnieniowego są niezwykle przydatne w ocenie funkcjonalnej małych tętnic, poddanych ciśnieniu do odpowiedniego ciśnienia przezściennego. Stan zbliżony do fizjologicznego osiągnięty w miografii ciśnieniowej pozwala na dogłębną charakterystykę wewnętrznych odpowiedzi na bodźce farmakologiczne i fizjologiczne, które można ekstrapolować na zachowanie łożyska naczyniowego in vivo. Miograf ciśnieniowy ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi miografami drutowymi. Na przykład mniejsze naczynia oporowe mogą być badane przy ściśle kontrolowanych i fizjologicznie istotnych ciśnieniach śródświetlnych. Tutaj badamy zdolność tętnic krezkowych^{3 rzędu (}o długości 3-4 mm), wstępnie zwężonych fenylefryną, do rozluźniania naczyń krwionośnych w odpowiedzi na acetylocholinę. Tętnice krezkowe są zamontowane na dwóch kaniulach połączonych z ciśnieniowym i szczelnym systemem, który jest utrzymywany pod stałym ciśnieniem 60 mmHg. Światło i zewnętrzna średnica naczynia są w sposób ciągły rejestrowane za pomocą kamery wideo, co pozwala na ilościowe określenie w czasie rzeczywistym zwężenia naczyń krwionośnych i wazorelaksacji w odpowiedzi odpowiednio na fenylefrynę i acetylocholinę.

Aby zademonstrować możliwość zastosowania miografii ciśnieniowej do badania etiologii chorób sercowo-naczyniowych, oceniliśmy funkcję naczyń krwionośnych zależną od śródbłonka w mysim modelu nadciśnienia układowego. Myszy z niedoborem podjednostki α₁ rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (sGCα₁^-/-) mają nadciśnienie, gdy znajdują się na tle 129S6 (S6) (sGCα₁^{-/- S6}), ale nie na tle C57BL / 6 (B6) (sGCα₁^-/-B6). Za pomocą miografii ciśnieniowej wykazujemy, że niedobór sGCα₁ powoduje upośledzenie wazorelaksacji zależnej od śródbłonka. Dysfunkcja naczyń krwionośnych jest bardziej wyraźna u sGCα₁^{-/- S6} niż u myszy sGCα₁^-/-B6, prawdopodobnie przyczyniając się do wyższego ciśnienia krwi u sGCα₁^{-/- S6} niż u myszy sGCα₁^{-/- B6}.

Miografia ciśnieniowa jest stosunkowo prostą, ale czułą i mechanistycznie użyteczną techniką, która może być wykorzystana do oceny wpływu różnych bodźców na skurcz i rozluźnienie naczyń krwionośnych, zwiększając tym samym nasz wgląd w mechanizmy leżące u podstaw chorób sercowo-naczyniowych.

Wprowadzenie

Systemy miografów ciśnieniowych są używane do pomiaru funkcji fizjologicznych i właściwości małych tętnic, żył i innych naczyń. Nienaruszony mały odcinek tętnicy lub żyły jest montowany na dwóch małych szklanych kaniulach i poddawany ciśnieniu do odpowiedniego ciśnienia świetlnego, co pozwala naczyniu zachować większość swoich cech in vivo (ryc. 1 i 2). Stan zbliżony do fizjologicznego na miografie ciśnieniowym odzwierciedla zachowanie łożyska naczyniowego in vivo, co pozwala na badanie wewnętrznych właściwości (np. tonu miogennego) izolowanych naczyń. Niektóre z zalet miografii ciśnieniowej w porównaniu z miografią drucianą, w której skurcz mięśni jest oceniany przez bezpośrednie sprzężenie mechaniczne z przetwornikiem siły ¹, obejmują (i) możliwość badania tętnic z mikrooporem, które definiują ogólny opór wytwarzany w układzie naczyniowym, podczas gdy miograf drutowy jest ograniczony do większych tętnic przewodowych, (ii) ryzyko uszkodzenia śródbłonka jest zmniejszone, ponieważ żadne przewody nie muszą być przewodzone przez światło naczynia, (iii) że naturalny kształt zbiornika jest lepiej zachowany, oraz (iv) że wymiary zbiornika mogą być badane w szerokim zakresie ciśnień lub naprężeń ścinających ².

Badanie mikronaczyń może być bardziej pouczające niż badanie większych tętnic przewodowych, aby pomóc zrozumieć patofizjologię i mechanizmy molekularne, które przyczyniają się do zmiany napięcia naczyniowego w chorobach sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie. Na przykład upośledzenie funkcji śródbłonka związane z karmieniem myszy dietą wysokotłuszczową przez 8 tygodni można wykazać w tętnicach krezkowych 2^. rzędu ³, ale nie w pierścieniach aortalnych (ryc. 3). Kolejną zaletą miografii ciśnieniowej jest to, że występuje wewnętrzne zwężenie miogenne naczynia ciśnieniowego oraz że można badać rolę i funkcję śródbłonka w tym zjawisku. W tym miejscu opisujemy zastosowanie miografu ciśnieniowego do badania reaktywności naczyniowej mysich tętnic oporowych krezki 3. rzędu w warunkach upośledzonej sygnalizacji tlenku azotu (NO)-cGMP.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu

1. 500X EDTA: zważyć 500 mg EDTA-Na₂•2H₂O i rozpuścić w 50 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Roztwór depolaryzujący KCl.
   1. Przygotować roztwór podstawowy K10X: 3,69 g NaCl, 18,64 g KCl, 0,36 g_MgSO4 bezwodny, 0,41 g KH₂PO₄, 0,46 g CaCl₂•2H₂O. Rozpuścić w 250 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
   2. Na 100 ml końcowego roztworu depolaryzującego KCl 1X: Rozpuścić 0,21 NaHCO₃, 0,18 g glukozy w 90 ml wody dejonizowanej. Dodać 10 ml roztworu podstawowego K10X. Dodać 95 μl 500X roztworu EDTA. Dobrze wymieszaj. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Zużyć w ciągu tygodnia.
3. Przygotuj świeży roztwór HEPES-PSS w dniu eksperymentu (na 1 litr).
   1. 6,96 g NaCl, 0,35 g KCl, 0,288 g MgSO₄•7H₂O, 0,1605 g KH₂PO₄, 2,38 g HEPES. Rozpuścić w 100 ml wody dejonizowanej. Oznaczyć jako kolbę A.
   2. 0,312 g CaCl₂•2H₂O. Rozpuścić w 100 ml wody dejonizowanej. Oznaczyć jako kolbę B.
   3. 1,25 g NaHCO₃, 0,991 g glukozy. Rozpuścić w 98 ml wody dejonizowanej. Oznaczyć jako kolbę C.
4. Dodać 2 ml 500X EDTA do kolby C. Weź 700 ml wody dejonizowanej do dużej kolby. Wlać zawartość kolby A, B i C do dużej kolby z ciągłym wirowaniem. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH.

2. Używane narkotyki

1. Fenylefryna (^10-2 M): Rozpuść 20,37 mg w 10 ml wody dejonizowanej. Podwielokrotność porcji 1 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Seryjnie rozcieńczyć do uzyskania ^10-3, ^10-4, ^10-5 i ^10-6 mol/l w dniu doświadczenia.
2. Acetylocholina (^10-2 M): Rozpuść 18,17 mg w 10 ml wody dejonizowanej. Podwielokrotność porcji 1 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Seryjnie rozcieńczyć do uzyskania ^10-3, ^10-4, ^10-5 i ^10-6 mol/l w dniu doświadczenia.

3. Myszy

Męskie myszy WT i sGCα₁^-/- na tle S6 i B6 były badane w trakcie tego badania. sGCα₁^-/- zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem ^4,5. Pomieszczenia i procedury z udziałem zwierząt doświadczalnych (myszy) zostały zatwierdzone przez Podkomitet ds. Opieki nad Zwierzętami Badawczymi Szpitala Ogólnego Massachusetts w Bostonie.

4. Pomiar reaktywności naczyniowej w tętnicy krezkowej

1. Poddaj myszy eutanazji pentobarbitalem (200 mg/kg, i.p.). Otwórz jamę brzuszną i wypreparuj tkankę krezkową. Wyizolować i wypreparować tętnicę krezkową^{3 rzędu} wolną od tkanki łącznej i tłuszczowej, a następnie umieścić tętnicę w lodowatym roztworze HEPES-PSS wstępnie zrównoważonym z 95% O₂ / 5% CO₂ przez 15 minut. Wytnij pierścienie o długości 2-3 mm bez rozgałęzień od tętnicy krezkowej. Różnicowanie tętnic i żył na poziomie mikronaczyń jest problematyczne, gdy w naczyniach nie ma krwi. Dlatego zalecamy zidentyfikowanie naczynia, gdy jest ono jeszcze nienaruszone u zwierzęcia przed jego wypreparowaniem.
2. Napełnij szklane kaniule w komorze miografu ciśnieniowego (DMT Model 110P&11P wersja 1.31, Rysunek 2) roztworem HEPES-PSS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przez zawory wlotowe i wylotowe. Napełnianie kaniuli powinno odbywać się delikatnie i ostrożnie, ponieważ nadmierny nacisk może uszkodzić delikatny przetwornik połączony z kaniulami. Po napełnieniu kaniul należy szczelnie zamknąć zarówno zawór wlotowy, jak i wylotowy.
3. Zamontuj jeden koniec naczynia na prawej kaniuli i ostrożnie zawiąż go jednym cienkim pasmem nylonowego szwu. Za pomocą strzykawki przepłukać i napełnić naczynie roztworem HEPES przez zawór wlotowy. Przyłóż lewą kaniulę bliżej naczynia i zamontuj na nim drugi koniec naczynia. Zawiąż go nylonowym szwem. Napełnij komorę do 10 ml roztworem HEPES. Sprawdź, czy nie ma wycieków, delikatnie przepychając roztwór HEPES przez zawór wlotowy za pomocą strzykawki.
4. Zamontuj komorę na miografie i pod kamerą wideo. Uruchomić dopływ tlenu i ciepła (37 °C) w komorze. Połączyć zawór wlotowy z rurką P1 z pierwszego zbiornika roztworu HEPES, gdy zawór jest zamknięty. Pozwól, aby wszelkie pęcherzyki i roztwór przeszły przez probówkę, aż w probówce nie będzie pęcherzyków. Otwórz zawór.
5. Połączyć lewy zawór komory z rurką P2 pochodzącą z regulatora ciśnienia. Ponownie sprawdź, czy nie ma bąbelków. W całym systemie nie powinno być żadnych pęcherzyków ani wycieków.
6. Przejdź do menu ciśnienia na panelu myo-interface lub w oprogramowaniu i włącz pompę, jednocześnie wyłączając przepływ.
7. Otwórz program i kliknij przycisk ODBIERZ. Naczynie powinno być teraz widoczne na ekranie (Rysunek 3). Naczynie jest wizualizowane za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie, co pozwala na monitorowanie i analizę światła naczynia, średnicy naczynia i grubości ścianki.
8. Stopniowo zwiększaj ciśnienie międzyświetlne za pomocą zaworu P1, wybierając ciśnienie P1 w panelu interfejsu myo lub w programie i wprowadź wartość ciśnienia w następujący sposób: 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Naczynie czasami ma tendencję do skręcania się lub zawijania podczas wzrostu ciśnienia; odpowiednio wyreguluj napięcie lub naprężenie za pomocą pionowego lub podłużnego mikropozycjonera (rysunek 2). Równoważyć naczynie przy 60 mmHg i temperaturze 37 °C co najmniej przez 45 minut. Jednorazową wymianę roztworu do kąpieli za pomocą wstępnie podgrzanego HEPES podczas równoważenia.
9. Nałożyć 10 ml roztworu depolaryzującego KCl, podgrzanego w temperaturze 37 °C, do kąpieli, aby całkowicie zdepolaryzować komórki mięśni gładkich i osiągnąć maksymalne zwężenie. Po ustabilizowaniu zwężenia spłukać kąpiel roztworem HEPES 3 razy co 10 minut.
10. Sprawdź żywotność naczynia i integralność śródbłonka poprzez stabilne i powtarzalne reakcje na dodanie fenylefryny (^10-5 M) i acetylocholiny (^10-5 M). Płukać 3 razy roztworem HEPES co 10 minut.
11. Dodać fenylefrynę (^10-5 M) w celu wstępnego zwężenia naczynia, a po uzyskaniu stabilnego zwężenia wykonać skumulowaną krzywą odpowiedzi stężenie-rozszerzenie naczyń krwionośnych (CRC) poprzez sekwencyjne dodawanie zwiększających się dawek acetylocholiny (^10-9, 3 x ^10-9, ^10-8, 3 x ^10-8, ^10-7, 3 x ^10-7, ^10-6, 3 x ^10-6, i ^10-5 M). Po ostatniej dawce płukać 3 razy roztworem HEPES co 10 minut przed rozpoczęciem nowego CRC.
12. Określ pasywną średnicę światła, stosując PSS wolny od Ca²⁺ zawierający 2 mM EGTA. Na podstawie zarejestrowanych śladów zmierz średnicę światła dla każdej odpowiedzi na dawkę (rysunek 4), która zostanie wykorzystana do obliczenia wszystkich parametrów.
13. Wyrazić wszystkie reakcje relaksacji acetylocholiny jako procentową zmianę średnicy światła po wstępnym zwężeniu fenylefryny w porównaniu z różnicą między średnicą wolną od wapnia a średnicą po zwężeniu fenylefryny, stosując następujące równanie:
14. Dylatacja procentowa = 100% x [(D_x - D_i)/(D_{bez Ca-free} - D_i)], gdzie D jest zmierzoną średnicą światła, a x, i Ca-free oznaczają średnice tętnic przy każdej dawce agonisty (x), średnicę początkową po zwężeniu fenylefryny (i) oraz w buforze wolnym od Ca²⁺ (bez Ca).

5. Analiza statystyczna

Wszystkie ciągłe pomiary są wyrażone jako średnia ±SEM. Reaktywność naczyniowa w tętnicach krezkowych jest analizowana za pomocą dwukierunkowej ANOVA z powtarzanymi pomiarami. We wszystkich przypadkach P < 0,05 jest uważane za statystycznie istotne.

Wyniki

NO jest centralnie zaangażowane w utrzymanie homeostazy ciśnienia krwi zarówno u ludzi ⁶, jak i u modeli zwierzęcych ⁷. Zdolność NO do kontrolowania rozluźnienia mięśni gładkich naczyń krwionośnych jest pośredniczona przez rozpuszczalną cyklazę guanylanową (sGC), heterodimeryczny enzym zawierający hem, który generuje cGMP ⁸. Niedawno zidentyfikowano wariant genetyczny modyfikujący ciśnienie krwi w locus zawierającym geny sGCα₁ i sGCβ₁, co ilustruje znaczenie sGC w re...

Dyskusja

Myszy są modelem eksperymentalnym wybieranym przez wielu badaczy, częściowo ze względu na możliwość wprowadzenia modyfikacji genetycznych, a tym samym uzyskania mysich modeli patofizjologii człowieka. Stan wazoaktywny małego oporu, ale nie większych naczyń przewodowych, w dużej mierze określa regulację przepływu krwi w całym układzie naczyniowym ¹¹. Wielkość tętnic oporowych u małych zwierząt, takich jak myszy, uniemożliwia użycie miografu drucianego do badania funkcji mikrokrążenia. Miografy ciśnieniowe nie t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylocholina	Sigma	A6625
System miografu ciśnieniowego	DMT