Wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

Podsumowanie

Pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem oceny funkcji nerek. Tutaj opisujemy metodę wysokoprzepustową, która umożliwia określenie GFR u przytomnych myszy za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia bolusa, oznaczenie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-inuliny w osoczu i obliczenie GFR za pomocą dwufazowego modelu rozpadu wykładniczego.

Streszczenie

Pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem w ocenie funkcji nerek. Obecnie badacze określają GFR, mierząc poziom endogennego biomarkera kreatyniny lub egzogennie stosowanej radioaktywnej znakowanej radioaktywnej inuliny (³H lub ¹⁴C). Kreatynina ma istotną wadę polegającą na tym, że wydzielina proksymalnym kanalikowym stanowi ~50% całkowitego wydalania kreatyniny przez nerki, a zatem kreatynina nie jest wiarygodnym markerem GFR. W zależności od przeprowadzonego eksperymentu, klirens inuliny można określić przez dożylne wstrzyknięcie w pojedynczym bolusie lub infuzję ciągłą (minipompa dożylna lub osmotyczna). Oba podejścia wymagają pobrania osocza lub odpowiednio osocza i moczu. Inne wady radioaktywnej inuliny znakowanej radioaktywnie to stosowanie izotopów, czasochłonne przygotowanie chirurgiczne zwierząt oraz wymóg przeprowadzenia końcowego eksperymentu. Tutaj opisujemy metodę, która wykorzystuje pojedyncze wstrzyknięcie bolusa inuliny znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i pomiar jej fluorescencji w 1-2 μl rozcieńczonego osocza. Dzięki zastosowaniu modelu dwukomorowego, z 8 pobraniami krwi na mysz, możliwe jest zmierzenie GFR u maksymalnie 24 myszy dziennie przy użyciu specjalnego protokołu przepływu pracy. Ta metoda wymaga jedynie krótkiego znieczulenia izofluranem, a wszystkie próbki krwi są pobierane u nieskrępowanej i wybudzonej myszy. Kolejną zaletą jest to, że możliwe jest obserwowanie myszy przez okres kilku miesięcy i leczenia (tj. przeprowadzanie eksperymentów w parach ze zmianami w diecie lub aplikacjami leków). Mamy nadzieję, że ta technika pomiaru GFR jest przydatna dla innych badaczy badających funkcję nerek myszy i zastąpi mniej dokładne metody szacowania czynności nerek, takie jak kreatynina w osoczu i azot mocznikowy we krwi.

Wprowadzenie

Szybkość tworzenia ultrafiltratu osocza w kłębuszkach nerkowych stała się podstawą do oceny funkcji nerek (szybkość filtracji kłębuszkowej, GFR). Idealny marker do określenia GFR powinien być swobodnie filtrowany, ani wydzielany, ani ponownie wchłaniany i nie powinien być metabolizowany. Stwierdzono, że takie zachowanie jest prawdziwe w przypadku inuliny, a klirens inuliny stał się złotym standardem w oznaczaniu GFR ³. Podczas gdy klirens kreatyniny jest szeroko stosowany jako miara GFR u ludzi i zwierząt, kreatynina nie spełnia wymagań idealnego markera GFR. Około 10 - 40% klirensu kreatyniny u ludzi jest konsekwencją aktywnego wydzielania kanalikowego ^{1, 11}, a nerkowe wydzielanie kreatyniny jest również widoczne u myszy i szczurów ^{4, 7, 9, 22}. Wiadomo, że dysfunkcja nerek zwiększa kanalikowe wydzielanie kreatyniny, co ogranicza jej wartość jako markera GFR ^{1, 2}. Wcześniej wykazaliśmy, że organiczny transporter anionów izoforma 3 (OAT3) przyczynia się do mysiego nerkowego wydzielania kreatyniny ²². Jednak klirens inuliny zazwyczaj wymaga użycia radioaktywnej znakowanej inuliny (³H lub ¹⁴C). Radioaktywne oznaczanie inuliny może być stosowane zarówno u znieczulonych, jak i przytomnych myszy, ale ma wady w postaci licznych przepisów bezpieczeństwa i ścisłych problemów związanych ze stosowaniem izotopów promieniotwórczych. W związku z tym przygotowania do oznaczenia GFR są czasochłonne, a także mają charakter terminalny. W 1999 roku Lorenz i wsp.12 wprowadzili inulinę FITC jako marker GFR pojedynczego nefronu u znieczulonych myszy. Pięć lat później Qi i wsp. ¹⁵ określili GFR całej nerki u przytomnych myszy za pomocą FITC-inuliny. Alternatywne protokoły wykorzystują obecnie inulinę FITC jako egzogenny marker do pomiaru GFR u przytomnych i znieczulonych myszy. Protokoły te zachowują czułość radioaktywnej inuliny poprzez zastosowanie detekcji fluorescencji i obejście wad pracy z markerem znakowanym radioaktywnie. Test FITC-inulina został zmodyfikowany przez innych ^{7, 8} i nas ^{22, 23}, aby wykorzystać zdolność fluorospektrometru NanoDrop 3300 do mikroobjętości. Pozwala to na zmniejszenie całkowitej objętości próbki potrzebnej do <100 μl krwi na pomiar GFR.

Dzięki metodzie i protokołowi wysokiej przepustowości przedstawionemu w tej publikacji, pokazujemy możliwość pomiaru GFR u maksymalnie 24 świadomych myszy dziennie. Technika ta może być przydatna dla innych badaczy badających mysi GFR i mamy nadzieję, że zastąpi mniej dokładne metody jako wskaźniki czynności nerek, takie jak kreatynina i azot mocznikowy we krwi.

Protokół

1. Rozwiązania

1. 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl/1 l ddH₂O (8,5 g/L).
2. 0,5 mol/L HEPES pH 7,4 (rozpuścić 59,6 g HEPES w 0,5 l ddH₂0 i dostosować pH do 7,4 za pomocą 10 N NaOH).

2. Przygotowanie roztworu do wstrzykiwań FITC-inuliny

1. Zważyć FITC-inulinę, aby przygotować 5% roztwór i rozpuścić w 0,85% NaCl (zwykle 100 mg/2 ml 0,85% NaCl), ogrzewając do temperatury 90 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia.
2. Zważyć rozpuszczony roztwór inuliny FITC i zanotować wagę.
3. Wyciąć 20-centymetrowy kawałek membrany dializacyjnej (granica masy cząsteczkowej: 1 000) i umieścić w ddH₂O na 30 minut, aby usunąć resztki NaN₃ z membrany, a następnie kilkakrotnie przepłukać.
4. Wlej rozpuszczoną inulinę FITC do membrany dializacyjnej i odpowiednio uszczelnij za pomocą zamknięć.
5. Zważyć całą membranę dializacyjną.
6. Umieścić membranę dializacyjną w 1 l 0,85% roztworze NaCl i mieszać powoli chroniony przed światłem przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
7. Ponownie zważyć całą błonę dializacyjną i obliczyć nowe stężenie (woda osmotycznie przemieści się do membrany, a niezwiązany FITC lub związana FITC-inulina <1000 masa cząsteczkowa wysunie się z błony; w ten sposób stężenie FITC-inuliny znacznie się zmniejszy).
8. Nowe stężenie inuliny FITC (c) oblicza się przy użyciu następującego wzoru: c = n/V, gdzie n = początkowa ilość inuliny FITC, V = nowa objętość (różnica w masie rurki dializacyjnej przed i po dializie plus objętość początkowego roztworu FITC-inuliny).
9. Przed użyciem wysterylizować dializowany roztwór inuliny FITC przez filtrację przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
10. Przechowywać FITC-inulinę przed światłem (folia aluminiowa) w temperaturze 4 °C. Dializowaną i sterylizowaną FITC-inulinę można stosować do 2 tygodni. Uczestnicząca w nim inulina FITC może być rozpuszczona przez ponowne ogrzewanie w temperaturze 90 °C przez kilka minut.

Uwaga: jeśli używasz FITC-sinistrin ^16-18, która nie wymaga dializy, wszystkie kroki wymagane do dializy można pominąć.

3. Iniekcja i pobieranie krwi

1. Weź masę ciała (m.c.) myszy przed eksperymentem.
2. Znieczulenie myszy na krótko izofluranem.
3. W przypadku wysokiej przepustowości 6 myszy należy postępować zgodnie z protokołem przedstawionym na rysunku 3.
4. Wstrzyknąć 2 μl/g bw dializowanej inuliny FITC do splotu zaoczodołowego ²⁴ za pomocą igły G30 1/2 cala (usunąć pęcherzyki powietrza ze 100 μl strzykawki Hamiltona, najpierw używając igły G26 1/2 cala, a następnie zmieniając igłę na G30 1/2 cala do wstrzykiwań).
5. Odetnij 1 mm ogona myszy nożyczkami raz i zbierz krew po 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 i 75 minutach od wstrzyknięcia do minikapilar Na-heparyny. Uszczelnij mininaczynia włosowate po pobraniu krwi za pomocą Châ-seal.
6. Próbki należy chronić przed światłem.
7. Umieść zamknięte minikapilary w naczyniach włosowatych hematokrytu i odwiruj przez 5 minut.
8. Rozbij minikapilary za pomocą frezu diamentowego i przenieś całe osocze przez pipetowanie do probówki o pojemności 0,2 ml.
9. Rozcieńczyć w stosunku 1:10, używając 2 μl osocza i 18 μl 0,5 mol/l HEPES (pH 7,4) w nowej probówce o pojemności 0,2 ml (próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C w celu pomiarów fluorescencji).
10. Zmierzyć 2 μl rozcieńczonej próbki za pomocą NanoDrop 3300 w dwóch egzemplarzach. Opis i zastosowanie tego instrumentu opisane jest tutaj ⁵.

4. Przygotowanie standardów

1. Zebrać krew od myszy tego samego szczepu tła w naczyniach włosowatych pokrytych heparyną, odwirować i rozcieńczyć w stosunku 1:10 z 0,5 mol/l HEPES (pH 7,4); zwykle 80 μl osocza + 720 μl HEPES.
2. Rozcieńczyć roztwór iniekcji inuliny FITC rozcieńczonym osoczem myszy, aby uzyskać następujące standardowe rozcieńczenia:
   1:10: 10 μl nierozcieńczonego roztworu FITC-inuliny + 90 μl rozcieńczonego osocza myszy
   1:100: 10 μl (1:10) roztwór + 90 μl rozcieńczonego osocza myszy
   1:1 000: 10 μl (1:100) roztworu + 90 μl rozcieńczonego osocza myszy
   1:2 000: 30 μl (1:1) roztworu + 30 μl rozcieńczonego mysiego osocza
   1:10 000: 10 μl (1:5) roztworu + 40 μl rozcieńczonego osocza myszy
   1:20 000: 20 μl (1:1) roztwór + 20 μl rozcieńczonego mysiego osocza
   1:100 000: 10 μl (1:5) roztwór + 40 μl rozcieńczonego osocza myszy
   Stężenie wzorców będzie zależało od dializy i zawsze będzie różne dla każdego preparatu FITC-inuliny. Za każdym razem konieczne jest wprowadzanie nowego stężenia dla krzywej standardowej.
3. Przeanalizuj dane, aby obliczyć GFR za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. GraphPad Prism) przy użyciu dwufazowej funkcji rozkładu wykładniczego, jak opisano tutaj ^{15, 20} i pokazano w sekcji Reprezentatywne wyniki.

Wyniki

GFR zostanie obliczone przy użyciu następującego wzoru:

GFR = n/(A/K1 + B/K2), gdzie

n = ilość wstrzyknięta (n = c•V, gdzie c = stężenie FITC-inuliny, V = objętość wstrzyknięta)
A = Span1, punkt przecięcia z osią y dla eliminacji
K1 = stała zaniku dla eliminacji
B = Span2, punkt przecięcia z osią y dla dystrybucji
K2 = stała zaniku dla dystrybucji

Uwaga: A, K1, B oraz K2 to skróty nadawane przez program GraphPad Prism; do analizy dwufazowego zaniku wykładniczego można użyć każdego odpowiedniego oprogramowania, jednak inne programy naukowe mogą stosować inne oznaczenia.

Stosując dopasowanie dwufazowej krzywej wykładniczego zaniku, oparte na stężeniach FITC-inuliny w osoczu, należy otrzymać krzywą porównywalną do tej przedstawionej na Rysunku 1. Obliczanie GFR według powyższego wzoru (oraz zgodnie z opisem w źródle ²⁰) pozwala na wykrycie upośledzenia funkcji nerek ¹⁵ lub hiperfiltracji kłębuszkowej ^{8, 23}, stwierdzanej u myszy z cukrzycą typu 1 (Rysunek 2).

Rysunek 1. W celu pomiaru GFR u świadomych myszy wykorzystuje się kinetykę osoczową FITC-inuliny po jednorazowym wstrzyknięciu dożylnym. Do obliczenia GFR zastosowano model dwukomorowy. W modelu dwukomorowym początkowa faza szybkiego spadku reprezentuje redystrybucję FITC-inuliny z przedziału wewnątrznaczyniowego do płynu pozakomórkowego. Późniejsza faza, charakteryzująca się wolniejszym spadkiem stężenia FITC-inuliny, odzwierciedla głównie systemowy klirens z osocza.

Rycina 2. Wykrycie cukrzycowej hiperfiltracji u myszy typu dzikiego. Cukrzycę typu I indukowano poprzez domięśniowe podanie streptozotocyny (STZ, 50 mg/kg przez 5 kolejnych dni). GFR określono przed (poziom podstawowy) oraz 5 tygodni po indukcji cukrzycy. Ze względu na sprzężenie cewkowo-kłębuszkowe, pierwotny wzrost reabsorpcji proksymalnej powoduje wczesną cukrzycową hiperfiltrację ²¹, co jest wynikiem powtarzalnym u myszy typu dzikiego (n=10, p<0.01 względem poziomu podstawowego u tej samej myszy).

Rysunek 3. Schemat pomiaru GFR w grupie 6 myszy. Aby zmierzyć GFR całej nerki metodą pojedynczego bolusa, należy pobrać 8 próbek krwi w 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 i 75 min po wstrzyknięciu FITC-inuliny. Liczby wskazują punkty czasowe. Liczby w nawiasach oznaczają numer próbki. Punkty czasowe po lewej stronie pionowej czerwonej linii wskazują momenty wstrzykiwania (w 0, 11, 22, 33, 44 i 55 min). Każda mysz jest oznaczona innym kolorem. Aby uzyskać sekwencyjne pobrania krwi, należy podążać za strzałkami. Szare pola wskazują moment, w którym następna mysz musi zostać przygotowana do znieczulenia izofluranem przed wstrzyknięciem. Przy zastosowaniu tego protokołu minimalny czas między dwoma pobraniami krwi od różnych myszy wynosi 1 min.

Dyskusja

W niniejszym badaniu opisano technikę oznaczania GFR u przytomnych myszy przez wstrzyknięcie pojedynczego bolusa i analizę fluorescencji w 8 próbkach krwi przez dwufazowy rozpad wykładniczy. Pomiar GFR u 1 myszy trwa 75 minut. Dzięki zastosowaniu specjalnego schematu blokowego możliwe jest zmierzenie GFR 6 myszy w ciągu 130 minut. Możliwe jest powtórzenie tego protokołu schematu blokowego do 4 razy dziennie i zmierzenie GFR u 24 myszy. Zmodyfikowaliśmy tę metodę tak, aby możliwe było pobranie krwi z małego wycięcia ogona, a nie z nakłucia żyły ogonowej, co jest szybsze i łatwiejsze do wykonania przez badaczy w porównaniu z nakłuciem żyły ogonowej. Dzięki zastosowaniu 10 μl naczyń włosowatych hematokrytu i rozcieńczeniu 1:10 możliwe jest zmniejszenie całkowitej ilości potrzebnej krwi do <100 μl. Na koniec fluorescencję mierzy się za pomocą fluorospektrometru NanoDrop 3300, który umożliwia oznaczenie fluorescencji w 1-2 μl rozcieńczonej próbki. Ta metoda da zainteresowanemu badaczowi rzeczywistą wartość GFR. W przeciwieństwie do tego, pomiary kreatyniny u myszy mają kilka słabości, w tym "ślepy zakres kreatyniny" i trudności związane ze specyficznym i czułym oznaczaniem. "Ślepy zakres kreatyniny" ogranicza jej funkcję jako markera GFR, ponieważ kreatynina w surowicy pozostaje w normalnym zakresie ^{do momentu utraty} 50% funkcji nerek. Ponieważ kilku badaczy wykorzystuje genetycznie zmodyfikowane myszy w swoich badaniach do badania fizjologii i patofizjologii nerek, rodzi to następujący problem: zakładając, że mysz z nokautem genu X miałaby znacznie niższy GFR (o 40%) w porównaniu z myszą typu dzikiego, proste badanie przesiewowe poprzez porównanie kreatyniny w osoczu nie wykryłoby tej różnicy. Potrzeba dobrej, dokładnej metody oznaczania GFR staje się tym bardziej krytyczna, im mniejsze stają się różnice w GFR.

Myszy mają wysokie stężenia chromagenów niekreatyninowych w osoczu i moczu, które zakłócają dostępne na rynku testy kreatyniny. W związku z tym testy oparte na reakcji Jaffégo alkalicznego pikratu zawyżają stężenie kreatyniny w osoczu w porównaniu z oznaczaniem metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) ^{6, 13}. Innym ograniczeniem jest to, że stężenie kreatyniny w surowicy jest poniżej limitów wykrywalności kilku dostępnych na rynku testów w porównaniu z oznaczaniem HPLC. Jednak za pomocą reakcji enzymatycznych badacze byli w stanie określić stężenie kreatyniny w osoczu u myszy ^{10, 22}.

GFR w podobnym zakresie stwierdzono u przytomnych myszy przy użyciu porównywalnej metody wstrzyknięcia w pojedynczym bolusie, a także klirensu FITC-inuliny z moczem ¹⁴. W przeciwieństwie do ich protokołu, nasz protokół z użyciem wycinka ogonowego nie wymaga specjalnych środków ostrożności w celu zachowania integralności naczynia w porównaniu z nakłuciem żyły ogonowej lub odpiszczelowej. W celu uzyskania klirensu FITC-inuliny na podstawie moczu/osocza konieczne jest chirurgiczne wszczepienie dwóch minipomp osmotycznych. Dwie pompy są niezbędne do osiągnięcia wystarczająco wysokich stężeń FITC-inuliny w osoczu w stanie ustalonym, które są wyraźnie odróżnialne od tła. Wymaga to również użycia klatek metabolicznych do pełnego i czasowego zbierania moczu. Koszyki muszą zostać przepłukane w celu uwzględnienia utraty 25–37 % FITC-inuliny, która w przeciwnym razie występuje bez płukania.

Pułapki związane ze stosowaniem tej metody FITC-inulina są ograniczone. Badacze powinni być świadomi następujących kwestii: (i) upewnić się, że w strzykawce używanej do wstrzykiwania roztworu FITC nie ma pęcherzyków powietrza, (ii) należy wykonać pełne wstrzyknięcie zagałkowe, ponieważ ilość wstrzykniętego roztworu określa obliczony GFR, oraz (iii) myszy najprawdopodobniej oddadzą mocz podczas 75-minutowego eksperymentu GFR, więc należy unikać zanieczyszczania próbek krwi moczem, który będzie miał bardzo wysokie stężenie inuliny FITC w wyniku zdolności koncentracji nerek.

Ogólne zalety tej metody FITC-inuliny obejmują: (i) jest to technika nieradioaktywna, (ii) możliwe jest wielokrotne powtarzanie pomiarów na tej samej myszy, (iii) test można przeprowadzić na przytomnych myszach, (iv) nie jest wymagane pobieranie moczu oraz (v) można zastosować opcję o wysokiej przepustowości. Do wad pojedynczego wstrzyknięcia bolusa należy konieczność dializy FITC-inuliny, którą można przezwyciężyć za pomocą lepszego markera FITC, FITC-sinistrin, który jest już dostępny i może być mierzony przezskórnie za pomocą specjalnego zminiaturyzowanego urządzenia ¹⁸. Mimo że GFR jest mierzony, nie jest możliwe zmierzenie frakcyjnych wydalin płynu lub jonów tą metodą.

Podsumowując, metoda ta zapewnia wykonalność wysokoprzepustowej metody pomiaru GFR u świadomych myszy. W związku z tym technika ta może być interesująca dla innych badaczy, którzy są zainteresowani określeniem funkcji nerek u myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-inulina	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
Isoflurane	Webster Weterynaryjna	78366551
membrana do dializy (MWCO 1000)	Spectrum Laboratories	132636
Zamknięcie membrany	Spectrum Laboratoria	132736
80 μ l Kapilary hematokrytu	Drummond Scientific	22362566
Wirówka do hematokrytu	IEC	Micro-MB
10 μ l Na+-Heparyna minicaps	Hirschmann	9000210
Strzykawka (100 μ l)	fluoroskopowy Hamilton	80601
	Filtr Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
(0,22 μ m)	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
Uszczelniacz	Châ-uszczelnienie	510
igieł (G26 ½ i G30½)	Becton Dickinson	305111 & 305106