Paramagnetyczne właściwości hemozoiny są wykorzystywane do izolowania późnych stadiów wzrostu czerwonych krwinek zakażonych Plasmodium falciparum w hodowli. Metoda jest prosta i szybka i nie wpływa na późniejsze zdolności inwazyjne pasożytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Separacja erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum w późnym stadium za pomocą środków magnetycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W przeciwieństwie do innych gatunków Plasmodium, P. falciparum może być hodowany w laboratorium, co ułatwia jego badanie 1. Podczas gdy osiągnięta parazytemia może osiągnąć limit ≈40%, badacz zwykle utrzymuje odsetek na poziomie około 10%. W wielu przypadkach konieczne jest wyizolowanie czerwonych krwinek (RBC) zawierających pasożyty od niezakażonych, aby wzbogacić hodowlę i przeprowadzić dany eksperyment.
Gdy P. falciparum infekuje erytrocyty, pasożyt ulega degradacji i żywi się hemoglobiną 2, 3. Jednak pasożyt musi radzić sobie z bardzo toksycznym ugrupowaniem hemowym zawierającym żelazo 4, 5. Pasożyt unika swojej toksyczności poprzez przekształcenie hemu w obojętny krystaliczny polimer zwany hemozoiną 6, 7. Ta cząsteczka zawierająca żelazo jest przechowywana w wakuoli pokarmowej, a zawarty w niej metal ma stopień utlenienia, który różni się od tego w hemie 8. Stan żelaza w hemozoinie nadaje mu właściwości paramagnetyczne, których nie ma w niezakażonych erytrocytach. Gdy atakujący pasożyt osiąga dojrzałość, wzrasta również zawartość hemozoiny 9, co nadaje jeszcze większy paramagnetyzm najnowszym stadiom P. falciparum wewnątrz erytrocytów.
Na podstawie tej właściwości paramagnetycznej, najnowsze etapy czerwonych krwinek zakażonych P. falciparum mogą być oddzielone poprzez przepuszczenie kultury przez kolumnę zawierającą kulki magnetyczne. Koraliki te stają się magnetyczne, gdy zawierające je kolumny zostaną umieszczone na uchwycie magnetycznym. Zainfekowane erytrocyty, ze względu na swój paramagnetyzm, zostaną następnie uwięzione w kolumnie, podczas gdy przepływ będzie zawierał w większości niezakażone erytrocyty i te zawierające wczesne stadia pasożyta.
Tutaj opisujemy metodologię wzbogacania populacji pasożytów w późnym stadium za pomocą kolumn magnetycznych, co pozwala utrzymać dobrą żywotność pasożytów 10. Po wykonaniu tej procedury nieprzyłączoną kulturę można zwrócić do inkubatora, aby umożliwić pozostałym pasożytom dalszy wzrost.
Protokół
Wszystkie etapy protokołu, z wyjątkiem wirowania, powinny być przeprowadzane wewnątrz okapu, aby próbka była sterylna.
1. Późne stadium izolacji erytrocytów zakażonych P. falciparum
Wszystkie późne stadia erytrocytów zakażonych Plasmodium mogą być oddzielone za pomocą tej metodologii, ponieważ hemozoina, która nadaje pasożytowi paramagnetyzm, jest powszechnym metabolitem dla tego rodzaju. Zaleca się wysoką parazytemię (3-10%) w hodowli, aby uzyskać lepsze plony przy użyciu tego protokołu, chociaż typowa hodowla będzie zawierać 2-4% hematokrytu (procent objętości czerwonych krwinek) i 1-8% parazytemii (procent zakażonych czerwonych krwinek). Pasożyty mogą być hodowane zgodnie z opisem Tragera i Jansena 1.
- Do każdej procedury izolacji schizontu należy zmontować prostą, wieloczęściową instalację. W tym celu stosuje się kolumny LS, magnetyczny separator MidiMACS i stojak MACS MultiStand firmy Miltenyi BioTec (ilustracja 1). Najpierw przymocuj separator magnetyczny do metalowego stojaka, a następnie umieść kolumnę magnetyczną na separatorze.
- W osobnej probówce (użyj 50 ml stożków) wymieszaj 23,2 ml RPMI 1640 i 750 μl 7,5% wodorowęglanu sodu, aby uzyskać roztwór roboczy. Miej pod ręką dodatkowe probówki do wyrzucania i zbierania przepływu kultury pasożyta.
- Dodać 3 ml roztworu roboczego do kolumny, aby ją zrównoważyć, i wyrzucić przepływający roztwór do probówki.
- Dodać 8 ml kultury P. falciparum do kolumny, upewniając się, że gdy tylko ostatnia część roztworu roboczego zostanie wypchnięta z kolumny przez kulturę, rurka odbiorcza zostanie zastąpiona rurką zbierającą, aby rozpocząć odzyskiwanie niezwiązanej kultury. Jest to konieczne, aby uniknąć dalszego rozcieńczania kultury.
- Po ustaniu przepływu kultury przez kolumnę dodać 1 ml roztworu roboczego, aby wypchnąć pozostałe krwinki czerwone z kolumny.
- Etap mycia: Dodać kolejne 3 ml roztworu roboczego do kolumny i zebrać przepływającą ciecz do probówki "do odrzucenia", aby uniknąć rozcieńczania kultury zapisanej jako przepływowa w drugiej probówce.
- Elucja: Po przejściu 3 ml przez kolumnę, należy odłączyć ją od podstawki i umieścić na probówce o pojemności 15 ml.
- Ponownie dodać 3 ml roztworu roboczego do kolumny. Ten etap wymywa erytrocyty zakażone pasożytami w późnym stadium, które zostały uwięzione w kulkach kolumny.
Uwaga: W tym momencie, w zależności od wymaganej ilości pasożytów, rozpocznij kolejną rundę zbierania, oczywiście z zastrzeżeniem limitów pasożyta w oryginalnej kulturze. Kolumna może być ponownie użyta, o ile przepływ utrzymuje stan ustalony.
- Stężenie zebranych pasożytów: Odwirować 15 ml probówki zawierającej eluat przez 5 minut przy 150 x g w temperaturze pokojowej, aby utworzyć ciemny osad ze spasożytowanych erytrocytów.
- Usunąć supernatant, pozostawiając wystarczającą ilość płynu, aby pobrać bardzo małą próbkę i określić stężenie i całkowitą wydajność za pomocą mikroskopii (patrz krok 2 poniżej).
- W tym momencie, jeśli izolacja i schwytanie pasożytów w późnym stadium zostanie zakończone zadowalająco, ponownie inkubuj zebraną kulturę ze świeżymi pożywkami.
- Zebrane pasożyty rozcieńczyć w objętości i roztworze potrzebnym do kolejnych eksperymentów.
2. Analiza czystości i plonów
- Sprawdź stężenie pasożytów uzyskane za pomocą hemocytometru i liczenia pod mikroskopem świetlnym. Aby policzyć, dodaj 10 μl mieszaniny zebranych pasożytów i pożywki pod szkiełkiem nakrywkowym hemocytometru. Policz liczbę pasożytów w czterech kwadrantach hemocytometru i podziel całkowitą liczbę przez 4. Pomnóż tę liczbę przez 104, aby uzyskać stężenie zakażonych erytrocytów na ml.
Uwagi: a) O stężeniu mieszanki będzie decydował użytkownik w momencie ponownego wymieszania pelletu, dodając mniej lub bardziej pożywkę. Sugerowane stężenie robocze to 5,5 X10,4 schizonty na μl (zazwyczaj osiąga się to poprzez dodanie 100-300 μl do pobranych pasożytów). Jeśli 20 μl tego stężenia zostanie dodane do końcowej objętości 100 μl mieszaniny pożywki i erytrocytów, otrzyma się pasożyt około 1% w typowej 4% hodowli hematokrytu. b) Liczenie pod hemocytometrem musi być szybkie, ponieważ erytrocyty zaczynają lizować w miarę wysychania próbki w komorze. Zainfekowane erytrocyty, których powinna być większość, będą miały w środku ciemną plamę, która odróżnia je od niezakażonych.
- Wykonaj cienkowarstwową barwienie Giemsa, aby ocenić czystość kolekcji, bardzo szybko utrwalając szkiełka w 10% metanolu, susząc je i zanurzając w 20% roztworze barwnika Giemsa rozcieńczonym wodą destylowaną. Szkiełka należy barwić przez 10 minut, po czym można je wysuszyć powietrzem i zbadać pod mikroskopem. Parazytemia znacznie powyżej 70% powinna być osiągalna.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Na Rysunku 2 przedstawiono kulturę przepływającą przez kolumnę magnetyczną przed (A) oraz po zakończeniu procedury (B). W polu widzenia przy powiększeniu 100X zazwyczaj widoczne są od jednego do dwóch zakażonych erytrocytów, co pokazano na Rysunku 2; strzałki na Rysunku 2A wskazują zakażone erytrocyty. W typowej procedurze, rozpoczynając od kultury z 5% parasitemią (Rysunek 2A), zastosowanie tej metody zazwyczaj pozwala ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Hodowle in vitro pasożyta malarii P. falciparum wykazują ograniczoną obecność pasożyta, przy czym ponad połowa czerwonych krwinek nie jest zakażona w najwyższym punkcie proliferacji hodowli. W przypadku większości eksperymentów badawczych pożądana jest praca tylko z zakażonymi erytrocytami. W tym celu konieczna jest technika separacji, aby podzielić kulturę według infekcji. Przydatne metody obejmują zastosowanie streptolizyny O do przepuszczalności i lizy niezakażonych erytrocytów 11 oraz sze...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana z grantu PRB-009 dla CS oraz stypendium doktoranckiego dla LC, od Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Hepes Modyfikowany | Sigma-Aldrich | R4130 | Uzupełniony 10% surowicą ludzką, 2% glukozą i 0,2% wodorowęglanem sodu |
| Separator MidiMACS | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS | MultiStand MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Kolumny | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometr | Komora | Grafco Grafco Neubauer | Można znaleźć u wielu innych dostawców |
Bibliografia
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J. Haemozoin formation. Mol. Biochem. Parasitol. 157 (2), 127-136 (2008).
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96(2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7(2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
