Paramagnetyczne właściwości hemozoiny są wykorzystywane do izolowania późnych stadiów wzrostu czerwonych krwinek zakażonych Plasmodium falciparum w hodowli. Metoda jest prosta i szybka i nie wpływa na późniejsze zdolności inwazyjne pasożytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Separacja erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum w późnym stadium za pomocą środków magnetycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W przeciwieństwie do innych gatunków Plasmodium, P. falciparum może być hodowany w laboratorium, co ułatwia jego badanie 1. Podczas gdy osiągnięta parazytemia może osiągnąć limit ≈40%, badacz zwykle utrzymuje odsetek na poziomie około 10%. W wielu przypadkach konieczne jest wyizolowanie czerwonych krwinek (RBC) zawierających pasożyty od niezakażonych, aby wzbogacić hodowlę i przeprowadzić dany eksperyment.
Gdy P. falciparum infekuje erytrocyty, pasożyt ulega degradacji i żywi się hemoglobiną 2, 3. Jednak pasożyt musi radzić sobie z bardzo toksycznym ugrupowaniem hemowym zawierającym żelazo 4, 5. Pasożyt unika swojej toksyczności poprzez przekształcenie hemu w obojętny krystaliczny polimer zwany hemozoiną 6, 7. Ta cząsteczka zawierająca żelazo jest przechowywana w wakuoli pokarmowej, a zawarty w niej metal ma stopień utlenienia, który różni się od tego w hemie 8. Stan żelaza w hemozoinie nadaje mu właściwości paramagnetyczne, których nie ma w niezakażonych erytrocytach. Gdy atakujący pasożyt osiąga dojrzałość, wzrasta również zawartość hemozoiny 9, co nadaje jeszcze większy paramagnetyzm najnowszym stadiom P. falciparum wewnątrz erytrocytów.
Na podstawie tej właściwości paramagnetycznej, najnowsze etapy czerwonych krwinek zakażonych P. falciparum mogą być oddzielone poprzez przepuszczenie kultury przez kolumnę zawierającą kulki magnetyczne. Koraliki te stają się magnetyczne, gdy zawierające je kolumny zostaną umieszczone na uchwycie magnetycznym. Zainfekowane erytrocyty, ze względu na swój paramagnetyzm, zostaną następnie uwięzione w kolumnie, podczas gdy przepływ będzie zawierał w większości niezakażone erytrocyty i te zawierające wczesne stadia pasożyta.
Tutaj opisujemy metodologię wzbogacania populacji pasożytów w późnym stadium za pomocą kolumn magnetycznych, co pozwala utrzymać dobrą żywotność pasożytów 10. Po wykonaniu tej procedury nieprzyłączoną kulturę można zwrócić do inkubatora, aby umożliwić pozostałym pasożytom dalszy wzrost.
Protokół
Wszystkie etapy protokołu, z wyjątkiem wirowania, powinny być przeprowadzane wewnątrz okapu, aby próbka była sterylna.
1. Późne stadium izolacji erytrocytów zakażonych P. falciparum
Wszystkie późne stadia erytrocytów zakażonych Plasmodium mogą być oddzielone za pomocą tej metodologii, ponieważ hemozoina, która nadaje pasożytowi paramagnetyzm, jest powszechnym metabolitem dla tego rodzaju. Zaleca się wysoką parazytemię (3-10%) w hodowli, aby uzyskać lepsze plony przy użyciu tego protokołu, chociaż typowa hodowla będzie zawierać 2-4% hematokrytu (procent objętości czerwonych krwinek) i 1-8% parazytemii (proc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Na Rysunku 2 przedstawiono kulturę przepływającą przez kolumnę magnetyczną przed (A) oraz po zakończeniu procedury (B). W polu widzenia przy powiększeniu 100X zazwyczaj widoczne są od jednego do dwóch zakażonych erytrocytów, co pokazano na Rysunku 2; strzałki na Rysunku 2A wskazują zakażone erytrocyty. W typowej procedurze, rozpoczynając od kultury z 5% parasitemią (Rysunek 2A), zastosowanie tej metody zazwyczaj pozwala .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Hodowle in vitro pasożyta malarii P. falciparum wykazują ograniczoną obecność pasożyta, przy czym ponad połowa czerwonych krwinek nie jest zakażona w najwyższym punkcie proliferacji hodowli. W przypadku większości eksperymentów badawczych pożądana jest praca tylko z zakażonymi erytrocytami. W tym celu konieczna jest technika separacji, aby podzielić kulturę według infekcji. Przydatne metody obejmują zastosowanie streptolizyny O do przepuszczalności i lizy niezakażonych erytrocytów 11 oraz sze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana z grantu PRB-009 dla CS oraz stypendium doktoranckiego dla LC, od Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Hepes Modyfikowany | Sigma-Aldrich | R4130 | Uzupełniony 10% surowicą ludzką, 2% glukozą i 0,2% wodorowęglanem sodu |
| Separator MidiMACS | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS | MultiStand MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Kolumny | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometr | Komora | Grafco Grafco Neubauer | Można znaleźć u wielu innych dostawców |
Bibliografia
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
