Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Summary

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca²⁺ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca²⁺ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca²⁺] w plemnikach ludzkich.

Abstract

Plemniki to męskie komórki rozrodcze specjalnie zaprojektowane do docierania, rozpoznawania i łączenia się z komórką jajową. Aby wykonać te zadania, plemniki muszą być przygotowane do stawienia czoła stale zmieniającemu się środowisku i pokonania kilku barier fizycznych. Będąc w istocie cichymi transkrypcyjnie i translacyjnie, te ruchliwe komórki w dużym stopniu polegają na różnych mechanizmach sygnalizacyjnych, aby zorientować się i pływać w ukierunkowany sposób oraz zmagać się z trudnymi warunkami środowiskowymi podczas podróży w celu znalezienia jaja. W szczególności sygnalizacja za pośrednictwem Ca^{2 +} ma kluczowe znaczenie dla kilku funkcji plemników: aktywacji ruchliwości, kapacytacji (złożonego procesu, który przygotowuje plemniki do reakcji akrosomowej) i reakcji akrosomowej (zdarzenie egzocytotyczne, które umożliwia fuzję plemnika z komórką jajową). Zastosowanie barwników fluorescencyjnych do śledzenia wewnątrzkomórkowych fluktuacji tego jonu ma niezwykłe znaczenie ze względu na ich łatwość aplikacji, czułość i wszechstronność wykrywania. Korzystając z jednego protokołu ładowania barwnika, wykorzystujemy cztery różne techniki fluorometryczne do monitorowania dynamiki Ca²⁺ plemników. Każda technika dostarcza odrębnych informacji, które umożliwiają rozdzielczość przestrzenną i/lub czasową, generując dane zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji komórek.

Introduction

Ca²⁺ jest uniwersalnym drugim przekaźnikiem szlaków transdukcji sygnału w komórkach eukariotycznych. Wewnątrzkomórkowy Ca²⁺ (Ca^{2 +} _i) uczestniczy w regulacji wielu podstawowych procesów fizjologicznych zarówno w komórkach pobudliwych, jak i niepobudliwych. Znaczenie i uniwersalność Ca²⁺ jako drugiego przekaźnika podczas zdarzeń transdukcji sygnału wynika z jego czasoprzestrzennej wszechstronności w przekazywaniu informacji w komórce. Chociaż Ca²⁺ nie może być syntetyzowany de novo ani degradowany w komórce, jego stężenie wewnątrzkomórkowe ([Ca²⁺] _i) jest utrzymywane w bardzo ścisłych granicach dzięki różnym mechanizmom komórkowym, które w sposób ciągły buforują, sekwestrują, dzielą się na przedziały i / lub gromadzą Ca²⁺. Zmiany w stężeniu tego jonu mogą zachodzić w wysoce zlokalizowanych obszarach w komórce ¹, a rozszyfrowanie takich fluktuacji jest niezbędne do głębszego zrozumienia (1) ich roli w mechanizmie sygnalizacji, (2) ich fizjologicznego znaczenia i (3) ogólnych mechanizmów sygnalizacji komórkowej. Sygnalizacja za pośrednictwem Ca²⁺ ma szczególne znaczenie w fizjologii plemników ². Ruchliwość plemników jest jedną z najważniejszych funkcji decydujących o powodzeniu zapłodnienia, a w rzeczywistości kilka wad ruchliwości plemników może powodować bezpłodność ^3-5. Znaczenie Ca²⁺ w ruchu wiciowym jest od dawna znane ⁶; jednak mechanizm, w jaki sposób Ca²⁺ kontroluje specyficzną formę zginania wici, nie jest w pełni zrozumiały.

Przed połączeniem z komórką jajową, plemniki muszą przejść kapacytację, złożony proces zależny od obecności plemników w żeńskim przewodzie. Podczas kapacytacji dochodzi do modyfikacji i organizacji lipidów błony plemników, głównie w wyniku usuwania cholesterolu z błony komórkowej. Dodatkowo kilka białek jest fosforylowanych tyrozyną ⁷. Co ważne, podczas kapacytacji dochodzi do wzrostu pH wewnątrzkomórkowego (pH_i) oraz [Ca²⁺]_i, a u niektórych gatunków dochodzi do hiperpolaryzacji potencjału błonowego ². Kapacytacja zachodzi tylko w subpopulacji plemników (20-40%), a mechanizmy zaangażowane we wszystkie te zmiany komórkowe są dalekie od jasności. Ogólnie przyjmuje się, że tylko subpopulacja zpojemnościowych plemników ulega reakcji akrosomowej (AR) pod wpływem fizjologicznych induktorów. AR jest również zdarzeniem regulowanym przez Ca²⁺ wymaganym do zapłodnienia u wszystkich gatunków posiadających akrosom (wyspecjalizowane organelle z błonami zewnętrznymi i wewnętrznymi). Podczas tego procesu zewnętrzna błona akrosomalna łączy się z błoną plazmatyczną plemnika, uwalniając enzymy hydrolityczne, które umożliwiają plemnikowi przenikanie do macierzy glikoproteinowej otaczającej komórkę jajową (osłona przejrzysta lub ZP). AR odsłania również nową fuzogenną powierzchnię plemników, która oddziałuje z błoną plazmatyczną komórki jajowej w celu ostatecznego połączenia obu gamet. Istnieje kilka ligandów komórkowych, które indukują AR, a progesteron jest jednym z najlepiej przebadanych spośród nich.

W tej pracy prezentujemy cztery różne techniki polegające na użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca²⁺ do pomiaru zmian [Ca²⁺]_i w ludzkim plemniku wywołanych przez progesteron (z wyjątkiem cytometrii przepływowej, w której zmierzyliśmy wzrost [Ca²⁺]_i indukowany podczas procesu kapacytacji in vitro). W tym konkretnym przypadku użyliśmy Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), barwnika przepuszczalnego dla membrany o K_d = 325 nM. In vitro monitorowaliśmy zmiany fluorescencji w funkcji czasu za pomocą trzech metodologii, a za pomocą czwartej techniki mierzyliśmy wartości fluorescencji w jednym określonym momencie. Te różne podejścia wzajemnie się uzupełniają, ponieważ razem zapewniają rozdzielczość przestrzenną i czasową zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji komórek.

Eksperymenty z populacją komórek lub masowe eksperymenty

Techniki masowe są szeroko stosowane nie tylko dlatego, że wymagane przez nie instrumenty są łatwo dostępne, ale także dlatego, że są proste, dobrze znane i pozwalają na uśrednianie informacji z pomiarów wykonanych na milionach komórek w jednym eksperymencie.

Technika #1. Fluorometria konwencjonalna
Technika ta monitoruje zmiany fluorescencji w funkcji czasu; Eksperymenty przeprowadzane są w szklanych kuwetach o objętości próbek od 200 do 1000 μl. Prawidłowe wymieszanie dodanych odczynników wymaga mieszania magnetycznego, a zatem uzyskana rozdzielczość czasowa jest rzędu sekund. Typowy zakres stężeń komórek analizowanych próbek wynosi 10^{5-10 8} komórek/ml.

Technika #2. Fluorometria zatrzymanego przepływu
Technika ta monitoruje również zmiany fluorescencji w funkcji czasu, ale odczynniki są szybko mieszane ze sobą (pod ciśnieniem) w kuwecie rejestrującej zawierającej bardzo małą objętość próbki (w zakresie 25-100 μl). W związku z tym homogenizacja odczynników jest natychmiastowa, co umożliwia uzyskanie wysokiej rozdzielczości czasowej rzędu milisekund. Analiza uzyskanych śladów fluorescencyjnych w funkcji czasu jest odpowiednia do określania szybkości reakcji, wyjaśniania złożoności mechanizmu reakcji, uzyskiwania informacji o krótkotrwałych produktach pośrednich reakcji itp. Typowy zakres stężeń komórek w analizowanych próbkach wynosi 10 5-10⁷ komórek/ml.

Eksperymenty z pojedynczą komórką

Eksperymenty zbiorcze informują o średnim zachowaniu dużej liczby komórek; jednak populacja może często wykazywać niejednorodne właściwości, które są pomijane podczas tego typu pomiarów. Techniki jednokomórkowe są zatem wykorzystywane do uzupełniania uzyskanych informacji za pomocą eksperymentów na populacji komórek.

Technika #3. Cytometria przepływowa
Pomimo znaczenia informacji wynikających z pomiarów pojedynczych komórek, ważne jest, aby analizować dużą liczbę komórek, aby zapobiec błędnej ekstrapolacji właściwości specyficznych dla komórek na całą populację. Z tego powodu preferowane są techniki wysokoprzepustowe, a najpopularniejszą metodą jest cytometria przepływowa, w której konwencjonalnie analizuje się 10 000 komórek na stan. Metoda ta umożliwia wieloparametryczną analizę populacji heterogenicznych, ponieważ kategoryzuje komórki według ich wielkości (FSC)), ziarnistości (rozproszenie boczne (SSC)) i intensywności fluorescencji (specyficzne znakowanie przeciwciałem, markerem żywotności itp.), dostarczając w ten sposób informacji na temat rozkładu parametrów dla grupy komórek. Cytometria przepływowa dostarcza natychmiastowych, a nie zależnych od czasu informacji ⁸. Wartości rozproszenia do przodu i bocznego są również przydatne do wybierania bramki, która zawiera komórki, ale rozróżnia zanieczyszczenia komórkowe, kurz itp. Do pomiarów fluorescencji należy również uwzględnić kontrole fluorescencji ujemnej i dodatniej. Jeśli używany jest więcej niż jeden kanał fluorescencyjny, należy przeprowadzić proces znany jako kompensacja (szczegóły patrz http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp). Kompensacja pozwala na dyskryminację nakładania się widmowego między fluoroforami. Cytometria przepływowa umożliwia również rozróżnianie martwych komórek, na ogół za pomocą barwienia jodkiem propidyny.

Technika #4. Obrazowanie pojedynczych komórek
Mikroskopia to kolejna powszechna metoda badania zachowania pojedynczych komórek; Doskonale nadaje się do badań zależnych od czasu, a także zapewnia rozdzielczość przestrzenną. Główną wadą jest to, że analiza wysokoprzepustowa jest obecnie dopiero w powijakach ⁹.

Protocol

W tym artykule opisujemy użycie czterech wyżej wymienionych technik do pomiaru zmian [Ca²⁺]_i w ludzkich plemnikach. Użyliśmy progesteronu, aby wywołać odpowiedź Ca^{2 +}, ponieważ dobrze wiadomo, że ten steryd powoduje przejściowy [Ca^{2 +}_{] i} wzrost plemników. W szczególności w ludzkim nasieniu progesteron bezpośrednio aktywuje kanał Ca²⁺ (a mianowicie CatSper) ulegający ekspresji wyłącznie w błonie komórkowej plemników ^10,11. Zmierzyliśmy również spoczynkowe [Ca^{2 +} ]_i przed i po pojemności, biorąc pod uwagę, że powszechnie przyjmuje się również, że wzrost [Ca^{2 +} ]_i występuje podczas pojemności. W przypadku technik wymagających kontroli pozytywnej zastosowaliśmy jonofor Ca^{2 +} -jonomycynę - w celu wywołania maksymalnego wychwytu Ca^{2 +} do komórki, a tym samym maksymalnej odpowiedzi fluorescencyjnej; dla minimalnej wartości fluorescencji użyliśmy Mn²⁺ do wygaszenia fluorescencji.

1. Przygotowanie próbki nasienia metodą swim-up (patrz rysunek 1)

Używaj tylko próbek z wytryskiem (uzyskanych przez masturbację), których cechy spełniają parametry ustalone przez najnowsze wydanie podręcznika laboratoryjnego Światowej Organizacji Zdrowia (dostępne pod adresem http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547789_eng.pdf ) do badania i przetwarzania ludzkiego nasienia.

1. Pobrać próbkę nasienia w sterylnym pojemniku i umieścić ją (z poluzowaną nakrętką) w inkubatorze w temperaturze 37 °C i CO₂ 5%/powietrze 95% przez 30 minut. Ten etap służy do upłynniania próbki.
2. Umieścić 500 μl podwielokrotności próbki skroplonego nasienia na dnie czystych szklanych probówek (1,0 x 7,5 cm). Do próbki średniej wielkości (4 ml) potrzeba około ośmiu probówek.
3. Ostrożnie nałożyć 1 ml pożywki F-10 szynki (uzupełnionej 2 mM CaCl₂ i 5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej w celu ułatwienia kapacytacji in vitro) na wierzch każdej podwielokrotności nasienia (patrz rysunek 1). napiwek: Dotknąć ścianki probówki końcówką mikropipety i delikatnie dozować pożywkę nad próbką. Bardzo ważne jest, aby robić to powoli, ponieważ należy unikać mieszania się obu warstw (próbki i pożywki).
4. Ostrożnie pochyl rurki pod kątem około 30 °. Zwiększy to powierzchnię między dwiema cieczami, zwiększając w ten sposób przemieszczanie (pływanie) komórek ludzkich z próbki do pożywki podczas inkubacji.
5. Umieść grupę ubogich probówek w inkubatorze w temperaturze 37 °C i CO₂ 5%/powietrze 95% przez 1 godzinę.
6. Za pomocą mikropipety ostrożnie usunąć górne 700 μl pożywki F-10 firmy HAM (obecnie zawierającej ruchliwe plemniki) z każdej probówki i zebrać wszystkie pobrane próbki w jednej czystej szklanej probówce (1,0 x 7,5 cm; w przypadku większych objętości należy użyć probówki Falcon o pojemności 15 ml), unikając tworzenia się pęcherzyków. Umieść 10 μl próbki zbiorczej na płaskim szkle optycznym podstawy komory liczącej Maklera, a następnie umieść szkło nakrywkowe (po założeniu pokrywy unikaj ponownego podnoszenia lub przykrywania się, aby utrzymać równomierne rozprowadzenie próbki nasienia). Upewnij się, że nie tworzysz się pęcherzyków wewnątrz komory, ponieważ spowodowałoby to niedokładną liczbę komórek.
7. Obserwuj pod mikroskopem złożonym (zalecane jest użycie obiektywu 20X). Szkło nakrywkowe komory liczącej Makler ma duży kwadrat złożony ze 100 mniejszych kwadratów (tj. siatki 10 na 10). Policz komórki w dowolnym pasku 10 kwadratów. Liczba ta reprezentuje ich stężenie w milionach komórek/ml. Powtórz liczenie w dwóch dodatkowych 10-kwadratowych paskach i oblicz średnią z tych trzech zliczeń. nuta: Jeśli komora do liczenia Maklera (która jest specjalnie zaprojektowana do liczenia plemników) nie jest dostępna, można użyć dowolnej komory hemocytometru.
8. Dostosować końcowe stężenie próbki do 1x10⁷ komórek/ml w uzupełnionej pożywce F-10 szynki. W razie potrzeby inkubować próbkę w temperaturze 37 °C i CO₂ 5%/powietrze 95% przez 5 godzin, aby zwiększyć zdolność.

2. Obciążenie barwnikiem fluorescencyjnym dla pomiarów Ca²⁺

Dostępnych jest kilka barwników fluorescencyjnych do pomiaru wewnątrzkomórkowego Ca²⁺; odpowiedni musi być wybrany zgodnie z jego K_d, oraz jego długościami fal emisji i wzbudzenia (dla pomiarów jakościowych i ilościowych należy użyć odpowiednio pojedynczych i podwójnych długości fal emisji i wzbudzenia) (odwiedź http://es-mx.invitrogen.com/search/global/searchAction.action?query=ion+indicators&resultPage=1&resultsPerPage=15 aby uzyskać więcej informacji). Do niniejszej aplikacji jakościowej użyliśmy Fluo-3 AM, barwnika przepuszczalnego dla komórek o K_d = 325 nM oraz długościach fal pojedynczej emisji i wzbudzenia odpowiednio 506/526 nm, ¹².

1. Przygotować 50 μl 1 mM roztworu podstawowego Fluo-3 AM, rozpuszczając zawartość jednej fiolki z barwnikiem o pojemności 50 μg (MW = 1130 g/mol) w 44 μl bezwodnego DMSO.
2. Używając 1,5 ml probówki do mikrofuge, wymieszaj wymaganą objętość zawiesiny nasienia (patrz wymagana ilość dla każdej konkretnej techniki poniżej) z wystarczającą ilością 1 mM roztworu podstawowego Fluo-3 AM, aby uzyskać końcowe stężenie 2 μM Fluo-3 AM (tj. 1 μl Fluo-3 AM dodaje się na każde 500 μl zawiesiny nasienia).
3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chronić przed światłem.
4. Odwirować probówkę przy 750 x g przez 5 minut za pomocą mikrowirówki, odessać i odrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości (patrz wymagane stężenie dla każdej konkretnej techniki poniżej) pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM; mM: 120 NaCl, 15 NaHCO₃, 4 KCl, 1,8 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES, 10 Na mleczan, 5 D-glukoza, 1 pirogronian Na, pH = 7,4). nuta: Tworzenie się chmury, a nie granulki, wskazuje, że komórki są w dobrym stanie.
5. Komórki są teraz ładowane barwnikiem; pozostają żywotne (utrzymywane w temperaturze 37 °C i chronione przed światłem) przez około dwie godziny i mogą być używane w dowolnej z poniższych technik.

3. Technika #1. Fluorometria konwencjonalna (średnie informacje z dużej populacji komórek)

Sprzęt: Do pomiarów populacji plemników [Ca²⁺]_i używamy spektrofluorometru SLM Aminco obsługiwanego przez oprogramowanie Olis (Bogart, GA, USA) z mieszadłem magnetycznym (SIM Aminco) i sprzężonego z niebieską diodą LED (Luxeon Star LXHL-LB3C, od LUMILEDS) i filtrem pasmowo-przepustowym 465-505 nm (Chroma Technology Corp.) do wzbudzenia Fluo-3 AM. Dioda LED jest sterowana za pomocą specjalnie zaprojektowanego zasilacza (700 mA). Światło emisyjne mierzy się, ustawiając długość fali emisji (λ_Em) na 525 nm na monochromatorze spektrofluorometru.

1. Umieścić 570 μl HSM i 30 μl zawiesiny plemników (uprzednio załadowanych Fluo-3 AM i ponownie zawieszonych w HSM w celu uzyskania 1x10⁸ komórek/ml) w szklanej probówce z płaskim dnem (ID 8 x 50 mm). Umieścić mieszadło magnetyczne wewnątrz probówki i włożyć probówkę do komory odczytu spektrofluorometru (podgrzanej do 37 °C), mieszać próbkę przez cały czas akwizycji.
2. Rozpocznij eksperyment za pomocą oprogramowania sprzętu (w tym przypadku oprogramowania Olis) i przystąp do pomiaru wartości fluorescencji z częstotliwością 0,5 Hz przez 300 sekund. Zastosuj pożądane związki testowe przez wstrzyknięcie odpowiedniej objętości z roztworu podstawowego (zwykle 100 razy bardziej stężonego niż pożądane stężenie końcowe) za pomocą mikrostrzykawki Hamiltona w następujący sposób:
   1. Uzyskaj fluorescencję podstawową przez 30 sekund.
   2. Dodać 4 μM progesteronu (Pg).
   3. Po 100 sekundach dodać 20 μM jonomycyny (jako kontrolę pozytywną, aby uzyskać maksymalną wartość fluorescencji).
3. Przeprowadzić kontrolę ujemną, powtarzając kroki 3.1 do 3.2.3 powyżej, ale dodając zamiast Pg tylko rozpuszczalnik użyty do rozpuszczenia (HSM z 0,01% bezwodnym DMSO).
4. Wyeksportuj surowe wartości intensywności fluorescencji do programu Microsoft Excel i znormalizuj je za pomocą następującego równania: (F/F0) - 1. Gdzie F jest intensywnością fluorescencji mierzoną w dowolnym momencie (t), a F0 jest średnią podstawową fluorescencją uzyskaną w ciągu początkowych 30 sekund. Wykreślić całkowity szereg wartości (F/F0) - 1 w funkcji czasu (Rysunek 2A). Zmierzyć różnicę między wartościami intensywności fluorescencji przed i po dodaniu badanych związków (ΔF), nanieść je na wykres słupkowy i przetworzyć dane, stosując odpowiednie metody analizy statystycznej (rysunek 2B).

4. Technika #2. Fluorometria zatrzymanego przepływu (informacje o wysokiej rozdzielczości czasowej z dużej populacji komórek)

Sprzęt: Wewnątrzkomórkowe [Ca²⁺] zmiany są mierzone z wysoką rozdzielczością czasową za pomocą mieszalnika SFM-20 z zatrzymanym przepływem sprzężonego z systemem optycznym MOS-200 o szybkiej kinetyce, oba z instrumentów naukowych BioLogic (Grenoble, Francja). Wszystkie dane są analizowane za pomocą oprogramowania Bio-Kine32 tej samej firmy.

1. Ustawić odpowiednie warunki w urządzeniu; źródło oświetlenia powinno być włączone co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem doświadczenia; wyregulować filtry wzbudzenia i emisji, ustawić fotopowielacz na wartość napięcia w zakresie ustalonym przez producenta zatrzymanego przepływu i ustawić temperaturę kąpieli na 37 °C.
2. Napełnić jedną ze strzykawek instrumentu 1 ml plemników Fluo-3 AM (1X10⁷ komórek/ml), a drugą strzykawkę 1 ml badanego związku, HSM (kontrola ujemna), 10 μM jonomycyny (kontrola pozytywna) lub 10 μM Pg rozpuszczonego w HSM. nuta: Na tym etapie ważne jest, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków podczas pobierania płynów do strzykawek.
3. Podnieś oba tłoki instrumentu, aż dotkną końcówki tłoków strzykawki.
4. Ustaw natężenie przepływu na minimalną wartość, która zapewni mierzalną odpowiedź w celu zminimalizowania uszkodzenia ogniw. Natężenie przepływu, które stosujemy w systemie SFM-20 wynosi 1 ml/sec ¹³.
5. Ustaw częstotliwość (w tym przypadku 10 ms) i całkowity czas próbkowania (w tym przypadku 50 sekund).
6. Uruchomić mieszanie odczynników. nuta: Podczas gdy pojedynczy spust na raz może być wykonywany ręcznie, zestaw automatycznych kolejnych wyzwalaczy może być również wstępnie zaprogramowany.
7. Ślad surowej fluorescencji (dowolne jednostki) w funkcji czasu jest wyświetlany na ekranie komputera.
8. Mieszanie odczynników samo w sobie spowoduje powstanie śladu, który nie jest linią prostą. Tak więc, aby uzyskać rzeczywistą zmianę [Ca²⁺] pochodzącą z bodźca, ślad kontrolny uzyskany z mieszania komórek z pożywką (kontrola ujemna) musi zostać odjęty od każdego ze śladów doświadczalnych. Analizuj dane zgodnie z wymaganiami; niektóre parametry kinetyczne można również uzyskać za pomocą oprogramowania do akwizycji Bio-Kine32. Surowe ślady bez odejmowania pokazano na rysunku uzupełniającym 1 dla porównania.
9. Aby zmienić odczynnik w strzykawce ze związkiem testowym, należy ją dokładnie oczyścić wodą destylowaną. Następnie napełnić strzykawkę do maksymalnej objętości wodą destylowaną, umieścić ją w odpowiednim tłoku fluorometru z zatrzymanym przepływem i przepchnąć wodę przez wewnętrzny mechanizm (woda do płukania musi być skierowana do pojemnika na odpady). Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
10. Powtórzyć kroki od 4.2 do 4.9, napełniając drugą strzykawkę następnym żądanym związkiem testowym.
11. Pod koniec eksperymentu przepłucz cały sprzęt wodą destylowaną, całkowicie spuszczając wodę z wewnętrznych węży.

5. Technika #3. Cytometria przepływowa (informacje o pojedynczej komórce uzyskane z dużej liczby komórek)

Sprzęt: Ta technika pozwala na jednoczesny pomiar kilku parametrów w jednym momencie, ale w przeciwieństwie do poprzednich technik, nie mierzy zmian w czasie, a raczej dostarcza wartości parametrów w momencie pomiaru. Dlatego zamiast dodawać Pg w celu wywołania odpowiedzi, w tym przypadku zmierzyliśmy wewnątrzkomórkowe poziomy Ca^{2 +} w plemnikach przed i po indukowaniu kapacytacji. Użyliśmy cytometru FACSCanto (Becton Dickinson), a dane zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania FlowJo (Tree Star 9.3.3).

1. Przygotować próbki doświadczalne w probówkach cytometrycznych, umieszczając 500 μl zawiesiny komórek (4x10⁶ komórek/ml) na probówkę w każdych warunkach, które mają być badane (w tym przypadku dziesięć warunków; patrz tabela 1). Zbierz dane fluorescencyjne z 10 000 zdarzeń na próbkę.
2. Aby skonfigurować eksperyment, użyj oprogramowania sprzętowego, aby:
   1. Utwórz nowy: folder, eksperyment, próbkę i liczbę probówek.
   2. Wybierz odpowiednie ustawienia cytometru dla filtra Fluo-3 AM (użyj filtra izotiocyjanianu fluoresceiny) i PI (użyj filtra PI -jodku propidyny).
3. Uruchom niezabarwione probówki kontrolne 1 i 2 w cytometrze. Zbierz dane FSC i SSC, aby sprawdzić, czy ustawienia progowe są odpowiednie i utworzyć odpowiednią bramkę w celu odróżnienia zanieczyszczeń od komórek.
4. Aby utworzyć kontrole kompensacji, uruchom następujące próbki kontrolne, zbierając dane dotyczące automatycznej i maksymalnej fluorescencji (kanały PI i FITC) (UWAGA: to zadanie jest zwykle wykonywane przez technika sprzętu):
   - Niebarwione komórki (probówki 1 i 2).
   - Ogniwa załadowane Fluo-3 AM (2 μM) (probówki 3 i 4).
   - Martwe komórki (plemniki zawieszone w 0,1% Triton X-100 w HSM przez 10 min w temperaturze pokojowej) barwione PI (1,2 μM PI; tj. 0,25 μl z 2,4 mM PI dodaje się do 500 μl zawiesiny nasienia) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem (probówki 5 i 6).
   • Przeglądaj zarejestrowane dane i wybierz bramkę dla żądanych populacji.
   • Wyreguluj bramkę i wybierz "Zastosuj" do wszystkich elementów sterujących kompensacją.
   • Wybierz konfigurację kompensacji eksperymentu > > obliczyć kompensację.
   • Zmień nazwę konfiguracji wynagrodzeń i połącz i zapisz.
5. Uruchom wszystkie probówki eksperymentalne (w tym przypadku probówki 7-10). Na koniec wyeksportuj wszystkie dane do oprogramowania dostępnego do analizy (patrz krok 5.6).
6. Analizuj wyniki każdego eksperymentu za pomocą oprogramowania sprzętu, dostępnego na rynku oprogramowania FlowJo lub bezpłatnego oprogramowania Cytobank (http://www.cytobank.org/).

6. Technika #4. Obrazowanie pojedynczych komórek (informacje o pojedynczej komórce o wysokiej rozdzielczości przestrzennej)

Sprzęt: Niestandardowy zestaw do obrazowania. Nasz zestaw do obrazowania składa się z odwróconego mikroskopu Diaphot 300 firmy Nikon wyposażonego w regulator temperatury (Medical System Corp., Greenvale, Nowy Jork), obiektywu Nikon PlanApo 60X (zanurzenie w oleju 1,4 NA). Oświetlenie fluorescencyjne zapewnia dioda LED Luxeon V Star Lambertian Cyan część # LXHL-LE5C (Lumileds Lighting LLC, San Jose, CA) przymocowana do specjalnie zbudowanej stroboskopowej skrzynki kontrolnej. Dioda LED została zamontowana w zestawie FlashCube40 z lustrem dichroicznym M40-DC400 (Rapp Opto Electronic, Hamburg, Niemcy) (pasma przenoszenia: wzbudzenie 450-490 nm, zwierciadło dichroiczne 505 nm, emisja 520-560 nm). Wyjście LED zostało zsynchronizowane z sygnałem wyjścia ekspozycji kamery CCD Cool Snap za pośrednictwem skrzynki sterowniczej, aby wytworzyć pojedynczy błysk o czasie trwania 2 ms na pojedynczą ekspozycję. Czas naświetlania aparatu został ustawiony na równowartość czasu trwania błysku (2 ms). Obrazy są zbierane co 250 ms (lub mogą być dostosowywane zgodnie z żądaną rozdzielczością czasową) za pomocą oprogramowania IQ (Andor Bioimaging, Wilmington, NC).

1. Przygotować okrągłe szkiełka nakrywkowe (średnica = 25 mm), nakładając na środek 5 μl kropli roztworu poli-L-lizyny (0,01 % w/v). Odstawić na co najmniej 1 godzinę (może wyschnąć). Za pomocą butelki ze spryskiwaczem spłucz leczony obszar wodą przed użyciem. Ta procedura pozwoli plemnikom przylgnąć do szkiełka nakrywkowego z głowy, podczas gdy ich wić może się nadal poruszać.
2. Przygotować związki do badania, rozpuszczając je w HSM zgodnie z tabelą 2. Związki są dodawane sekwencyjnie do tej samej komory rejestracyjnej, upewniając się, że zawsze dodaje się tę samą objętość i dostosowuje się stężenie roztworu podstawowego, biorąc pod uwagę rozcieńczenie, jakie będzie ono miało po zmieszaniu z objętością już obecną w komorze (jak wskazano w tabeli 2). Przechowywać wszystkie roztwory testowe w kąpieli w temperaturze 37 °C do czasu ich użycia.
3. Zamontuj szkiełko nakrywkowe w komorze zapisu i umieść 10 μl komórek Fluo-3 AM (1 x 10⁷ komórek/ml) pośrodku. Przykryj komórki 200 μl wstępnie podgrzanego HSM.
4. Umieścić komorę na stoliku mikroskopu podgrzanym do temperatury 37 °C, obejrzeć komórki (za pomocą kontrastu fazowego) i wybrać obszar do obrazowania. Ważne jest, aby wybrać obszar, w którym gęstość komórek jest odpowiednia (patrz rysunek 5A); Zbyt wiele komórek utrudnia analizę ze względu na nakładające się sygnały. nuta: Komórki powinny być mocno przymocowane do szkiełka nakrywkowego za głowę, ale wykazujące ruch wiciowy, co potwierdza ich żywotność.
5. Rejestruj obrazy fluorescencyjne w trybie na żywo, aby dostosować ostrość i jasność.
6. Rozpocznij eksperyment od aktywacji oprogramowania do akwizycji obrazów szeregów czasowych (w tym przypadku IQ). Zazwyczaj rejestrowane są cztery obrazy na sekundę przy oświetleniu wynoszącym 2 ms na obraz.
7. Za pomocą mikropipety ostrożnie dodać (kroplami) badany związek (w tym przypadku Pg), kontynuować akwizycję obrazu zgodnie z wymaganiami i wykonać dwa sekwencyjne dodatki kontrolne do tej samej komory: (1) 20 μM jonomycyny w celu uzyskania maksymalnej fluorescencji i (2) 5 mM MnCl₂ w celu uzyskania minimalnej fluorescencji. Alternatywnie, związki mogą być dodawane za pomocą komory perfuzyjnej, która oferuje zalety umożliwiające usuwanie bodźców i możliwość równomiernego zanurzania komórek w związku. Jednocześnie ma wady polegające na tym, że wymaga większych ilości roztworu i sprawia, że kontrola temperatury jest bardziej problematyczna.
8. Powtórz akwizycję w nowej komorze z każdym pożądanym związkiem testowym.
9. Wykonuj analizę obrazu online za pomocą oprogramowania sprzętu lub offline za pomocą oprogramowania IQ Software lub darmowego oprogramowania Image J. Narysuj obszary zainteresowania (ROI) wokół każdej komórki (lub części komórki), a także wybierz obszar wolny od komórek (do automatycznego odejmowania tła przez oprogramowanie). Następnie dla każdego zwrotu z inwestycji uzyskuje się szereg intensywności fluorescencji w czasie, a dane te można wyeksportować do programu Microsoft Excel w celu dalszej analizy. Wartości intensywności fluorescencji normalizujemy za pomocą następującego równania: (F/F0) - 1. Gdzie F jest intensywnością fluorescencji mierzoną w dowolnym momencie (t), a F0 jest średnią fluorescencją wykonaną w ciągu początkowych 30 sekund. Wykreślić całkowitą serię (F/F0) - 1 w funkcji czasu (Rysunek 5B). Wartości mogą być również znormalizowane przy użyciu wartości fluorescencji uzyskanej po dodaniu jonomycyny jako 100%.
10. Analiza obrazu może być alternatywnie wykonana za pomocą bezpłatnego oprogramowania Image J.

Technika #1. Fluorometria konwencjonalna

Progesteron jest jednym ze znanych induktorów AR i, zgodnie z oczekiwaniami, powoduje przejściowy [Ca²⁺]_i wzrost liczby plemników u ludzi (pokazany na rysunku 2). Dodanie jonoforu wapnia (jonomycyny) powoduje maksymalny wzrost [^Ca2+]_i, który nie wraca do poziomu podstawowego.

Technika #2. Fluorometria zatrzymanego przepływu

Wzrost [Ca²⁺]_i wywołany progesteronem został zmierzony jak poprzednio (konwencjonalna fluorometria), ale tym razem z większą rozdzielczością czasową; w tym przypadku częstotliwość akwizycji wynosiła 0,1 Hz. Jak pokazano na rycinie 3, zarówno progesteron (przemijająca, czerwona linia), jak i jonomycyna (trwała, niebieska linia) powodowały bardzo szybki wzrost [Ca^{2 +} ]_i. Brak opóźnienia we wzroście [Ca^{2 +}] i wywołanym progesteronem jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami sugerującymi, że progesteron bezpośrednio aktywuje kanał Ca^{2 +} CatSper, bez sygnalizacji pośredniej ^10,14.

Technika #3. Cytometria przepływowa

[Ca²⁺]_i mierzono w zdolnych i niezdolnych do działania plemnikach ludzkich. Jak wcześniej informowano u myszy ¹⁵, plemników bydlęcych ¹⁶ i plemników ludzkich ¹⁷, zaobserwowaliśmy również zwiększoną [Ca^{2 +} ]_i w plemnikach ludzkich pojemnościowych w porównaniu z plemnikami ludzkimi bez pojemności. Baldi i in. (1991) ¹⁷ zgłosili wyższą podstawową [Ca^{2 +}] i u zpojemnościowych niż u niezpojemnościowych plemników ludzkich przy użyciu konwencjonalnej fluorometrii. W niniejszej pracy wykorzystano cytometrię przepływową do pomiaru [Ca²⁺]_i przed i po kapacytacji in vitro. Cytometria przepływowa pozwala nam zobaczyć, że rozkład wartości fluorescencji dla plemników zpojemnościowych (ryc. 4D, niebieski ślad) jest przesunięty do wyższych wartości w porównaniu z plemnikami niezpojemnościowymi (ryc. 4D, czerwony ślad). Wartości fluorescencji dla każdej pojedynczej komórki można zaobserwować na dwuwymiarowych wykresach punktowych pokazanych na rysunku 4G; co ważne, sygnał powstający z martwych komórek (około 15%) może zostać wyeliminowany (ryc. 4G, górne ćwiartki).

Technika #4. Obrazowanie pojedynczych komórek

Zmiana [Ca²⁺]_i wywołana progesteronem została zmierzona w pojedynczych plemnikach. Dodanie progesteronu powoduje przyrost [Ca²⁺]_i zarówno w główce plemnika, jak i w wici. Jak zaobserwowano w eksperymentach populacyjnych, analiza pojedynczych komórek wykazała przejściowy i trwały wzrost odpowiednio progesteronu i jonomycyny.

Results

Rysunek 1. Schemat ideowy protokołu doświadczalnego przygotowania próbki nasienia metodą swim-up. Przedstawiono główne etapy oddzielania ruchliwych plemników i regulacji ich stężenia. Ostatni etap inkubacji jest wykonywany tylko wtedy, gdy wymagana jest pojemność.

Discussion

Sygnalizacja wewnątrzkomórkowa jest niezbędna dla większości czynności komórkowych; Ca²⁺ jest wszechobecnym posłańcem, który towarzyszy komórkom ssaków przez całe ich życie, od ich powstania w momencie zapłodnienia, aż do końca cyklu życiowego. W odpowiedzi na różne bodźce [Ca²⁺]i wzrasta, oscyluje i maleje wraz z kodyfikacją czasoprzestrzenną; w związku z tym różne procesy są aktywowane, modulowane lub kończone przez komunikaty zakodowane w Ca²⁺. Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca^{2 +}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A-7906
Chlorek wapnia dwuwodny ok. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Komora licząca Maklera	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 fiolek/50 μ g każdy
Jonomycyna	Alomone	I-700
Progesteron	Sigma-Aldrich	P0130
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S-9888	Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P-3911	Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)
Wodorowęglan sodu	JT Baker	3506	Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M-2670	Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)
Bezwodny chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C-1016	Odczynniki do podłoża dla nasienia ludzkiego (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Odczynniki do podłoża dla nasienia ludzkiego (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Odczynniki do nasienia ludzkiego podłoże (HSM)
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	P-2256	Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)
L-mleczan sodu (ok. 99%)	Sigma-Aldrich	L-7022	Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)
Jodek propidium	Invitrogen	L-7011	Składnik B
Triton X-100 (t-oktylofenoksyetoksyetanol)	Sigma-Aldrich	X-100	roztwór 2,4 mM w wodzie
Okrągłe szkiełko nakrywkowe	VWR	48380 080	o średnicy 25 mm
Roztwór poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich	P8920
Chlorek manganu	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Komora komórkowa, do mikroskopii	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml