W tym artykule przedstawiamy metodę analizy mikronaczyń guza in vivo za pomocą dynamicznej wideomikroskopii fluorescencyjnej wzmocnionej kontrastem. Uzyskano dwa parametry ilościowe: funkcjonalną gęstość naczyń włosowatych odzwierciedlającą unaczynienie guza oraz nieszczelność wskaźnika odzwierciedlającą nieszczelność ściany śródbłonka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Obrazowanie angiogenezy guza za pomocą fluorescencyjnej wideomikroskopii konfokalnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Światłowodowa fluorescencja konfokalna in vivo obrazowanie z wiązką światłowodów wykorzystuje tę samą zasadę, co fluorescencyjna mikroskopia konfokalna. Może wzbudzać fluorescencyjne elementy in situ przez światłowody, a następnie rejestrować niektóre z emitowanych fotonów za pośrednictwem tych samych światłowodów. Źródłem światła jest laser, który wysyła ekscytujące światło przez element w wiązce światłowodów, a podczas skanowania próbki odtwarza obraz piksel po pikselu. Ponieważ skan ten jest bardzo szybki, dzięki połączeniu go z dedykowanym oprogramowaniem do przetwarzania obrazu, można uzyskać obrazy w czasie rzeczywistym z częstotliwością 12 klatek na sekundę.
Opracowaliśmy technikę ilościowego charakteryzowania morfologii i funkcji naczyń włosowatych, używając urządzenia do wideomikroskopii fluorescencji konfokalnej. Pierwszym krokiem w naszym eksperymencie było nagranie 5-sekundowych filmów w czterech kwadrantach guza, aby uwidocznić sieć naczyń włosowatych. Wszystkie filmy zostały przetworzone za pomocą oprogramowania (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paryż, Francja), które wykonuje automatyczną segmentację naczyń wokół wybranej średnicy (w naszym przypadku 10 μm). W ten sposób możemy określić ilościowo "funkcjonalną gęstość naczyń włosowatych", która jest stosunkiem między całkowitą powierzchnią naczynia a całkowitą powierzchnią obrazu. Parametr ten był zastępczym markerem gęstości mikrokrążenia, zwykle mierzonym za pomocą narzędzi patologicznych.
Drugim krokiem było nagranie filmów guza przez ponad 20 minut, aby określić ilościowo wyciek makromolekularnego środka kontrastowego przez ścianę naczynia włosowatego do śródmiąższu. Mierząc stosunek natężenia sygnału w śródmiąższu do natężenia w naczyniach, uzyskano "nieszczelność wskaźnika", działającą jako zastępczy marker przepuszczalności naczyń włosowatych.
Wprowadzenie
Angiogeneza to złożony proces 1, który polega na tworzeniu nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń. Patologiczne zmiany w mikrokrążeniu tkankowym, składającym się z tętniczek, naczyń włosowatych i żyłek, są związane z wieloma chorobami, takimi jak rak, stany zapalne lub cukrzyca. W związku z tym konieczne jest opracowanie metod ilościowej oceny struktury i funkcji mikronaczyń. Obrazowanie umożliwia badanie mikronaczyń w sposób nieinwazyjny lub mikroinwazyjny, w czasie rzeczywistym i in vivo, a także powtarzanie pomiarów w czasie u tego samego zwierzęcia 2.
Obecnie, dynamiczne obrazowanie z kontrastem (DCE) 3 jest powszechnie używane do oceny mikrokrążenia tkankowego. Dynamiczne obrazowanie ze wzmocnieniem kontrastowym to technika, która w czasie śledzi biodystrybucję znacznika wstrzykniętego dożylnie. Z tego akwizycji można wyodrębnić parametry ilościowe odzwierciedlające unaczynienie tkanek. Obrazowanie DCE jest najczęściej stosowane w tomografii komputerowej, rezonansie magnetycznym lub ultrasonografii. Te techniki obrazowania nie pozwalają jednak na bezpośrednie oglądanie mikronaczyń, ponieważ ich rozdzielczość, inna niż przy użyciu określonych urządzeń eksperymentalnych, najczęściej pozostaje makroskopowa.
W tym artykule proponujemy zbadanie układu naczyniowego guza w skali mikroskopowej i in vivo za pomocą dynamicznego obrazowania optycznego wzmocnionego kontrastem, z wideomikroskopią konfokalną światłowodową. Zastosowaliśmy makrocząsteczkowy środek kontrastowy (FITC-dextran), który pozostaje wyłącznie w naczyniach lub przecieka przez barierę śródbłonkową do śródmiąższu, zgodnie z jego masą cząsteczkową i charakterystyką śródbłonka badanej tkanki 4. Pozwoliło to na zbadanie zarówno struktury mikronaczyń poprzez prawidłowe wytyczenie naczyń, jak i przepuszczalności kapilarnej, poprzez nieszczelność i gromadzenie się w śródmiąższu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie środka kontrastowego
- W przypadku FITC-dekstranu o stężeniu 70 kDa wstrzykiwana dawka wynosi 500 mg/kg (10 mg dekstranu FITC rozcieńczonego w 0,1 ml soli fizjologicznej dla myszy o masie ciała 20 g).
- Środek nie powinien być zbyt długo wystawiony na działanie światła. Aby uniknąć wybielania, zaleca się przykrycie tubki folią aluminiową.
2. Znieczulenie
- Myszy znieczulono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny 1:4 ksylazyny (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Francja) i ketaminy (Kétamine 500, Virbac, Carros, Francja), odpowiednio 66 mg/kg i 264 mg/kg dla myszy 20 g.
3. Przygotowanie interesującego organu
- Ogoliliśmy myszy w miejscu zainteresowania (na przykład nad guzem podskórnym). Sierść zwierzęca jest często autofluorescencyjna, gdy jest biała. Gdy jest, pochłania światło.
- Skóra zwrócona w stronę narządu, który miał być zobrazowany, została nacięta. Ważne jest, aby poczekać, aż krwawienie ustanie przed wstrzyknięciem środka kontrastowego, w przeciwnym razie wycieknie on do krwi i zanieczyści obraz.
4. Akwizycja
- Środek kontrastowy wstrzykiwano albo przez żyłę szyjną, albo przez żyłę ogonową. Brak sygnału tła w narządzie lub obserwowany jest niewielki przy braku fluorescencyjnego środka kontrastowego.
- Sondę umieszczono przed organem, który miał być zobrazowany. W naszym badaniu był to guz.
- Laser został włączony, aby oświetlić guz i zobaczyć fluorescencję w naczyniach włosowatych.
- Guz badano ręcznie, przesuwając sondę bardzo powolnym ruchem podczas nagrywania w celu wizualizacji sieci naczyń włosowatych. Ważne jest, aby utrzymać pewną rękę, a ta technika wymaga trochę doświadczenia. W naszym badaniu ten pierwszy krok pozwolił na ilościowe określenie funkcjonalnej gęstości naczyń włosowatych.
- Drugim krokiem była dynamiczna akwizycja w czasie. Do tego badania użyliśmy dekstranu FITC o mocy 70 kDa. W większości normalnych narządów nie ma przecieku śródmiąższowego, ale jest w guzach. Aby uzyskać obrazy tej samej lokalizacji w czasie (tak jak w naszym przypadku), ważne jest, aby skonfigurować system utrzymujący sondę na obszarze zainteresowania. Dokonano tego za pomocą ręcznie wykonanej podpory do trzymania sondy oraz poprzez umieszczenie odrobiny żelu ultradźwiękowego na końcówce sondy. Przed rejestracją poświęcono czas na ustabilizowanie sondy umieszczonej w kontakcie z guzem. Po ustaleniu pozycji ruch był tylko minimalny ze względu na oddech myszy. Laser został włączony tak, aby rejestrować 3 obrazy co 30 sekund przez 20 minut w celu wykrycia obecności nieszczelności kapilarnej. Był wyłączany między każdym nagraniem, aby zmniejszyć wybielanie środkiem kontrastowym.
- W naszym eksperymencie myszy zostały poświęcone pod koniec procedury w celu analizy histologicznej guzów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystując zgromadzone dane, mogliśmy ilościowo przeanalizować różne parametry odzwierciedlające mikrokrążenie.
Przeprowadziliśmy badanie in vivo obwodowej sieci naczyniowej guza okrężnicy wszczepionego myszom balb-c, wykorzystując system światłowodowej konfokalnej wideomikroskopii fluorescencyjnej (Cellvizio, Maunakea Technology, Paryż, Francja 2), po wstrzyknięciu makromolekularnego fluorescencyjnego środka kontrastowego: izotiocyjaniany fluoresceiny-dekstranu (FITC-de...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie mikrokrążenia guza stało się niezbędne do zrozumienia patofizjologii wzrostu, rozprzestrzeniania się i odpowiedzi guza na terapię 1. Obrazowanie optyczne jest jedną z technik, które można wykorzystać do obserwacji naczyń włosowatych za pomocą fluorescencyjnego środka kontrastowego oraz do ilościowego określenia parametrów morfologicznych (funkcjonalna gęstość naczyń włosowatych) i funkcjonalnych (przeciek wskaźnika).
Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym, które zastosowal...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Serynge insuliny Myjector 1ml 29G | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL rozcieńczony w soli fizjologicznej |
| Wideomikroskopia konfokalna z włóknami | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Zestaw do kalibracji i czyszczenia dla LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Sklep pod adresem 4 ° C |
| ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Oprogramowanie do mozaiki | MaunaKea Technologies Oprogramowanie | ||
| do wykrywania naczyń | MaunaKea Technologies |
Bibliografia
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
