In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Podsumowanie

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

Streszczenie

Nicienie C. elegans to idealny organizm modelowy do stosunkowo prostego, taniego obrazowania neuronów in vivo. Jego małe, przezroczyste ciało i prosty, dobrze scharakteryzowany układ nerwowy umożliwiają identyfikację i obrazowanie fluorescencyjne dowolnego neuronu w nienaruszonym zwierzęciu. Proste techniki unieruchamiania przy minimalnym wpływie na fizjologię zwierzęcia pozwalają na wydłużone obrazowanie poklatkowe. Opracowanie genetycznie kodowanych wrażliwych na wapń fluoroforów, takich jak cameleon ¹ i GCaMP ², umożliwia obrazowanie in vivo neuronalnego wapnia związanego zarówno z fizjologią komórki, jak i aktywnością neuronalną. Liczne szczepy transgeniczne wykazujące ekspresję tych fluoroforów w określonych neuronach są łatwo dostępne lub mogą być konstruowane przy użyciu dobrze znanych technik. W tym miejscu opisujemy szczegółowe procedury pomiaru dynamiki wapnia w pojedynczym neuronie in vivo przy użyciu zarówno GCaMP, jak i cameleonu. Omawiamy zalety i wady obu, a także różne metody przygotowania próbek (unieruchomienie zwierząt) i analizy obrazu. Na koniec przedstawiamy wyniki dwóch eksperymentów: 1) Użycie GCaMP do pomiaru odpowiedzi sensorycznej określonego neuronu na zewnętrzne pole elektryczne oraz 2) Użycie cameleonu do pomiaru fizjologicznej odpowiedzi wapniowej neuronu na urazowe uszkodzenie lasera. Techniki obrazowania wapnia, takie jak te, są szeroko stosowane u C. elegans i zostały rozszerzone na pomiary u swobodnie poruszających się zwierząt, wielu neuronów jednocześnie i porównania między tłami genetycznymi. C. Elegans prezentuje solidny i elastyczny system do obrazowania neuronów in vivo, który ma przewagę nad innymi systemami modelowymi pod względem prostoty technicznej i kosztów.

Wprowadzenie

Tutaj prezentujemy praktyczne metody obrazowania in vivo wapnia w neuronach C. elegans. Rozwój genetycznie kodowanych, wrażliwych na wapń fluoroforów o wysokim stosunku sygnału do szumu sprawia, że C. elegans jest stosunkowo prostym i opłacalnym systemem pomiaru neurofizjologii i aktywności. Nasze obrazowanie odbywa się za pomocą standardowego mikroskopu złożonego z wykorzystaniem szerokokątnego obrazowania fluorescencyjnego powszechnie dostępnych fluoroforów. Przedstawiamy kilka technik wykorzystujących różne fluorofory i różne preparaty próbek, omawiając mocne i słabe strony każdej z nich. Następnie prezentowane są dane z dwóch przykładowych eksperymentów. Doskonałe dodatkowe źródło informacji na temat opisanych tu technik można znaleźć w WormBook, "Obrazowanie aktywności neuronów i mięśni" R. Kerra, (http://www.wormbook.org) ³.

Dwie główne klasy genetycznie kodowanych fluorescencyjnych reporterów wapnia są powszechnie używane u C. elegans: jednokanałowy GCamp i cameleon oparty na FRET. Opiszemy metody i pokażemy przykłady dla danych generowanych przez każdą z nich.

GCaMP opiera się na zmodyfikowanym białku zielonej fluorescencji (GFP), które jest wrażliwe na stężenie wapnia w otoczeniu. Osiąga się to poprzez fuzję GFP i białka kalmoduliny o wysokim powinowactwie do wapnia, tak że wiązanie wapnia przez kalmodulinę doprowadza cząsteczkę GFP do skutecznego potwierdzenia fluorescencyjnego ². Ostatnie postępy w tych fluoroforach generują wyjątkową wielkość sygnału z nawet 500% wzrostem intensywności fluorescencji w fizjologicznym zakresie poziomów wapnia i rozsądnie szybką kinetyką czasu narastania ~95 ms ^{i czasu} zaniku ~650 ms4. W stosunkowo krótkich okresach czasu (minuty) te duże sygnały mogą pozwolić na obrazowanie w niższej rozdzielczości (mniejsze powiększenie) i, biorąc pod uwagę dobrze zachowany początkowy pomiar linii bazowej, negować konieczność ciągłych pomiarów podstawowych lub porównawczych.

Cameleon ma tę zaletę, że jest fluoroforem opartym na FRET, który generuje pomiar ratiometryczny porównujący dwa niezależne kanały lub długości fal ¹. Składa się z dwóch oddzielnych fluoroforów (białek fluorescencyjnych emitujących cyjan i żółcień, CFP i YFP) połączonych białkiem kalmoduliny. Kompleks jest oświetlony niebieskim światłem (440 nm), które wzbudza CFP. Wiązanie wapnia zbliża fluorofory do siebie, zwiększając transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) z CFP (donora) do YFP (akceptora) i powodując zmniejszenie emisji CFP (480 nm) i wzrost emisji YFP (535 nm). Względny poziom wapnia jest mierzony jako stosunek intensywności YFP/CFP. Kinetyka kameleonu jest wolniejsza niż w przypadku GCaMP, mierzona in vivo, aby mieć czas narastania ~1 s i czas zaniku ~3 s ⁵. Jednak stosunek przeciwnie poruszających się sygnałów zwiększa rozmiar sygnału i kompensuje szereg możliwych artefaktów spowodowanych zmianami stężenia fluoroforu, ruchem lub dryfem ostrości i bieleniem.

Genetycznie kodowane reportery fluorescencyjne negują większość wymaganego przygotowania próbki za pomocą egzogenicznie podawanych sond i C. Mały przezroczysty korpus Elegans umożliwia obrazowanie w nienaruszonym zwierzęciu przy użyciu prostej fluorescencji szerokokątnej. Głównym wyzwaniem technicznym związanym z przygotowaniem próbki jest zatem bezpieczne unieruchomienie zwierząt. Istnieje wiele różnych powszechnie stosowanych technik, z których każda ma zalety i wady. Użycie środka farmakologicznego do sparaliżowania zwierząt jest łatwe do wdrożenia i pozwala na zamontowanie wielu zwierząt na jednym preparacie (zwykle stosuje się lewamizol, agonistę cholinergicznego, który powoduje zatarcie tkanki mięśniowej ⁶). C. Elegany można również fizycznie unieruchomić poprzez zamontowanie ich na sztywnej 10% agarozie ^{7, 8}. Minimalizuje to wpływ na fizjologię zwierząt, umożliwia długoterminowe obrazowanie (godziny) i rekonwalescencję wielu zwierząt, ale jest trudniejsze technicznie. Obie te techniki ograniczają fizyczny dostęp do zwierząt (które znajdują się pod szkiełkiem nakrywkowym) i dlatego mogą być stosowane tylko w przypadku niektórych bodźców eksperymentalnych (takich jak światło, temperatura, pole elektryczne lub uszkodzenie lasera). W przypadku bodźców, do których wymagany jest fizyczny dostęp, takich jak dotyk lub podawanie chemikaliów, w wielu badaniach udało się skleić C. elegans (przy użyciu kleju weterynaryjnego) ⁹. Jest to technicznie trudniejsze, jest to przygotowanie dla jednego zwierzęcia i nie pozwala na powrót do zdrowia zwierząt. Wreszcie, zastosowano liczne urządzenia mikroprzepływowe, które fizycznie powstrzymują C. elegans, zachowując fizjologię zwierząt, umożliwiając ekspozycję na większość rodzajów bodźców (w zależności od konstrukcji urządzenia) i może umożliwić szybką wymianę i powrót zwierząt do zdrowia ^{10, 11}. Mikrofluidyka wymaga jednak dodatkowych umiejętności i możliwości technicznych w zakresie projektowania, produkcji i wdrażania. U unieruchomionych zwierząt aktywność i reakcję na bodziec można ogólnie mierzyć w neuronach czuciowych i interneuronach. Aktywność neuronów ruchowych wymaga bardziej wyrafinowanych technik obrazowania u poruszających się zwierząt. W tym miejscu przedstawimy szczegółowe metody wykorzystujące dwie najprostsze techniki farmakologicznego paraliżu i unieruchomienia za pomocą sztywnej agarozy.

Przedstawione tutaj metody mogą być używane do pomiaru aktywności neuronalnej i fizjologii komórki u C. elegans. Podajemy przykład każdego z nich: za pomocą GCaMP do pomiaru odpowiedzi sensorycznej neuronu ASJ na zewnętrzne pole elektryczne oraz za pomocą cameleonu do pomiaru fizjologicznej odpowiedzi wapnia na laserowe uszkodzenie neuronu. Przykłady te pokazują zalety i wady tych dwóch rodzajów fluoroforów i ilustrują, co jest możliwe dzięki systemowi.

Protokół

1. Konfiguracja optyczna

1. Użyj standardowego mikroskopu złożonego z możliwością obrazowania epifluorescencyjnego. Używamy mikroskopu odwróconego Nikon Eclipse Ti-U z oświetlaczem Intensilight HG Illuminator.
2. Aby uzyskać najlepszą jakość obrazu i sygnału, należy użyć obiektywu o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej. Zazwyczaj używamy obiektywu immersyjnego Nikon X60 1.4 N.A. z olejkiem. W niektórych przypadkach możliwe jest użycie mniejszego powiększenia (X40, X20) w zależności od poziomu ekspresji fluoroforu i siły sygnału.
3. Użyj chłodzonej kamerą CCD o wysokiej czułości, takiej jak kamera Andor Clara, aby zmaksymalizować czułość obrazu i zminimalizować szumy tła.
4. W przypadku fluoroforów jednokolorowych należy użyć standardowego zestawu filtrów fluorescencyjnych mikroskopu zaprojektowanego dla określonej długości fali fluoroforu. W przypadku GCaMP należy użyć standardowego zestawu filtrów GFP zoptymalizowanego pod kątem wzbudzenia przy 488 nm i emisji przy 525 nm. Nie są wymagane żadne dalsze modyfikacje optyczne.
5. W przypadku fluoroforów ratiometrycznych, takich jak cameleon, należy użyć podwójnego systemu obrazowania, tak aby identyczne obrazy mogły być jednocześnie rejestrowane na dwóch oddzielnych długościach fal. Osiąga się to poprzez projekcję dwóch obrazów obok siebie w aparacie. Prosta konfiguracja, aby to osiągnąć, wykorzystująca podstawowe komponenty optyczne na płytce prototypowej klasy optycznej, jest zilustrowana na rysunku 1. Składa się z:
   1. Zestaw filtrów mikroskopowych z filtrem wzbudzenia 440 ±20 nm i zwierciadłem dichroicznym 455 nm.
   2. Maska obrazu umieszczona na początkowej płaszczyźnie obrazu bezpośrednio poza portem obrazowania mikroskopu (gdzie zwykle znajduje się czujnik CCD aparatu). Ogranicza to pole widzenia tak, że wypełni ono tylko połowę matrycy aparatu. Umieszczenie tej maski na pierwszej płaszczyźnie obrazu powoduje uzyskanie ostrych obramowań obrazu i brak nakładania się, gdy oba obrazy są rzutowane obok siebie.
   3. Pierwsza soczewka przekaźnikowa ustawiała jedną ogniskową od początkowej płaszczyzny obrazu, tak aby kolimowała światło.
   4. Lustro dichroiczne, które rozdziela światło na dwie oddzielne długości fal lub kanały obrazowania, odbijając jeden kolor (>515 nm, żółty), jednocześnie transmitując drugi (<515 nm, cyjan).
   5. filtry emisyjne (filtry pasmowo-przepustowe) dodatkowo ograniczające przepuszczane światło do określonych długości fal obrazowania (cyjan przy 485 ± 40 nm i żółty przy 535 ± 30 nm),
   6. Drugie soczewki przekaźnikowe (po jednej na każdy kanał) umieszczane są na ścieżkach wiązki w taki sposób, że ponownie skupiają światło na drugiej płaszczyźnie obrazu w kamerze CCD.
   7. Para luster i drugie zwierciadło dichroiczne kierują ścieżki wiązki w taki sposób, że oba obrazy łączą się ponownie i są rzutowane obok siebie na matrycę CCD kamery. Rysunek 4A przedstawia przykładowy obraz wynikowy.
6. Wstępne wyrównanie optyczne: Zainicjuj konfigurację i wyrównanie optyki z obrazem o wysokim kontraście przy użyciu obiektywu o małym powiększeniu i przechodzącego oświetlenia światłem szerokokątnym (dobrze sprawdza się sharpie narysowany na szkiełku mikroskopowym). Ustaw ostrość obrazu przez okulary mikroskopu, a następnie przełącz się na port mikroskopu, który ma być używany. Przy silnym oświetleniu można wyświetlić obraz na karcie katalogowej w początkowej płaszczyźnie ogniskowej (kilka cm poza portem mikroskopu). Umieść pierwszą soczewkę przekaźnikową (C) na ścieżce wiązki tak, aby znajdowała się w jednej odległości ogniskowej od początkowej płaszczyzny ogniskowej i kolimowała światło, nie odchylając ścieżki wiązki (tj. była bezpośrednio wyśrodkowana na ścieżce wiązki). Umieść maskę na pierwszej płaszczyźnie ogniskowej, dostosowanej tak, aby ograniczyć połowę pola widzenia i uzyskać ostrą granicę na obrazie. Ustawić lustra i filtry (D, E, G) tak, aby ścieżka wiązki pozostawała równoległa do powierzchni stołu i przebiegała w dwóch równoległych ścieżkach obok siebie, jak pokazano na rysunku 1B. Wyśrodkuj drugie soczewki przekaźnikowe (F) w odpowiednich ścieżkach wiązki i przesuwaj je do przodu iz powrotem wzdłuż ścieżek, aby ustawić ostrość obrazów na karcie indeksowej umieszczonej w miejscu, w którym będzie znajdował się czujnik CCD kamery. Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, oba obrazy powinny być parafokalne z mikroskopem, okularami i innymi portami kamery. Na koniec ustaw kamerę w odpowiedniej pozycji i dostosuj wyrównanie.
7. Dostrajanie wyrównania optycznego: Użyj podwójnego obrazu viewed przez kamerę CCD, aby dostroić wyrównanie optyczne. Użyj obrazu o wysokim kontraście i zacznij od mniejszego powiększenia, przełączając się na większe powiększenie w celu ostatecznego wyrównania. Ustaw przesyłany obraz (kanał błękitny na rysunku 1B) tak, aby obejmował połowę pola widzenia kamery, przesuwając kamerę w X i Y. Ustaw odbity obraz (żółty kanał na rysunku 1B) tak, aby obejmował drugą połowę pola widzenia, regulując dwa ostatnie lustra (G) na ścieżce wiązki. Zoptymalizuj ostrość, przesuwając drugą soczewkę przekaźnikową dla każdego kanału do przodu iz powrotem wzdłuż ścieżki wiązki. Jeśli nie zostanie zmieniona, konfiguracja optyczna powinna być stabilna i wymagać jedynie rzadkiej precyzyjnej regulacji.

2. Przygotowanie próbki i akwizycja danych.

1. Pozyskaj zwierzęta wykazujące ekspresję wrażliwego na wapń fluoroforu w interesującym neuronie z Caenorhabditis Genetics Center (CGC) lub z innych źródeł. Alternatywnie, zwierzęta transgeniczne mogą być konstruowane przy użyciu standardu C. techniki elegans. Ekspresja pojedynczej komórki nie jest konieczna (a czasami nie jest pożądana, jeśli ma być zbadanych wiele neuronów, patrz ¹²), o ile obrazy i pomiary z wielu komórek można łatwo rozdzielić. Jeśli transgen fluoroforu nie zostanie zintegrowany z genomem, może wystąpić znaczna różnica w ekspresji między zwierzętami. W tym przypadku wstępna selekcja zwierząt o wyższym poziomie ekspresji przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego zwiększa stosunek sygnału do szumu i poprawia pomiary. Poziomy ekspresji fluoroforu muszą być wystarczające, aby można je było łatwo zobrazować za pomocą kamery przy parametrach akwizycji wymaganych w eksperymencie.
2. Przygotować płatki agarozowe wymagane do pożądanej techniki unieruchomienia (patrz ppkt 2.3 poniżej), naciskając małą kroplę stopionej agarozy między dwoma szkiełkami podstawowymi oddalonymi od siebie dwoma kawałkami taśmy laboratoryjnej. W razie potrzeby podkładki z agarozy można przenieść na szklane szkiełko nakrywkowe przed zamontowaniem zwierząt. Zobacz rysunek 2.
3. Unieruchomić C. elegans do obrazowania przy użyciu jednej z następujących technik:
   1. Paraliż farmakologiczny: Dodaj 0,05% lewamizolu do 2% watworek agarozowych (mieszając go ze stopioną agarozą przed przygotowaniem płatków w 2,2). Wybierz 5-10 zwierząt na podkładkę i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Nałóż niewielkie ilości mieszanki gorącego wosku (50% wosku parafinowego i 50% wazeliny) na rogi szkiełka nakrywkowego, aby utrzymać go na miejscu. Odczekaj 5-10 minut, aż lewamizol zacznie działać, a zwierzęta całkowicie się znieruchomą.
   2. Unieruchomienie sztywnej agarozy: C. elegans można fizycznie unieruchomić za pomocą sztywnych 10% wkładek agarozowych i nanocząstek polistyrenu o średnicy 0,05 μm. Przygotować 10% płatki agarozowe (10% wagowo agarozy w buforze NGM) jak w ppkt 2.2. Dodaj ~3 μl roztworu kulek (mikrosfery polistyrenu 1:10 do objętości NGM) na wierzch podkładki. Szybko zbierz 5-10 C. elegans do kałuży roztworu kulek na podkładce i delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Użyj stopionego wosku nałożonego na rogi szkiełka nakrywkowego, aby utrzymać go na miejscu. (Dodatkowe informacje na temat tej techniki znajdują się w ^{punkcie 7}, jak również w poprzednim artykule ⁸ JoVe)
   3. Klejenie: C. elegans można przykleić za pomocą niewielkich ilości kleju weterynaryjnego nałożonego na jedną stronę zwierzęcia.
   4. Urządzenia mikroprzepływowe: Wiele urządzeń mikroprzepływowych zostało zaprojektowanych do fizycznego utrzymywania C. elegans w miejscu do obrazowania.
4. Umieść przygotowane szkiełko pod mikroskopem i skup się na pożądanym neuronie. Często najłatwiej jest znaleźć C. elegans przy użyciu jasnego oświetlenia pola i małego powiększenia. Następnie przełącz się na obrazowanie w dużym powiększeniu i fluorescencji, aby znaleźć i skupić się na konkretnym neuronie.
5. Bodziec: Jeśli pożądana jest reakcja neuronalna na określony bodziec (światło, pole elektryczne, sygnały smakowe i węchowe, temperatura itp.), aparat bodźcowy musi być zaprojektowany w konfiguracji mikroskopu, tak aby mógł być podawany zwierzętom w przygotowaniu próbki podczas obrazowania.
6. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopowej kamery CCD. Czasy ekspozycji i poziom światła wzbudzającego będą zależeć od sygnału podstawowego i poziomu ekspresji fluoroforu, przy czym słabsze sygnały wymagają dłuższych czasów ekspozycji przy odpowiednio mniejszej rozdzielczości czasowej. Zazwyczaj używamy czasów naświetlania ~300 ms.
7. Rób zdjęcia pojedynczo lub jako film poklatkowy. Ponieważ neurony C. elegans na ogół wykazują powolną dynamikę aktywacji (tj. brakuje im potencjałów czynnościowych opartych na sodzie), stosunkowo niska liczba klatek na sekundę wynosząca ~1 sekundę jest często wystarczająca do zmierzenia dynamiki neuronów. Zastosowano szybkości akwizycji do ~90 klatek na sekundę, chociaż mogą one być ograniczone czasem integracji niezbędnym do słabej fluorescencji. Pojedyncze filmy pojedynczego neuronu mogą z łatwością rozciągać się na kilka minut (~5-10 minut) lub dłużej, jeśli przygotowanie do unieruchomienia jest stabilne, a liczba klatek na sekundę stosunkowo niska.

3. Analiza danych

1. Dostępnych jest wiele różnych pakietów oprogramowania do obrazowania fluorescencyjnego z możliwością analizy dynamicznej i ratiometrycznej, w tym ImageJ i NIS-Elements. Używamy prostego, niestandardowego programu MATLAB, który mierzy średni sygnał fluorescencyjny w wybranym obszarze zainteresowania.
2. W przypadku pojedynczych obrazów (lub filmów poklatkowych, które pozostają idealnie nieruchome) wybierz obszar zainteresowania (ROI) w obrazowanym neuronie i oddzielny pobliski obszar do pomiaru tła. W przypadku obrazów ratiometrycznych wybierz podobny obszar zwrotu z inwestycji i obszary tła dla każdego z podwójnych obrazów.
3. Niewielki ruch zobrazowanego neuronu w filmie poklatkowym wymaga dodatkowej analizy, aby automatycznie wybrać ROI w każdej klatce, co można osiągnąć za pomocą wielu schematów śledzenia obiektów. Nasz program wyświetla skompresowany obraz wszystkich obrazów w filmie, z których ręcznie wybierana jest przybliżona granica (obejmująca obiekt zainteresowania we wszystkich klatkach) i wybierany jest niezależny obszar tła. W przypadku pierwszej klatki obszar zwrotu jest wybierany ręcznie z obszaru granicznego. Dla każdej kolejnej klatki program wybiera najjaśniejsze piksele z obszaru granicy, aby wygenerować ROI o odpowiednim rozmiarze (tj. taką samą liczbę pikseli, jak ręczny ROI pierwszej klatki). W przypadku obrazów, na których obiekt zainteresowania jest wystarczająco jasny niż otaczające tło w obszarze granicznym, protokół ten wybiera rozsądny zwrot z inwestycji dla każdej klatki.
4. Sygnał fluorescencyjny F dla każdej klatki jest obliczany jako średnia intensywność pikseli w ROI pomniejszona o średnią intensywność w obszarze tła. Wartości ratiometryczne są obliczane jako stosunek dwóch sygnałów (_tło YFP-YFP)/(_tło CFP-CFP)-0,65. Współczynnik 0,65 kompensuje przenikanie kanału CFP do kanału YFP, co będzie zależało od zastosowanych fluoroforów, a także konkretnego zestawu filtrów (wartość ta wynosi zwykle ~0,6 dla konfiguracji cameleon).
5. Względny poziom wapnia dla każdej ramki oblicza się jako procentową zmianę intensywności znormalizowaną do początkowej wartości podstawowej mierzonej od pierwszej klatki (lub serii ramek): ΔF/F=(F(t)-F_o)/ F_o, gdzie F(t) jest fluorescencją w czasie t, a F_o jest początkową wartością wyjściową.
6. Zwrot z inwestycji: wybór ciała komórki generuje najsilniejsze, najbardziej niezawodne sygnały, ale możliwe jest również wybranie i zmierzenie sygnałów z ROI wzdłuż procesów nerwowych.

4. Rozwiązywanie problemów

1. Wybielanie: Ekspozycja na światło wzbudzające może powodować bielenie fluoroforu i charakteryzuje się stałym spadkiem sygnału, który zależy od poziomu ekspozycji. Pomiary ratiometryczne pomagają to skompensować. Jednak selektywne wybielanie o jednej długości fali może nadal występować (zazwyczaj CFP wybiela się szybciej niż YFP). Jeśli dojdzie do bielenia, zmniejsz poziom ekspozycji na światło, skracając czas ekspozycji i/lub intensywność wzbudzenia (z filtrami o neutralnej gęstości w ścieżce oświetlenia). W razie potrzeby można skompensować bielenie, przeprowadzając próbne próby (z tą samą ekspozycją na wzbudzenie, ale bez bodźca neuronalnego) i określając ilościowo stałą czasową zaniku sygnału.
2. Unieruchomienie: W przypadku opisanej tutaj prostej analizy obrazu bardzo ważne jest, aby zwierzę pozostawało względnie nieruchome przez cały okres rejestracji. C. elegans reaguje na ekspozycję na światło i bodźce eksperymentalne, co sprawia, że najprawdopodobniej poruszają się w momencie nagrywania. Niewielki ruch może spowodować znaczne zakłócenia podczas pomiaru, zwłaszcza w przypadku pomiarów z procesów aksonowych. Analiza ratiometryczna pomaga w pewnym stopniu złagodzić te skutki, a pomiary z korpusu komórki są bardziej wiarygodne. Staranne wykonanie i dopracowanie procedur unieruchomienia spowoduje, że zwierzęta będą całkowicie nieruchome.
3. Wybór tła: Staranny wybór obszaru tła jest niezbędny do pomyślnej analizy obrazu. Obszary tła powinny być w miarę jednolite i ciemniejsze niż obrazowany neuron. Musi być wystarczająco usunięty, aby uniknąć rozproszonego światła (a tym samym odebrać sygnał) z obrazowanego neuronu. Znajdujemy jednolity obszar 20-50 μm od ROI, który działa dobrze w większości przypadków.
4. Optyka ratiometryczna: Prawidłowe ustawienie optyki obrazowania ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wyraźnego podwójnego obrazu. Dostępne są komercyjne przystawki mikroskopowe do obrazowania ratiometrycznego. Alternatywną techniką jest zastosowanie szybkiego obrazowania sekwencyjnego przy użyciu szybkiego koła filtrów, aby szybko przełączać się między długościami fal emisji podczas rejestrowania oddzielnych obrazów dla każdej z nich.
5. Analiza ratiometryczna: Opisana tutaj analiza jest stosunkowo prostą techniką, która generuje solidne sygnały dzięki uśrednieniu zwrotu z inwestycji. Wymaga rozpoznawalnie jasnego obiektu, aby wybrać ROI. Bardziej wyrafinowana analiza ratiometryczna jest możliwa dzięki precyzyjnemu wyrównaniu i odwzorowaniu podwójnych obrazów, tak aby współczynnik fluorescencji można było obliczyć piksel po pikselu.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiamy wyniki dwóch oddzielnych eksperymentów. Pierwszy z nich wykorzystuje GCaMP do pomiaru odpowiedzi konkretnego neuronu sensorycznego na określony bodziec zewnętrzny, stanowiąc dobry przykład wykorzystania fluorescencyjnych reporterów wapnia do optycznego monitorowania aktywności neuronalnej w nienaruszonych C. elegans. Drugi eksperyment wykorzystuje kameleon do pomiaru wewnątrzkomórkowego stanu przejściowego wapnia wywołanego w neuronie w odpowiedzi na specyficzne uszkodzenie laser...

Dyskusja

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia są szeroko stosowane w neurobiologii C. elegans. Wiele grup wykorzystało te techniki do zbadania reakcji pierwotnych neuronów czuciowych na bodźce zewnętrzne, jak pokazano tutaj w przypadku odpowiedzi ASJ na pole elektryczne. Wybitnymi przykładami są odczuwanie mechanicznego dotyku, określone substancje chemiczne, temperatura i pole elektryczne ^{12, 16-19}. Monitorowano również aktywność komórek interneuronalnych i mięśniowych zarówno w odpowiedzi na bodźce, jak i w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop odwrócony Eclipse Ti-U	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescencyjne źródło światła
CFI Plan Apo VC 60X Olej	Nikon
lub płytka stykowa optyczna 3'X3' klasy 3'X3'	Thor Labs		Jeśli stół optyczny nie jest używany, płytka prototypowa klasy optycznej na solidnym stole laboratoryjnym a powinna wystarczyć .
Kamera Clara Interline Technologia		Andor	Kamera CCD o wysokiej czułości
z technologią GFP Longpass Emission	Chroma Corp.	41015	Zestaw filtrów GFP do obrazowania Filtr GCaMP
440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	do cameleon
Lustro dichroiczne > 455 nm długoprzepustowe	Chroma	455DCLP BS	Dichroiczny do obrazowania Cameleon
Lustro dichroiczne > 515 nm długoprzepustowe	Chroma	515DCLP BS	zwierciadło dichroiczne do cameleon Filtr obrazowania
535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m Filtr emisji EM	YFP
Filtr 480 +/- 20 nm	Filtr emisyjny Chroma	D485/40m EM	CFP
Obiektyw, 200 mm, achromatyczny	Thor Labs	AC508-200-A1	Soczewka przekaźnikowa do optyki FRET (3)
Srebrne lustro szerokopasmowe	Thor Labs	ME2S-P01	optyka FRET (2)
Bufor
Lewamizol	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, objętość 2,5% by , nanocząstki polistyrenu o średnicy 50 nm	dla C. elegans immobilizacja
Szczep transgeniczny, Szczep gpa-9::GCaMP3(w fazie-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgeniczny szczep, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Szczep CG1B

Stół optyczny Filtr wzbudzenia NGM