Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

Podsumowanie

Fotozakrzepica to szybka, minimalnie inwazyjna technika wywoływania małego i dobrze zdefiniowanego zawału w obszarach zainteresowania w wysoce powtarzalny sposób. Jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Streszczenie

Model udaru fotozakrzepowego ma na celu wywołanie uszkodzenia niedokrwiennego w danym obszarze kory mózgowej za pomocą fotoaktywacji wcześniej wstrzykniętego barwnika światłoczułego. Po oświetleniu barwnik jest aktywowany i wytwarza tlen singletowy, który uszkadza składniki błon komórkowych śródbłonka, a następnie agregację płytek krwi i tworzenie skrzeplin, co ostatecznie decyduje o przerwaniu lokalnego przepływu krwi. Podejście to, początkowo zaproponowane przez Rosenbluma i El-Sabbana w 1977 roku, zostało później ulepszone przez Watsona w 1985 roku w mózgu szczura i stworzyło podstawy obecnego modelu. Również zwiększona dostępność transgenicznych linii myszy dodatkowo przyczyniła się do wzrostu zainteresowania modelem fotozakrzepicy. Krótko mówiąc, barwnik światłoczuły (Rose Bengal) jest wstrzykiwany dootrzewnowo i dostaje się do krwiobiegu. Po oświetleniu zimnym źródłem światła barwnik aktywuje się i indukuje uszkodzenie śródbłonka z aktywacją płytek krwi i zakrzepicą, co powoduje miejscowe przerwanie przepływu krwi. Źródło światła można zastosować na nienaruszonej czaszce bez konieczności kraniotomii, co pozwala na celowanie w dowolny obszar kory mózgowej w powtarzalny i nieinwazyjny sposób. Mysz jest następnie zszywana i pozwala jej się obudzić. Ocenę uszkodzeń niedokrwiennych można szybko przeprowadzić za pomocą barwienia chlorkiem trifenylotetrazolu lub fioletem krezylowym. Technika ta powoduje zawał o niewielkich rozmiarach i dobrze odgraniczonych granicach, co jest bardzo korzystne dla precyzyjnej charakterystyki komórek lub badań funkcjonalnych. Ponadto jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Wprowadzenie

Na początku XXI wieku, udar niedokrwienny jest wyniszczającym zaburzeniem, które stanowi drugą przyczynę długotrwałej niepełnosprawności¹ i drugą przyczynę śmiertelności na całym świecie, w której udar stanowił około 5,7 miliona zgonów w 2004 roku². Pomimo wielu wysiłków, które zostały włożone, nadal nie ma skutecznego leczenia, które poprawiłoby powrót do sprawności po udarze. Zwierzęce modele udaru mózgu są szeroko stosowane w badaniach nad udarem, ponieważ umożliwiają modelowanie patofizjologii uszkodzeń niedokrwiennych i testują skuteczność różnych strategii neuroprotekcyjnych in vivo. Większość z tych modeli ma na celu wywołanie rozległych zawałów poprzez przerwanie (tymczasowo lub na stałe) przepływu krwi w tętnicy środkowej mózgu, podczas gdy inne modele zostały opracowane do badania zmian o niewielkich rozmiarach w określonych obszarach, zwykle w korze ruchowej i somatosensorycznej. Jednak kilka czynników może przyczynić się do wygenerowania pewnego stopnia zmienności w eksperymentalnych badaniach nad udarem, w tym zastosowany szczep myszy, wiek i płeć zwierząt objętych badaniem, a przede wszystkim technika zastosowana do wywołania uszkodzenia niedokrwiennego. W odniesieniu do tego ostatniego punktu, czas trwania i inwazyjność operacji (tj. konieczność wykonania kraniotomii), a także umiejętności chirurgiczne wymagane od operatora do wiarygodnego wywołania zmiany niedokrwiennej są krytycznymi determinantami udanego i bezstronnego badania udaru mózgu in vivo.

Koncepcja fotozakrzepicy została początkowo zaproponowana przez Rosenbluma i El-Sabbana w 1977 roku³ i stała się sławna dzięki zastosowaniu w mózgu szczura przez Watsona i in. w 1985 roku⁴, w której technika ta została znacznie ulepszona i stworzyła podstawy obecnego modelu^3-6. Podejście fotozakrzepowe ma na celu wywołanie zawału kory mózgowej poprzez fotoaktywację światłoczułego barwnika wcześniej dostarczonego do układu krwionośnego, co powoduje miejscową zakrzepicę naczyń w miejscach narażonych na działanie światła. Kiedy krążący barwnik jest oświetlany odpowiednią długością fali przez zimne źródło światła, uwalnia energię do cząsteczek tlenu, które z kolei generują dużą ilość wysoce reaktywnych produktów tlenu singletowego. Te produkty pośrednie tlenu indukują peroksydację błony komórkowej śródbłonka, prowadząc do adhezji i agregacji płytek krwi, a ostatecznie do powstania skrzeplin, które determinują lokalne przerwanie przepływu mózgowego⁷.

Fotozakrzepica to niekanoniczny model niedokrwienny, który nie zamyka ani nie przerywa tylko jednej tętnicy, jak to zwykle ma miejsce w ludzkim udarze, ale wywołuje zmiany w bardziej powierzchownych naczyniach, co powoduje selektywne przerwanie przepływu krwi w miejscach narażonych na światło. Z tego powodu podejście to może być odpowiednie do komórkowych i molekularnych badań plastyczności kory mózgowej. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota wykonania. Co więcej, fotozakrzepicę można łatwo przeprowadzić w ciągu około czterdziestu minut na zwierzę, w tym dwudziestominutowego oczekiwania (3 minuty na znieczulenie; 1 minuta na golenie skóry głowy; 3 do 5 minut na umieszczenie zwierzęcia na aparacie stereotaktycznym; 2 minuty na wyszorowanie skóry głowy roztworem antyseptycznym, wykonanie nacięcia i oczyszczenie czaszki; 2 do 4 minut na umieszczenie zimnego włókna świetlnego; 1 minuta na wstrzyknięcie roztworu róży bengalskiej; 5 minut oczekiwania na dootrzewnową dyfuzja; 15 min oświetlenia; i 5 minut na oczyszczenie rany i zszycie zwierzęcia). Co więcej, do wykonania tej techniki nie jest potrzebna żadna wiedza chirurgiczna, ponieważ zmiana jest wywoływana przez proste oświetlenie nienaruszonej czaszki. W przeciwieństwie do klasycznej niedrożności tętnic, metoda ta określa selektywną okluzję mikronaczyń pialnych i śródmiąższowych w strefie napromienianej i zmniejsza zmienność między zmianami, ponieważ nie pozostaje żadne naczynie boczne, które dostarczałoby tlen w obszarze docelowym.

Pomimo swojej szczególnej natury, uszkodzenie fotozakrzepowe dzieli podstawowe mechanizmy występujące w udarze mózgu. Podobnie jak w przypadku niedrożności tętnic w udarze mózgu, agregacja płytek krwi i tworzenie się skrzepów determinują przerwanie przepływu krwi w napromienianym obszarze⁷. Podobnie, model ten ma również podstawowe reakcje zapalne, jak w przypadku niedrożności tętnicy środkowej mózgu⁸. Jednak ze względu na dobrze wyznaczone granice, strefa półcieniowa, która odpowiada obszarowi częściowo zachowanego metabolizmu, jest bardzo zmniejszona lub nie istnieje po zmianie fotozakrzepowej. Ta wyraźna granica może ułatwić badanie odpowiedzi komórkowych w niedokrwiennym lub nienaruszonym obszarze kory mózgowej. Mysi model fotozakrzepicy jest szczególnie odpowiedni do badań nad udarem mózgu u różnych zwierząt transgenicznych. Rzeczywiście, klasyczne modele nie mogą pasować do wszystkich szczepów, a długoterminowe badania na szczepie myszy C57BL/6 wykazały wysoki współczynnik śmiertelności, który może powodować błąd⁹.

Protokół

1. Przed operacją

1. Zważ różę bengalską w probówce o pojemności 1,5 ml i rozpuść w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aż do osiągnięcia końcowego stężenia 15 mg/ml. Filtruj sterylizuj przez filtr 0,2 μm i przechowuj w ciemności w temperaturze pokojowej do dwóch miesięcy.
2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przez autoklawowanie. Obszar operacyjny powinien zostać zdezynfekowany na mniej niż godzinę przed rozpoczęciem operacji.
3. Zapisać masę ciała myszy, aby dostosować dawkę Rose Bengal do wstrzyknięcia. Wstrzyknęliśmy 10 μl / g masy zwierzęcia samicom myszy CD1 w wieku 12 tygodni w niniejszym protokole. Ilość róży bengalskiej potrzebna do wytworzenia pożądanej wielkości zmiany korowej może być łatwo określona w oddzielnym zestawie wstępnych eksperymentów, testując różne dawki (zwykle 2 μl/g, 5 μl/g lub 10 μl/g masy ciała). Należy pamiętać, że ilość Rose Bengal do wstrzyknięcia jest wysoce zależna od warunków eksperymentu, w szczególności od rodzaju użytego źródła światła i czasu ekspozycji na światło. W niniejszym badaniu stwierdzono, że dawka 10 μl/g (150 μg/g) jest niezbędna do wywołania fotozakrzepicy po ekspozycji na światło przez 15 minut, podczas gdy inne grupy zgłosiły, że wstrzyknięcie dootrzewnowe 50 μg/g ^6,8 i 100 μg/g¹⁰ było wystarczające do wywołania zmiany fotozakrzepowej.

2. Procedura anestezjologiczna

1. Znieczulenie myszy izofluranem w przezroczystej komorze indukcyjnej (3,5-4% do indukcji, 1,5-2% do utrzymania) w mieszaninie 50% (v/v) tlenu/50% (v/v) tlenku diazotu. Znieczulenie gazowe pozwala na szybkie obudzenie zwierząt, a poziom gazu znieczulającego można łatwo regulować. Alternatywnie, myszy można również znieczulić mieszaniną ketaminy i ksylazyny.
2. Po osiągnięciu głębokiego znieczulenia należy wyjąć znieczulone zwierzę z komory indukcyjnej, umieścić je w ramce stereotaktycznej i utrzymać znieczulenie za pomocą maski na twarz. Dostosuj dawkę izofulranu, aby uzyskać odpowiedni poziom znieczulenia. Monitoruj częstość oddechów przez cały czas trwania zabiegu i upewnij się, że jest stała (40-60 oddechów na minutę).
3. Użyj szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone.
4. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
5. Delikatnie włóż sondę doodbytniczą, aby monitorować temperaturę podczas zabiegów chirurgicznych. Ustaw odpowiednią poduszkę grzewczą sterowaną sprzężeniem zwrotnym, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 ± 0.5 °C.

3. Chirurgia oświetlenia obszaru docelowego

1. Ogol skórę głowy myszy elektryczną maszynką do golenia.
2. Mocno zabezpiecz głowę i włóż nauszniki do zewnętrznego przewodu pokarmowego. Uważaj, aby nie uszkodzić błony bębenkowej.
3. Zdezynfekuj skórę na powierzchni za pomocą naprzemiennych machnięć 70% etanolu i betadyny za pomocą bawełnianych wacików.
4. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej od poziomu oczu do szyi. Zastosuj zwijacze skóry, aby czaszka była odsłonięta.
5. Delikatnie cofnij okostną do krawędzi czaszki za pomocą skalpela i pozostaw powierzchnię czaszki do wyschnięcia za pomocą sterylnych wacików. Zidentyfikuj bregmę i lambdę. Umieść szklaną mikropipetę na bregmie jako punkt odniesienia, a następnie przesuń ją do współrzędnych interesującego Cię regionu. Obszar zainteresowania wybrany do tego artykułu ma z grubsza okrągły kształt, wyśrodkowany około 2 mm bocznie w stosunku do bregmy i obejmuje obszar około 30 mm^2, który obejmuje dużą część kory sensomotorycznej zgodnie z atlasem mózgu myszy autorstwa Franklina i Paxinosa¹¹.
6. Zaznacz interesujące Cię miejsce punktami odniesienia i umieść światłowód w bliskim kontakcie z powierzchnią czaszki, aby uniknąć rozpraszania światła, ale zwróć uwagę, aby nie wywierać na nie nacisku. Oświetlany obszar można ograniczyć, nakładając na czaszkę maskę o małym otworze lub nasadkę na końcu światłowodu.

4. Wstrzyknięcie i aktywacja róży bengalskiej

1. Umieścić roztwór róży bengalskiej w strzykawce o pojemności 1 ml i obliczyć ilość do wstrzyknięcia w zależności od dawki 10 μl/g masy ciała.
2. Kontynuuj powolne wstrzyknięcie dootrzewnowe.
3. Pozwól barwnikowi dyfundować i dostać się do krwiobiegu. Po 5 minutach włącz oświetlacz zimnego światła. Unikaj oświetlania zwierzęcia przez jakiekolwiek inne źródło światła. Zastosowaliśmy oświetlacz światłowodowy o natężeniu 150 W.
4. Po 15 minutach oświetlenia przerwij ekspozycję na światło i zszyj ranę. Pięć minut oświetlenia powoduje już zawał, a 10 minut prawdopodobnie wystarczy do uzyskania maksymalnego efektu¹². W celu zminimalizowania zmienności decydujemy się na oświetlenie przez 15 minut.

5. Szew

1. Usuń retraktory skóry i nałóż sterylny roztwór soli fizjologicznej, aby uniknąć odwodnienia.
2. Zamknij ranę za pomocą igły do odwrotnego cięcia i nici do szwów jedwabnych lub nylonowych.
3. Przerwij podawanie znieczulenia, ostrożnie wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego i umieść ją na wstępnie podgrzanej poduszce grzewczej, aż całkowicie się obudzi, a następnie włóż ją z powrotem do klatki. Temperatura ciała powinna być dokładnie monitorowana przez cały czas trwania zabiegów, aby ograniczyć zmienność rozszerzenia zawału. W zależności od stężenia i drogi podania, Rose Bengal można nadal wykryć w krwiobiegu przez kilka godzin po wstrzyknięciu¹³. Preferuj koc grzewczy od lampy grzewczej, aby uniknąć potencjalnych wtórnych uszkodzeń (długość fali absorpcji Rose Bengal mieści się w zielonym spektrum).

Wyniki

Niniejszy protokół pozwala na wywołanie uszkodzenia kory mózgowej, które jest widoczne gołym okiem już podczas sekcji kory (Ryciny 1A-1C). Uszkodzenie fototrombotyczne rozwija się w powierzchownych i głębokich warstwach kory, w których tkanka jest wystarczająco przezroczysta, aby umożliwić fotoaktywację błękitu różowego (Rose Bengal). Pomiar zakresu zawału mózgu można przeprowadzić szybko za pomocą barwienia histologicznego chlorkiem trifenylo-tetrazolium (TTC) na świeżej tkance lub fioletem krezylowym p...

Dyskusja

Modyfikacje i zastępstwa

Ze względu na szczyt absorpcji przy długości fali 562 nm, do naświetlania światłoczułej róży bengalskiej wybrano pierwotnie laser światła zielonego z przefiltrowanej lampy ksenonowej. Chociaż wzbudzenie za pośrednictwem lasera było nadal stosowane niedawno5, można je zastąpić lampą o zimnym świetle, która również zapewnia wzbudzenie barwnika^10,15. Światłowody ze światłem zimnym są łatwiejsze w obsłudze i tańsze niż źródła laserowe. Należy jednak zauważyć, że la...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwory i chemikalia
Rose Bengal	Sigma, Włochy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Materiały i sprzęt chirurgiczny
Fluosorber Filter	Aparat Havarda	340415
Oświetlacz światłowodowy 150W	Photonic	PL3000
do płyty TCAT-2DF	Aparatura Havarda	727561
Przyrząd stereotaktyczny	Stoelting	51950
Mikroskop operacyjny	Takagi	OM8
Poduszka
Tlen i azot gazowy
Narzędzia chirurgiczne Światowy	instrument		Krany światłowodowe i maska są wykonywane na zamówienie

Regulator temperatury grzewcza precyzyjny