Method Article

Analiza transkryptomiczna próbek chirurgicznych ludzkiej siatkówki przy użyciu jouRNAl

DOI:

10.3791/50375

⸱

August 14th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1U968, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2UMR S 968, Université Pierre et Marie Curie, 3UMR 7210, Centre National de la Recherche Scientifique, 4Départment d'Ophtalmologie, Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy próbek siatkówki z retinektomii do transkryptomicznej analizy odwarstwienia siatkówki. Opracowaliśmy procedurę, która pozwala na zachowanie RNA między blokami operacyjnymi a laboratorium. Ustandaryzowaliśmy protokół oczyszczania RNA za pomocą ultrawirowania chlorku cezu, aby upewnić się, że oczyszczone RNA nadają się do analizy mikromacierzy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem terapeutycznym w odwarstwieniu siatkówki (RD) jest znalezienie sposobu na ograniczenie uszkodzeń komórek fotoreceptorów i zapalenia siatkówki wynikającego z oddzielenia fotoreceptorów od komórek nabłonka barwnikowego siatkówki. Podczas RD komórki RPE są aktywowane, migrują, odróżnicowują się i namnażają na powierzchni odłączonej siatkówki, wywierając siły skurczowe prowadzące do powikłań. Analiza transkryptomiczna RD jest sposobem identyfikacji docelowych genów ze zmodyfikowaną ekspresją po RD, a tym samym przyszłych cząsteczek terapeutycznych, które mogą poprawić ostateczny wynik wizualny w połączeniu z operacją. Powszechnie wiadomo, że kwas rybonuklein....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. jouRNAl: Procedura odzyskiwania próbek z bloku chirurgicznego

W laboratorium

  1. Uzyskaj umowę importową od firmy spedycyjnej zajmującej się ekspresową wysyłką.
  2. Wypełnij 10 (lub 25) formularzy wysyłkowych adresem pocztowym laboratorium, wskazując osobę kontaktową w laboratorium (numer telefonu i adres e-mail).
  3. Przygotować 10 (lub 25) formularzy próbek ponumerowanych od 1 do 10 (lub 25). Formularze te zawierają dedykowane miejsca, w których można poinformować o: a) anonimowej identyfikacji pacjenta, b) dacie zabiegu oraz c) wszelkich dodatkowych uwagach, które chirurg chciałby dodać. Przygotuj 10 (lub 25) wyścieła....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura jouRNAl (Rysunek 1) pozwala nam odzyskać próbki siatkówki z bloku chirurgicznego do oczyszczonego RNA i przeanalizować transkryptom odwarstwienia siatkówki. Odwarstwienie siatkówki powoduje regulację w górę chemotaktycznego genu MCP1 CCL2 monocytów oraz zmniejszenie ekspresji genu transdukującego fotoreceptory pręcików GNAT1, krótkofalowej opsyny stożka OPN1sw i homeogenu CRX (Figura 2). Indukcja CCL2 wynika ze stanu zapalnego 9.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie procedury odzyskiwania tkanek z bloku chirurgicznego miało zasadnicze znaczenie dla analizy transkryptomu odwarstwienia siatkówki. Należy zauważyć, że ten rodzaj chirurgii jest praktykowany w nagłych wypadkach i że operujący okuliści mają mało czasu na udział w biologicznym programie badawczym podczas operacji. Ta retinektomia jest również wykonywana stochastycznie w każdej usłudze, dzięki czemu łatwiejszym sposobem na osiągnięcie liczb statystycznych jest praca z siecią. W takiej sieci standaryzacja pobieran.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Sacha Reichman i Dominique Santiard-Baron za pomoc w edycji protokołu oczyszczania RNA.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
WirówkaBeckman CorederAventi J-E
RotorBeckman CoulterJS-5.3
UltrawirówkaBeckman CoulterLE 80K
RotorBeckman CoulterSW41
ZasilaczBioradPac 3000
PolytronTMKinematicaPT 2100W zestawie z PT-DA 2105:2
Urządzenie do elektroforezy w żelu agarozowymBioradMiniGel Cell GT
Biorad GelDoc-It Imager
5 ml sterylna probówka polietylenowaGreiner115261
Sterylna probówka wirówkowa z poliallomeru Beckman Coulter331372
Odczynniki chemiczneSigmaKlasa biologii molekularnej (produkty wolne od RNaz i DNaz)
Roztwór czyszczący RBS firmy VWR
AffymetrixHuman U133 plus 2
System obrazowania Mikromacierz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678(2010).
  2. Green, R. E., Krause, J., et al. A d....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal DetachmentRNA PurificationCesium Chloride UltracentrifugationTranscriptomic AnalysisJouRNAl ProcedureHuman Retinal SpecimensInflammation MarkersPhotoreceptor DegenerationGene Expression AnalysisGel Electrophoresis

Related Articles