Analiza transkryptomiczna próbek chirurgicznych ludzkiej siatkówki przy użyciu jouRNAl

Summary

Użyliśmy próbek siatkówki z retinektomii do transkryptomicznej analizy odwarstwienia siatkówki. Opracowaliśmy procedurę, która pozwala na zachowanie RNA między blokami operacyjnymi a laboratorium. Ustandaryzowaliśmy protokół oczyszczania RNA za pomocą ultrawirowania chlorku cezu, aby upewnić się, że oczyszczone RNA nadają się do analizy mikromacierzy.

Abstract

Introduction

Głównym celem terapeutycznym w odwarstwieniu siatkówki (RD) jest znalezienie sposobu na ograniczenie uszkodzeń komórek fotoreceptorów i zapalenia siatkówki wynikającego z oddzielenia fotoreceptorów od komórek nabłonka barwnikowego siatkówki. Podczas RD komórki RPE są aktywowane, migrują, odróżnicowują się i namnażają na powierzchni odłączonej siatkówki, wywierając siły skurczowe prowadzące do powikłań. Analiza transkryptomiczna RD jest sposobem identyfikacji docelowych genów ze zmodyfikowaną ekspresją po RD, a tym samym przyszłych cząsteczek terapeutycznych, które mogą poprawić ostateczny wynik wizualny w połączeniu z operacją. Powszechnie wiadomo, że kwas rybonukleinowy (RNA) nie jest stabilny, podobnie jak kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), który jest szeroko stosowany do badań genetycznych, jego stabilność pozwoliła na sekwencjonowanie genomu neandertalczyka z próbek paleontologicznych ^sprzed ponad 30 000 lat. Transkrypcja DNA genów z genomu na informacyjny RNA jest głównym procesem ekspresji genów, a mRNA jest labilne, aby stanowić sygnał. RNA są bardzo szybko degradowane przez enzymy RNAzy, które przerywają sygnał. Kiedy tkanki są izolowane z organizmu, RNA bardzo często ulegają degradacji, zanim ekspresja zostanie zbadana w laboratorium badawczym. Zdegradowane RNA nie nadaje się do analizy ekspresji genów. Ponieważ personel laboratoryjny nie może uczestniczyć w operacji, opracowaliśmy procedurę, która jest łatwa i wymaga jedynie od chirurga odzyskania tkanek do odpowiedniego roztworu wolnego od RNAzy. RNA tkanek jest stabilne i może być analizowane bez żadnych oznak degradacji po 72 godzinach w temperaturze pokojowej w tym roztworze. RNA z próbek są oczyszczane znormalizowaną metodą obejmującą ultrawirowanie na gradiencie chlorku cezu po przeniesieniu do laboratorium ³. Następnie jakość RNA ocenia się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i RT-PCR. Protokół oczyszczania RNA ma tę zaletę, że oddziela cząsteczki zgodnie z ich gęstością, która jest różna dla DNA i RNA, i zapewnia, że RNA nie jest zanieczyszczone cząsteczkami DNA, które będą generować fałszywe sygnały w badaniach ekspresji genów. Ponadto transferowe RNA (tRNA), które są ilościowo najliczniejszym RNA w komórce, są oddzielane zgodnie z tą samą właściwością fizyczną od rybosomalnego RNA (rRNA) i informacyjnego RNA (mRNA), przy czym te dwa ostatnie są produktem końcowym procesu oczyszczania. Usunięcie tRNA z preparatu jest użyteczne, ponieważ większość protokołów analitycznych mikromacierzy obejmowała użycie odwrotnej transkryptazy i polimeraz RNA, które są hamowane przez tRNA ^4-6. Oczyszczone RNA z próbek chirurgicznych są znakowane przy użyciu standardowego protokołu i hybrydyzowane z chipem mikromacierzy, a wyniki są analizowane przy użyciu dwóch uzupełniających się metod, metody wskaźnika fałszywych odkryć oraz przy użyciu nowatorskiej metody opartej na wzajemnych informacjach i wizualizowanej na serwerze internetowym Retinobase ^7,8.

Protocol

1. jouRNAl: Procedura odzyskiwania próbek z bloku chirurgicznego

W laboratorium

1. Uzyskaj umowę importową od firmy spedycyjnej zajmującej się ekspresową wysyłką.
2. Wypełnij 10 (lub 25) formularzy wysyłkowych adresem pocztowym laboratorium, wskazując osobę kontaktową w laboratorium (numer telefonu i adres e-mail).
3. Przygotować 10 (lub 25) formularzy próbek ponumerowanych od 1 do 10 (lub 25). Formularze te zawierają dedykowane miejsca, w których można poinformować o: a) anonimowej identyfikacji pacjenta, b) dacie zabiegu oraz c) wszelkich dodatkowych uwagach, które chirurg chciałby dodać. Przygotuj 10 (lub 25) wyściełanych kopert (150 x 210 mm).
4. Przygotowane przy użyciu odczynników wolnych od RNAzy: 25 (lub 65) ml 6 M chlorku guanidyny w_H2O(GHCl) poddanym działaniu ditylopirowęglanu (DEPC).
5. Napełnij 10 lub 25 ponumerowanych 5 ml sterylnych probówek z polietylenu o okrągłym dnie 2,4 ml roztworu GHCl.
6. Użyto argonu gazowego do wypełnienia górnej części tych rurek, a następnie mocno dociśnij nakrętkę, aby zapobiec utlenianiu roztworu GHCl przez kilka lat przechowywania w gabinecie chirurgicznym.
7. Wprowadzać probówki o pojemności 5 ml do sterylnej probówki ze stożkowym dnem z polipropylenu o pojemności 50 ml z zakrętką. Użyj kawałka czystej chusteczki papierowej, aby przytrzymać probówkę o pojemności 5 ml do probówki o pojemności 50 ml, zamknij probówkę.
8. Umieść probówki o pojemności 50 ml na styropianowym stojaku, a stojak w kartonowym pudełku z wyściełanymi kopertami, formularzami wysyłkowymi i formularzami próbek.
9. Wklej instrukcje (patrz : 1.12-1.19) wewnątrz pokrywy pudełka kartonowego, aby ułatwić ich odczytanie.
10. Wyślij karton pocztą do osoby kontaktowej w szpitalu.

W szpitalu

11. Przynieś karton z szafki operacyjnej na salę operacyjną. Uwaga: jeśli zabieg obejmuje pacjenta z obniżoną odpornością, karton nie powinien być wnoszony na salę operacyjną.
12. Podczas zabiegu należy umieścić wycinek siatkówki w numerowanym 5 ml sterylnego polipropylenu wypełnionego roztworem GHCl. Zamknij szczelnie rurkę.
13. Zwróć rurkę na krótko.
14. Umieść probówkę na zaworze probówki z krwią na 10 minut.
15. Wypełnij załączony przykładowy formularz z numeracją.
16. Podać numer identyfikacyjny na odpowiedniej ponumerowanej probówce o pojemności 50 ml.
17. Wprowadzić probówkę o pojemności 5 ml z wycikiem chirurgicznym do probówki o pojemności 50 ml, wymienić papierową chusteczkę i przykręcić rurkę.
18. Wprowadź do niej probówkę i wypełnioną próbkę w jednej z dołączonych wyściełanych kopert. Zamknij to.
19. Zadzwoń do ekspresowej firmy spedycyjnej w celu odbioru.

2. Oczyszczanie RNA

W laboratorium

1. Homogenizować próbkę w 5 ml probówce z polipropylenu z roztworem GHCl z homogenizatorem przez 1 minutę, przesuwając probówkę w górę iw dół.
2. Dodać 270 μl 2 M octanu potasu o pH 5,0. Wstrząsać energicznie przez 10 minut, umieszczając probówkę na wytrząsarce w pozycji poziomej (420 ^min-1).
3. Wirować 10 minut przy 5.000 obr./min (6.500 x g) w temperaturze 20 °C.
4. Płynnie zasysać frakcję rozpuszczalną, nie naruszając osadu.
5. Przenieść do sterylnej probówki o pojemności 14 ml.
6. Dodać 5,3 ml 100 mM Tris pH 8,0, N-lauroilosarkozyny 1%.
7. Dodać 3,2 g chlorku cezu (CsCl) i wymieszać probówkę przez wirowanie.
8. Dodać 1,8 ml CsCl / kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do sterylnej probówki wirówkowej z polialomera o pojemności 11 ml.
9. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura o pojemności 10 ml przenieś roztwór RNA na 1,8 ml CsCl/EDTA, przesuwając powoli po krawędzi probówki, aby uniknąć naruszenia poduszki gęstości.
10. Umieścić probówki (drugą probówkę zawierającą bez siatkówki, jeśli to konieczne) w wirniku.
11. Wirować 24 godziny przy 32 000 obr./min (225 000 x g) w temperaturze 20 °C.
12. Usunąć górną część roztworu za pomocą sterylnej pipety Pasteura i wyrzucić ją.
13. Usuwaj stopniowo, sprawdzając moment, w którym DNA (lepkie) jest odsysane drugą sterylną pipetą Pasteura i wyrzuć je.
14. Usunąć pozostały roztwór, uważając, aby nie uwolnić osadu RNA za pomocą trzeciej sterylnej pipety Pasteura.
15. Pokrój spód probówki skalpelem wysterylizowanym płomieniem, a następnie połóż pozostałą część probówki do góry nogami na sterylnym spojrzeniu.
16. Odwróć probówkę i delikatnie spłucz 160 μl GHCl.
17. Pozostaw granulat do wyschnięcia na 10 minut.
18. Zawiesić osad w 150 μl (10 mM Tris pH 7,5 - 1 mM EDTA - 0,1% SDS).
19. Przenieść roztwór do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml, a następnie zebrać pozostały osad za pomocą 30 μl (10 mM Tris pH 7,5 - 1 mM EDTA - 0,1% SDS).
20. Dodać 150 μl (10 mM Tris pH 7,5 - 1 mM EDTA).
21. Dodać 30 μl 3 M octanu sodu o pH 5,0, przemieszać probówkę.
22. Dodać 900 μl etanolu 100% (-20 °C), przemieszać rurkę.
23. Umieść probówkę na 30 minut w topniejącym lodzie.
24. Odwirować probówkę przez 30 minut przy 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C.
25. Delikatnie odessać frakcję rozpuszczalną i wyrzucić ją.
26. Dodaj 500 μl 70% etanolu (RT), wymieszaj rurkę.
27. Odwirować probówkę przez 20 minut przy 15 000 obr./min (18 000 x g) w temperaturze 4 °C.
28. Powtórz etap płukania (70% etanolu).
29. Krótko odwirować i usunąć pozostały etanol za pomocą pipety P200.
30. Pozostaw granulat do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
31. Zawiesić osad w 50 μl H₂O poddanego działaniu DEPC.
32. Mieszaj energicznie, wirując.
33. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 45 °C w łaźni wodnej.

3. Analiza RNA metodą elektroforezy żelowej

1. Wlej żel agarozowy do okapu chemicznego.
2. W sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodać 2 μl RNA do analizy i 6,4 μl buforu do przygotowania próbki.
3. Do drugiej probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 3 μl wzorców RNA i 9,6 μl buforu do przygotowywania próbek.
4. Podgrzej rurki przez 15 minut w temperaturze 65 °C, połóż je na lodzie.
5. Dodać 1 μl buforu ładującego bromek etydyny (EB) bez barwnika do probówki z próbką RNA i 1 μl buforu ładującego EB z barwnikiem do probówki z wzorcami RNA.
6. Uruchom żel pod napięciem 80 - 100 V Wewnątrz kaptura chemicznego w buforze do biegania, aż jeden z barwników (błękit bromofenolowy) dotrze do 2/3 dna żelu.
7. Spłucz żel dwa razy po 15 minut 250 ml de DEPC 2x SSC.
8. Zrób zdigitalizowane zdjęcie w świetle UV.
9. Oblicz stosunek między górnym pasmem (23S rRNA) a dolnym pasmem (16S rRNA).

4. Końcowe oczyszczanie RNA

1. Dostosować objętość próbki RNA do 100 μl za pomocą H₂O poddanego działaniu DEPC (jeśli to konieczne).
2. Dodać 100 μl kwaśnego fenolu (1 ml fenolu nasyconego_H2Opoddanego działaniu DEPC + 130 μl 50 mM octanu sodu, pH 5,2), energicznie mieszać.
3. Odwirować przez 10 minut przy 13 000 obr./min (15 000 x g) w temperaturze pokojowej.
4. Ostrożnie odzyskać i przenieść fazę wodną (fazę górną) do nowej, sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
5. Dodać 10 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 250 μl etanolu 100% (-20 °C).
6. Inkubować probówkę przez 30 minut w topniejącym lodzie.
7. Odwirować probówkę przez 30 minut przy 14 000 obr./min (18 000 x g) w temperaturze 4 °C.
8. Ostrożnie odessać rozpuszczalną frakcję i wyrzucić ją.
9. Dodaj 500 μl 70% etanolu (temperatura pokojowa) i przekręć rurkę.
10. Odwirować probówkę przez 20 minut przy 14 000 obr./min (18 000 x g) w temperaturze 4 °C.
11. Powtórz etap płukania (70% etanolu).
12. Krótko odwirować i usunąć pozostały etanol za pomocą pipety P200.
13. Pozostaw granulat do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
14. Zawiesić osad w 50 μl_H2O, poddanego działaniu DEPC.
15. Inkubować, a następnie probówkę przez 15 minut w temperaturze 45 °C.
16. Zmierzyć absorbancję (Abs) przy 260 nm i 280 nm na 2 μl próbki RNA. Obliczono stosunek Abs260/Abs280.
17. Przechowywać próbkę RNA w temperaturze -80 °C (stabilnej przez kilka lat).

5. Roztwory i procedury czyszczenia

1. Octan potasu 2 M, pH 5,0: Rozpuścić 19,6 g octanu potasu w 70 ml H₂O nasączony DEPC. Wyczyść sondę pH-metru, zanurzając ją w 1M NaOH przez 15 minut, a następnie przepłucz 5 razy 2 O. Dostosuj do pH 5,0 kwasem octowym, a następnie dostosuj objętość do 100 ml za pomocą H₂O poddanego działaniu DEPC.
2. Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-lauroilsarkozyna 1%: Rozpuścić 2 g N-lauroilosarkozyny (pod kapturem) w 40 ml 0,5 M Tris-base pH 8,0. Dostosować objętość do 200 ml za pomocą H₂O. poddanego działaniu DEPC) CsCl/EDTA: 96 g CsCl w 50 ml 10 mM EDTA pH 7,5 przygotowanym w autoklawie H₂O. poddanym działaniu DEPC i dostosować objętość do 100 ml za pomocą 2 O. Sprawdzić pH <7,5.
3. Żel agarozowy 1%: Umieść 1 g agarozy w 62 ml H₂O. Gotuj w kuchence mikrofalowej. Dodaj 18 ml 12,3 M formaldehydu, 20 ml 5x MOPS. Wlej do okapu chemicznego.
4. Bufor do przygotowania próbki: Do przygotowania dodatkowego. Wymieszaj w kapturze chemicznym 8 μl 5x MOPS, 16 μl 12,3 M formaldehydu i 40 μl formamidu.
5. Bufor ładujący EB (bez barwnika): Do przygotowania dodatkowego. Dodać 4 μl 10 mg/ml bromku etydyny do 20 μl 80% glicerolu przygotowanego z_H2Opoddanego działaniu DEPC.
6. Bufor ładujący EB (z barwnikiem): Do przygotowania dodatkowego. Dodać 2 μl 10 mg/ml bromku etydyny do 10 μl 80% glicerolu zawierającego 0,25% cyjanolu ksylenowego, 0,25% błękitu bromofenolowego z_H2Opoddanym działaniu DEPC.
7. Bufor do biegania: Do 60 ml 5x MOPS dodać 54 ml 12,3 M formaldehydu i 186 ml H₂O poddanego działaniu DEPC.
8. H₂O poddane działaniu DEPC: Inkubować wodę destylowaną z 0,1% v/v dietylopirowęglanem przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, mieszając. Sterylizuj w autoklawie.
9. Czyszczenie homogenizatora: Dodać 25 ml roztworu czyszczącego (RBS) do 1 l_H2Opoddanego działaniu DEPC i zanurzyć oś na 1 minutę, mieszając. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 60 °C. Dokładnie spłukać środkiem H_2Onasączonym DEPC Owinąć instrument w aluminium i włożyć do pudełka na instrumenty. Owiń pudełko. Sterylizuj w autoklawie.
10. Czyszczenie urządzenia do elektroforezy: Umyj urządzenie, tacę i grzebień z 15 dołkami. Inkubować 15 minut w 3% nadtlenku wodoru. Spłucz raz 100% etanolem. Suszyć na powietrzu.
11. Czyszczenie szklanych naczyń: Szklane naczynia RBS 2% należy czyścić przez całą noc, a następnie spłukać wodą destylowaną przed sterylizacją w temperaturze 200 °C.

Results

Procedura jouRNAl (Rysunek 1) pozwala nam odzyskać próbki siatkówki z bloku chirurgicznego do oczyszczonego RNA i przeanalizować transkryptom odwarstwienia siatkówki. Odwarstwienie siatkówki powoduje regulację w górę chemotaktycznego genu MCP1 CCL2 monocytów oraz zmniejszenie ekspresji genu transdukującego fotoreceptory pręcików GNAT1, krótkofalowej opsyny stożka OPN1sw i homeogenu CRX (Figura 2). Indukcja CCL2 wynika ze stanu zapalnego ^9...

Discussion

Opracowanie procedury odzyskiwania tkanek z bloku chirurgicznego miało zasadnicze znaczenie dla analizy transkryptomu odwarstwienia siatkówki. Należy zauważyć, że ten rodzaj chirurgii jest praktykowany w nagłych wypadkach i że operujący okuliści mają mało czasu na udział w biologicznym programie badawczym podczas operacji. Ta retinektomia jest również wykonywana stochastycznie w każdej usłudze, dzięki czemu łatwiejszym sposobem na osiągnięcie liczb statystycznych jest praca z siecią. W takiej sieci standaryzacja pobieran...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wirówka	Beckman Coreder	Aventi J-E
Rotor	Beckman Coulter	JS-5.3
Ultrawirówka	Beckman Coulter	LE 80K
Rotor	Beckman Coulter	SW41
Zasilacz	Biorad	Pac 3000
PolytronTM	Kinematica	PT 2100	W zestawie z PT-DA 2105:2
Urządzenie do elektroforezy w żelu agarozowym	Biorad	MiniGel Cell GT
Biorad		GelDoc-It Imager
5 ml sterylna probówka polietylenowa	Greiner	115261
Sterylna probówka wirówkowa z poliallomeru	Beckman Coulter	331372
Odczynniki chemiczne	Sigma		Klasa biologii molekularnej (produkty wolne od RNaz i DNaz)
Roztwór czyszczący	RBS firmy VWR
	Affymetrix	Human U133 plus 2