Izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł

Podsumowanie

To badanie opisuje skuteczną technikę izolowania i przetwarzania tkanek dziąseł z jamy ustnej myszy w celu wytworzenia hodowli jednokomórkowej. Uzyskane w ten sposób komórki mogą być dalej wykorzystywane do analizy cytometrii przepływowej i badań molekularnych.

Streszczenie

Opracowaliśmy technikę precyzyjnego izolowania i przetwarzania mysiej tkanki dziąseł do cytometrii przepływowej i badań molekularnych. Dziąsło jest unikalną i ważną tkanką do badania mechanizmów immunologicznych, ponieważ bierze udział w odpowiedzi immunologicznej gospodarza na biofilm jamy ustnej, który może powodować choroby przyzębia. Co więcej, bliskie sąsiedztwo dziąsła z tkanką kostną wyrostka zębodołowego umożliwia również badanie przebudowy kości w stanach zapalnych. Nasza metoda daje dużą liczbę komórek odpornościowych, co pozwala na analizę nawet rzadkich populacji komórek, takich jak komórki Langerhansa i limfocyty regulatorowe T, jak wykazaliśmy wcześniej ¹. Wykorzystanie myszy do badania lokalnych odpowiedzi immunologicznych zaangażowanych w utratę kości wyrostka zębodołowego podczas chorób przyzębia jest korzystne ze względu na dostępność różnych narzędzi immunologicznych i eksperymentalnych. Niemniej jednak, ze względu na ich niewielkie rozmiary i stosunkowo niewygodny dostęp do mysiego dziąsła, w wielu badaniach unikano badania tej krytycznej tkanki. Metoda opisana w tej pracy może ułatwić analizę dziąseł, co, miejmy nadzieję, zwiększy nasze zrozumienie na temat układu odpornościowego jamy ustnej i jego roli podczas chorób przyzębia.

Wprowadzenie

Dziąsło to miękka tkanka otaczająca szyjkową część zębów i pokrywająca wyrostek zębodołowy (Rysunek 1). Dziąsło jest rodzajem błony śluzowej żucia, którą można dalej podzielić na nabłonek błony śluzowej i tkankę łączną (znaną również jako błona podśluzowa lub blaszka właściwa). Anatomiczna budowa dziąsła i sąsiednich zębów pozwala bakteriom na przebywanie i rozwój płytki nazębnej (biofilmu), która stale stanowi wyzwanie dla miejscowego układu odpornościowego. W rezultacie w dziąśle rozwija się reakcja zapalna, która w pewnych okolicznościach staje się destrukcyjna - stan określany jako choroby przyzębia ². Zasadniczo patologie przyzębia wywołane blaszką miażdżycową można podzielić na zapalenie dziąseł i zapalenie przyzębia. Zapalenie dziąseł stanowi odwracalny stan miejscowej reakcji zapalnej, który jest ograniczony do dziąsła. Z drugiej strony zapalenie przyzębia jest nieodwracalnym procesem destrukcyjnym, w którym dochodzi do zniszczenia aparatu mocującego (kości wyrostka zębodołowego, więzadła przyzębia, cementu i dziąseł) ³.

Zaproponowano, aby dziąsło służyło zarówno jako miejsce efektorowe, jak i indukcyjne podczas chorób przyzębia ⁴. Badania na ludziach sugerują, że w odpowiedzi na płytkę nazębną, komórki i cząsteczki efektorowe układu odpornościowego dynamicznie infiltrują lub opuszczają dziąsło ^5-7. Wykazano, że aktywność ta odgrywa główną rolę w niszczeniu przyzębia ^8,9. Podczas gdy dane uzyskane w wyniku tych badań dostarczyły cennych informacji na temat tego patologicznego procesu, praca z tkankami ludzkimi ma poważne ograniczenia etyczne, techniczne i eksperymentalne. Opracowanie modeli eksperymentalnych umożliwiło przeprowadzenie eksperymentów przyczynowo-skutkowych z wykorzystaniem myszy transgenicznych i interwencji in vivo ¹⁰. W rezultacie w ciągu ostatnich dwóch dekad nasza wiedza na temat mechanizmów związanych z chorobami przyzębia znacznie wzrosła. Mimo to, ze względu na złożoność chorób przyzębia, toczy się debata na temat charakteru miejscowej odpowiedzi immunologicznej ułatwiającej niszczenie tkanek. Brakuje również naszej wiedzy na temat funkcji ośrodkowych komórek odpornościowych w dziąśle podczas chorób przyzębia. Dlatego tak ważne jest zbadanie patologicznych zdarzeń zapalnych występujących w tkance docelowej choroby, czyli dziąśle.

Protokół

Przygotuj się z wyprzedzeniem:

• PBS + 2% FCS
• PBS + 2% FCS z 2 mg/ml kolagenazy typu II i 1 mg/ml DNAzy typu I (1 ml na próbkę)
• Sterylizowane narzędzia chirurgiczne
• 0,5 M roztwór EDTA

1. Technika wycięcia górnego dziąsła

1. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC.
2. Przetnij obie strony jamy ustnej, w tym policzki i ramus żuchwy, ostrymi/prostymi nożyczkami.
3. Pociągnij żuchwę w dół.
4. Przetnij miękkie i twarde tkanki w wyimaginowaną linię 1 mm za trzecimi zębami trzonowymi za trzecimi zębami trzonowymi. Skieruj nożyczki prostopadle do płaszczyzny kości podniebiennej (ryc. 2A, niebieskie linie).
5. Naciąć tkanki miękkie i twarde 2 mm za siekaczami (ryc. 2A, niebieskie linie).
6. Pociągnij w dół przednią część ust. Jama nosowa jest widoczna po tym kroku.
7. Umieść nożyczki równolegle do podniebienia, włóż jedno ostrze do jamy nosowej, drugie ostrze powinno naciąć w przedsionku. Ciąć aż do tylnego nacięcia (ryc. 2A, zielone linie). Powtórz ten krok po obu stronach szczęki. Na końcu szczęka jest odłączona od reszty czaszki (ryc. 2B).
8. Usuń szczękę, przetnij ją w środkowym szwie (ryc. 2, przerywana linia) i przytnij tkankę podniebienną każdej półszczęki, aż dotrze do kości wyrostka zębodołowego.
9. Oderwij tkanki dziąseł (obie półszczęki) od ich przedniej granicy za pomocą kleszczy Adson (bez zębów).
10. Umieść wycięte dziąsło w talerzu z PBS + 2% FCS.

2. Przetwarzanie dziąseł

1. Wycięte dziąsło umieścić w naczyniu do hodowli tkankowej (35 x 10 mm) z 1 ml PBS + 2% FCS, 2 mg/ml kolagenazy typu II i 1 mg/ml DNAzy typu I.
2. Dokładnie zmiel tkankę za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego N°15.
3. Przenieść tkankę z płytki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
4. Tkankę/komórki pozostałe na płytce przemyć 1 ml PBS + 2% FCS i przenieść do tej samej probówki.
5. Inkubować w inkubatorze z wytrząsarką przez 20 minut w temperaturze 37 °C, 200 obr./min (zalecenie: podgrzać inkubator).
6. Dodać 20 μl EDTA 0,5 M i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C, 200 obr./min.
7. Napełnij probówkę do 12 ml PBS + 2% FCS i odwiruj w temperaturze 4 °C, 400 x g przez 8 minut (zalecenie: wstępne schłodzenie wirówki).
8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml PBS + 2% FCS.
9. Przefiltruj próbkę za pomocą sitka komórkowego o wielkości 70 μm i zaoszczędź przepływ.
10. Wirować w temperaturze 4 °C, 320 x g przez 5 min.
11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 300 μl PBS + 2% FCS.
12. Policz komórki (oczekuje się, że z pojedynczej szczęki będzie około 5-10 x^{10 5} komórek).

3. Barwienie przeciwciał zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Zaleca się pracę wewnątrz okapu, przy wyłączonym świetle. Bardzo ważne jest, aby ogniwa były utrzymywane w stałym chłodnym środowisku, a także wszystkie potrzebne materiały.

1. Wybarwić komórki przeciwko cząsteczkom zewnątrzkomórkowym, dodając 0,2-0,5 μg każdego wybranego przeciwciała na 1 x 10⁶ komórek w łącznej objętości 100 μl.
2. Wiruj krótko.
3. Inkubować probówki przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
4. Umyj komórki 2 ml PBS + 2% FCS.
5. Wirować w temperaturze 4 °C, 320 x g przez 5 min.
6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając kroplami 500 μl zimnego BD Cytoperm/Cytofix podczas wirowania.
7. Inkubować probówki przez 40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
8. Wiruj krótko.
9. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu do trwałej ondulacji/przemywania BD i wirować w temperaturze 800 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
10. Odsysać supernatant z wyjątkiem 300 μl.
11. Wybarwiaj komórki wewnątrzkomórkowo, dodając 1 μg każdego wybranego przeciwciała na 1 x 10⁶ komórek w łącznej objętości 100 μl.
12. Wiruj krótko.
13. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
14. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu do trwałej ondulacji/przemywania BD i wirować w temperaturze 800 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
15. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając 300 μl zimnego buforu BD Perm/Wash.
16. Wiruj krótko.
17. Przenieść zawiesinę podczas filtrowania do probówek FACS.
18. Trzymaj probówki w ciemnym i zimnym miejscu do czasu analizy.

Wyniki

Przedstawiono przykłady analizy cytometrii przepływowej komórek dziąseł. Komórki dziąseł zebrane z 2 myszy przeanalizowano za pomocą cytometru przepływowego LSR II oraz oprogramowania FlowJo. Rysunek 3A obrazuje rozkład komórek dziąseł z myszy naiwnych na wykresie rozproszenia bocznego (SSC) względem rozproszenia przedniego (FSC). Wskazano strategię bramkowania w celu identyfikacji (i) limfocytów, (ii) monocytów / komórek dendrytycznych oraz (iii) granulocytów. W celu porównania przedstawiono również wyk...

Dyskusja

Tkanki dziąsła szczęki uzyskane od pojedynczej myszy są wystarczające do analizy subpopulacji limfocytów T i B, a także ich zdolności do ekspresji cząsteczek zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych, jak opisaliśmy wcześniej ¹. Niemniej jednak, jeśli interesujące są rzadkie populacje komórek (na przykład DC), zaleca się pobranie tkanek od 2-3 myszy. Warto zauważyć, że jeśli jest to preferowane, możliwe jest obranie zarówno tkanek podniebiennych, jak i dziąseł, a następnie wycięcie dziąsła (modyfikacja kroku 1...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza typu II	Worthington Biochemical Corp.	CLS-2
DNAse I	SIGMA	DN25-1G
EDTA	SIGMA	E6758-100G
Dulbecco's PBS	SIGMA	D8537
Surowica bydlęca	Przemysł biologiczny	04-121-1	Inaktywowany termicznie
filtr próżniowy	Jet Biofil	FPE-204-500
5 ml Polistyren okrągłodenny Rurka	BD Falcon	352052
sitko do komórek 70 μ m	SPL Lifesciences	93070
Naczynie do hodowli tkankowych 35× 10 mm	NUNC	153066
BD Cytofix/Cytoperm Przeciwciało	przeciw
	Klon Biolegend	117305	Przeciwciało
przeciw myszym CD45.2	Biolegend	109819	Klon 104
Przeciwciało anty-mysie CD4	Biolegend	100413	Klon GK1.5
Przeciwciało anty-mysie CD8a	Biolegend	100733	Klon 53-6.7
Przeciwciało anty-mysie CD3	Klon Biolegend	100214	17A2
Przeciwciało anty-mysie CD326 (Ep-CAM)	Biolegend	118219	G8.8
Przeciwciało przeciw myszom CD207 (Langerin)	Imgenex	DDX0362D	Clone 929F3.01
Anty-mysie I-Ad (MHC-II) antobody	Biolegend	115010	Klon 39-10-8
Cytometr przepływowy LSR II	BD Biosciences
FlowJo Software v 7.6.5	Tree Star

płodu mysim CD11c 554714 Klon