Artykuł metodologiczny

Przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4 +

DOI:

10.3791/50389

⸱

6 maja 2013

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapewniamy powtarzalną metodę wywoływania cukrzycy typu 1 (T1D) u myszy w ciągu dwóch tygodni poprzez adopcyjny transfer pierwotnych limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysz bez otyłości z cukrzycą (NOD) spontanicznie rozwija autoimmunologiczną cukrzycę po 12 tygodniu życia i jest najdokładniej zbadanym zwierzęcym modelem ludzkiej cukrzycy typu 1 (T1D). Badania transferu komórek u napromieniowanych myszy biorców wykazały, że limfocyty T odgrywają kluczową rolę w patogenezie T1D w tym modelu. Opisujemy tutaj prostą metodę szybkiej indukcji T1D poprzez adoptywny transfer oczyszczonych, pierwotnych limfocytów T CD4 + od myszy NOD z precukrzycą transgenicznych dla receptora komórek T specyficznych dla wysp trzustkowych (TCR) BDC2.5 do NOD. Myszy biorcy SCID. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że izolacja i adoptywny transfer limfocytów T cukrzycowych może zostać zakończony w ciągu tego samego dnia, napromienianie biorców nie jest wymagane, a wysoka częstość występowania cukrzycy typu 1 jest wywoływana w ciągu 2 tygodni po transferze limfocytów T. W związku z tym badania nad patogenezą i interwencjami terapeutycznymi w cukrzycy typu 1 mogą przebiegać szybciej niż w przypadku metod opierających się na heterogenicznych populacjach limfocytów T lub klonach pochodzących od myszy NOD z cukrzycą.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysz NOD spontanicznie rozwija autoimmunologiczną cukrzycę i jest szeroko stosowana jako model zwierzęcy dla ludzkiej cukrzycy typu1,2. Patogeneza cukrzycy typu 1 u myszy NOD charakteryzuje się infiltracją, począwszy od 3-4 tygodnia życia, wysp trzustkowych Langerhansa przez komórki dendrytyczne i makrofagi, a następnie przez limfocyty T i B. Ta faza nieniszczącego zapalenia okołowyspowego prowadzi do powolnego, postępującego niszczenia komórek β trzustki produkujących insulinę, co prowadzi do jawnej cukrzycy w wieku 4-6 miesięcy3. Wykazano, że transfer limfocytów Tsplenocytów 4,5, CD4 + 6,7 lub CD8 + 8,9 z cukrzycą myszy NOD pośredniczy w cukrzycy u myszy NOD z obniżoną odpornością, co wskazuje, że limfocyty T reagujące na wyspy trzustkowe odgrywają kluczową rolę w patogenezie T1D. W zależności od warunków eksperymentalnych, cukrzyca rozwijała się u myszy biorców powoli, przez kilka tygodni w tych badaniach. Podobnie, doniesiono, że różne klony limfocytów T, uzyskane w wyniku czasochłonnej i kosztownej hodowli cukrzycopochodnych limfocytów T, pośredniczą w cukrzycy kilka tygodni po przeniesieniu do myszy biorców7,10. Wraz z dostępnością transgenicznych myszy wykazujących ekspresję TCR pochodzących z klonów cukrzycowych limfocytów T ograniczonych CD4 lub CD8, kilka laboratoriów wykazało następnie, że limfocyty T śledziony od takich myszy były w stanie przenieść cukrzycę na biorców11-13. W szczególności myszy BDC2.5 NOD są transgeniczne dla BDC2.5 TCR, który jest specyficzny dla chromograniny A, białka w komórkach beta trzustki14-16. Transfer aktywowanych lub nieaktywowanych lub nieaktywowanych całych lub frakcjonowanych komórek śledziony in vitro od myszy BDC2.5 z jawną cukrzycą lub stanem przedcukrzycowym przeniósł cukrzycę na noworodki lub myszy NOD z niedoborem odporności z różną skutecznością11,17-19.

Opisujemy prostą metodę, która wykorzystuje oczyszczone transgeniczne limfocyty T CD4+ od myszy BDC2.5 z precukrzycą do indukowania T1D u myszy biorców z wysoką wydajnością i spójnością. Duża liczba naiwnych, specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych limfocytów T CD4 + jest izolowana od tych myszy przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) dla limfocytów T CD4 + CD62L + eksprymujących transgeniczny łańcuch TCR Vβ4. Oczyszczone transgeniczne limfocyty T są następnie przenoszone bez aktywacji do NOD. Myszy SCID, które nie mają funkcjonalnych limfocytów T i B i są wolne od zapalenia wysp i cukrzycy20. Myszy biorcy są monitorowane pod kątem podwyższonego stężenia glukozy w moczu wskazującego na cukrzycę typu 1, która rozwija się szybko w ciągu dwóch tygodni po przeniesieniu limfocytów T.

W przeciwieństwie do innych metod, które przenoszą cukrzycotwórcze limfocyty T o heterogenicznej specyficzności, nasz protokół wykorzystuje sortowane przez FACS limfocyty T CD4+, które prawie wyłącznie wyrażają cukrzycogenny BDC2.5 TCR. Ze względu na ich jednorodność, tylko niewielka liczba przeniesionych limfocytów T (~1x106 komórek/mysz) jest wymagana do szybkiego rozwoju T1D w ciągu 2 tygodni przy 100% częstości występowania. Kolejną zaletą naszego protokołu jest to, że napromienianie myszy biorców nie jest konieczne, jak ma to miejsce w przypadku niektórych innych metod. Potencjalnym ograniczeniem tej metody jest to, że nie pozwala ona na badanie udziału zarówno podzbiorów limfocytów T CD4, jak i CD8, a konkretnie limfocytów T CD8 w cukrzycy.

Opisany protokół będzie przydatny do badania szybkiego rozwoju T1D, w którym pośredniczą naiwne, monospecyficzne limfocyty T CD4+, a także strategii terapeutycznych mających na celu interwencję w naprowadzanie komórek Th specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych do narządu docelowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja limfocytów T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy BDC2.5

  1. Użyj 6-tygodniowych samic myszy BDC2.5 ze stanem przedcukrzycowym jako dawców cukrzycowych limfocytów T CD4 +. Myszy powinny być wolne od cukrzycy, co określono na podstawie pomiaru stężenia glukozy w moczu (patrz poniżej).
  2. Poddaj każdą mysz eutanazji za pomocą uduszenia CO2 i usuń śledzionę, węzły chłonne pachowe i ramienne w sterylnych warunkach. Aby usunąć śledzionę, namocz futro 70% etanolem, a następnie przetnij i wycofaj skórę. Śledziona będzie widoczna jako ciemnoczerwony narząd po lewej stronie myszy. Wykonaj 1-calowe nacięcie w otrzewnej za pomocą małych nożyczek i delikatnie chwyć śledzionę pośrodku za pomocą małej pęsety. Ostrożnie przyciąć tkankę łączną i przyczepiony tłuszcz tak bardzo, jak to możliwe, i usunąć śledzionę.
  3. Zebrać śledziony i węzły chłonne w 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie.
  4. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, używając końcówki sterylnego tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, aby delikatnie przecisnąć narządy limfatyczne przez sitka o wielkości 70 μm (jedna śledziona na sitko i 4-6 węzłów chłonnych na sitko) do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.

Podczas procesu, przepłucz każde sitko 1 ml DMEM kilka razy, aby zmaksymalizować odzysk komórek z sitka.

  1. Przenieść zebrane komórki z probówki stożkowej o pojemności 50 ml do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 300-400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Aby dokonać lizy czerwonych krwinek, należy odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu amonowo-chlorkowo-potasowego (ACK) (pH 7,2) i inkubować zawiesinę komórek ACK w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  3. Dodać 10 ml DMEM do zawiesiny komórek ACK i odwirować probówkę jak powyżej. Umyj osad komórkowy raz w 10 ml DMEM.

2. Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek cukrzycopochodnych limfocytów T CD4+ od myszy BDC2.5

  1. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforze barwiącym FACS i policzyć liczbę żywotnych komórek (za pomocą mikroskopu kontrastu fazowego i hemocytometru) przez wykluczenie barwnika błękitu trypanowego.
  2. Używając bufora FACS, dostosuj objętość zawiesiny komórek do 5 x 107 komórek/ml. Usuń ~1 x 106 komórek na kontrolę barwienia (1 bez plamy, 3 pojedyncze plamy). Wybarwić próbkę pod kątem nieaktywowanych transgenicznych limfocytów T CD4 + przeciwciałami monoklonalnymi anty-CD4 (APC), anty-TCR Vβ4 (FITC) i anty-CD62L (PE) (mAb) w probówce o pojemności 15 ml. Barwienie komórek należy wykonywać przy użyciu stężeń mAb sugerowanych przez producenta przez 20-30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  3. Przemyć próbkę i kontrole pojedynczego barwienia buforem FACS przy >3 razy większej objętości reakcji barwienia. Odwirować probówkę o sile 300-400 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze FACS (1-2 x 107 komórek/ml do sortowania próbki i 300 μl do kontroli pojedynczego barwienia) i przechowywać na lodzie do następnego etapu.
  4. Przepuść próbkę komórek przez rurkę z nakrętką sitka o średnicy 35 μm, aby usunąć grudki komórek. Posortuj próbki pod kątem komórek CD4+TCR Vβ4+CD62L+ na sortowniku komórek z przeszkolonym operatorem. Zebrać posortowane komórki do 3 ml DMEM w probówce o pojemności 15 ml. Odczekaj 2,5-3 godziny, w tym konfigurację, na posortowanie 1,5 x 108 komórek (przybliżona liczba komórek uzyskanych od 3 myszy dawców) z szybkością sortowania 2 x 104 całkowitych zdarzeń / s. Spodziewaj się ~ 2,5 x 106 nieaktywowanych transgenicznych limfocytów T CD4 + na mysz po sortowaniu komórek.
  5. Zapisać bezwzględną liczbę posortowanych komórek na końcu sortowania i odwirować je przez 7 minut przy 300-400 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki (2 x 10,6 komórek/ml) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (wolne od Mg2 + / Ca2+) w celu adoptywnego transferu limfocytów T.

3. Adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4+ od myszy BDC2.5

  1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły o rozmiarze 18-11/2 delikatnie ponownie zawiesić oczyszczone przez FACS limfocyty T CD4+ i załadować strzykawkę o pojemności 1 ml. W ramach przygotowań do wstrzyknięcia należy wymienić igłę o rozmiarze 18-11/2 na igłę o rozmiarze 271/2.
  2. Wystaw 6-8 tygodniową samicę NOD. Myszy biorcy SCID są umieszczane w lampie grzewczej, dopóki nie wykażą zachowań pielęgnacyjnych.
  3. Unieruchomić myszy biorców w unieruchomieniu i przetrzeć ich ogon 70% (v/v) etanolem, aby zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia.
  4. Wstrzyknąć 1-2 x 106 posortowanych komórek FACS/mysz (w ilości do 500 μl PBS) do jednej z bocznych żył ogonowych.

Nie naciskaj na tłok. Jeśli igła jest prawidłowo umieszczona w żyle, wstrzyknięcie odbędzie się prawie bez oporu.

4. Monitorowanie myszy biorców pod kątem hiperglikemii i cukrzycy typu 1

  1. Rozpoczynając pięć dni po transferze limfocytów T, NOD. Myszy z biorcą SCID są codziennie monitorowane pod kątem podwyższonego stężenia glukozy w moczu za pomocą pasków odczynników (Bayer Diastix) zgodnie z instrukcjami producenta. Myszy z dwoma kolejnymi odczytami stężenia glukozy w moczu >250 mg/dl są uważane za cukrzyce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze wyniki pokazują izolację transgenicznych komórek BDC2.5 wyrażających CD62L, co jest kluczowe dla komórek T do zadomowienia się w wtórnych narządach limfatycznych, takich jak węzły chłonne trzustki. Nasze odkrycia dodatkowo pokazują silną zdolność tej monospecyficznej populacji limfocytów T do szybkiego i skutecznego przenoszenia T1D do NOD. Myszy biorcy SCID.

Izolacja cukrzycowych limfocytów T CD4+ od myszy BDC2.5 jest pokazana na rysunku 2. Około 5 x 107 komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T1D może być indukowana u myszy biorców z różną skutecznością poprzez adoptywny transfer całych komórek śledziony lub podzbiorów limfocytów T od myszy NOD z cukrzycą lub myszy transgenicznych dla TCR pochodzących z klonów limfocytów T cukrzycowych. W niniejszym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę indukowania cukrzycy typu 1 u myszy biorców w ciągu dwóch tygodni przy 100% częstości występowania poprzez przeniesienie transgenicznych limfocytów T CD4 + CD4 + oczyszczonych przez FACS CD62L + + BDC2.5 do NOD. Myszy SCID...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie myszy były trzymane w placówce Penn State College of Medicine wolnej od specyficznych patogenów (SPF) zgodnie z wytycznymi Penn State Institutional Animal Care and Use Committee.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy doktorom Robertowi Bonneau i Neilowi Christensenowi za pomocne komentarze.

Ta praca była wspierana przez fundusze Pennsylvania State University College of Medicine.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Transgeniczne myszy NOD BDC 2.5 TCR (NOD. Cg-Tg(Tcr&alfa; BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5)JAX004460
NOD. Myszy SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J)JAX001303
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Themo ScientificSH30022.01
Bayer DiastixFisher ScientificAM2803
15 ml probówki stożkoweFalcon352095
50 ml Falcon352070
Sterylne pęsety
Sterylne nożyczki
Sterylne nożyczki
70 μ m sitka komórkoweFisher Scientific22363548
35 μ m rurki z nasadką sitową do komórekBD Biosciences352235
Bufor0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 w dH2O
BD FACSFlowTM płyn doBiosciences342003
buforbarwiący FACSPBS, 0,2 mM EDTA, 0,5% BSA/FCS, sterylizowany filtrem
z kontrastem fazowym
Trypan niebieski
Hemocytometr
Anty-CD4 (APC) mAbBiolegend1005616klon RM4-5
Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAbBD Biosciences553365klon KT4
Anty-CD62L (PE) mAbBD Biosciences553151klon MEL-14
Sortownik komórekBD Biosciencesnp. BD FACSAria III Lampa
grzewcza
przytrzymująca
1 mlBecton Dickinson309602
Igły pomiarowe 18-1½ (sterylne)Igły pomiaroweBecton Dickinson305196
27½ (sterylne)Druty pomiaroweBecton Dickinson305109
chirurgicznedo małych pardo dużych par chlorkowo-potasowy amonu (ACK) barwienia BD Mikroskop Strzykawka dla myszy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
  2. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
  3. Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
  4. Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
  5. Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
  6. Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
  7. Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
  8. Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
  9. Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
  10. Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
  11. Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
  12. Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
  13. Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
  14. Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
  15. Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
  16. Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
  17. Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
  18. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
  19. Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
  20. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
  21. Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
  22. Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
  23. Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
  24. Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Adoptywne przeniesienie limfocyt w Toczyszczanie limfocyt w T CD4myszy NOD SCIDmyszy transgeniczne BDC2 5protok sortowania kom rekiniekcja do ylna do y y ogonowejmonitorowanie poziomu glukozy w moczupobieranie w z w ch onnychizolacja ledziony

Powiązane artykuły