Procedury oparte na mikropłytkach są opisane dla kolorymetrycznej lub fluorometrycznej analizy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych. Procedury te pozwalają na szybkie oznaczenie takiej aktywności na dużej liczbie próbek środowiskowych w rozsądnych ramach czasowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Znaczna część obiegu składników odżywczych i przetwarzania węgla w naturalnym środowisku odbywa się poprzez aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez mikroorganizmy. W ten sposób pomiar aktywności tych enzymów zewnątrzkomórkowych może dać wgląd w tempo procesów na poziomie ekosystemu, takich jak rozkład materii organicznej lub mineralizacja azotu i fosforu. Testy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w próbkach środowiskowych zazwyczaj obejmują wystawienie próbek na działanie sztucznych substratów kolorymetrycznych lub fluorometrycznych i śledzenie szybkości hydrolizy substratu. W tym miejscu opisujemy metody oparte na mikropłytkach dla tych procedur, które pozwalają na analizę dużej liczby próbek w krótkim czasie. Próbki mogą reagować ze sztucznymi podłożami w 96-dołkowych mikropłytkach lub blokach mikropłytek głębokich, a następnie określa się aktywność enzymu przez absorpcję lub fluorescencję otrzymanego produktu końcowego za pomocą typowego czytnika mikropłytek lub fluorometru. Tak wysokowydajne procedury nie tylko ułatwiają porównania między przestrzennie oddzielonymi miejscami lub ekosystemami, ale także znacznie obniżają koszty takich testów poprzez zmniejszenie całkowitej objętości odczynników potrzebnych na próbkę.
Wprowadzenie
Mikroorganizmy, takie jak bakterie i grzyby, pozyskują składniki odżywcze i węgiel ze złożonych związków organicznych poprzez produkcję enzymów zewnątrzkomórkowych. Enzymy te zazwyczaj hydrolizują polimery na mniejsze podjednostki, które mogą zostać wprowadzone do komórki. Dlatego na poziomie ekologicznym te mikrobiologiczne enzymy zewnątrzkomórkowe są odpowiedzialne za znaczną część mineralizacji składników odżywczych i rozkładu materii organicznej, które zachodzą w środowisku naturalnym. Enzymy, takie jak celobiohydrolaza (CBH) i β-glukozydaza, są ważne dla degradacji celulozy i działają zgodnie, katalizując hydrolizę celulozy doglukozy 1,2, która zapewni....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Kolorymetryczna analiza aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebach i osadach
1. Przygotowanie substratów i roztworów buforowych do kolorymetrycznych analiz aktywności enzymów
- Przygotować 50 mM bufor octanowy (pH 5,0-5,5), mieszając 50 ml 0,1 M kwasu octowego (2,87 ml lodowatego kwasu octowego w 500 ml wody), 150 ml 0,1 M octanu sodu i 200 ml destylowanegoH2O. W razie potrzeby dostosować pH do 5,0-5,5 z 0,1 M kwasem octowym.
- Przygotować roztwór 1 M wodorotlenku sodu (NaOH) w destylowanymH2O.
- Przygotować roztwory substratów połączonych zp NP w buforze octanowym 50 mM. Do oznacz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Gleby i osady wodne zazwyczaj wykazują znaczną aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych, co jest wynikiem obecności przytwierdzonych społeczności drobnoustrojów (biofilmów) rozwijających się na powierzchni cząsteczek. Rysunek 3 przedstawia, w jaki sposób aktywność ta zmienia się w zależności od wielkości cząsteczek pobranych z osadu powierzchniowego strumienia trzeciego rzędu w północnym Mississippi, USA. Poprzednie badanie wykazało, że społeczności bakteryjne na cząsteczkach osadu z tego strumienia można p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Określenie aktywności różnych mikrobiologicznych enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie i osadach może dostarczyć użytecznych informacji na temat tempa mineralizacji składników odżywczych i przetwarzania materii organicznej17. Jednak gleby mogą różnić się poziomem wilgotności, dlatego ważne jest, aby ustandaryzować aktywność do suchej masy gleby. Wymaga to dodatkowego etapu suszenia (zwykle trwającego dwa dni) poza samym pomiarem aktywności enzymów. Tak więc, w przeciwieństwie do testów aktywności enzymów w prób.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Finansowanie niektórych aspektów tej pracy zostało zapewnione przez różne źródła, w tym przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (United States Department of Agriculture Specific Cooperative Agreement) 58-6408-1-595 oraz National Science Foundation (nagroda 1049911).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI I MATERIAŁY | |||
| Glacial acetic acid | Różni dostawcy | ||
| Octan sodu | Różni dostawcy | ||
| sodu | Różni dostawcy | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Dostępne zamienniki |
| p-nitrofenyl (pNP)-fosforan | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glukopiranozyd | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetyloglukozaminid | Sigma | N9376 | p Podłoże NP |
| Przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki | Fisher | 12-563-301 | Dostępne zamienniki |
| 96-dołkowe bloki głębinowe | Costar | 3958 | Dostępne zamienniki |
| Aluminiowe szalki | wagowe Różni dostawcy | ||
| Sterylne probówki | Różni dostawcy | ||
| Sterylne probówki | wirówkowe 50 mlRóżni dostawcy | ||
| 4-metylombellitryron | Sigma | M1381 | |
| 4-metylombliferyl (MUB)-fosforan | Sigma | M8883 | MUB-substrat |
| 4-MUB-glukopiranozyd | Sigma | M3633 | MUB-substrat |
| 4-MUB-N-acetyloglukozaminid | Sigma | M2133 | MUB-substrat |
| Wodorowęglan | Różni dostawcy | ||
| 96-dołkowa mikropłytka | Costar | 3792 | |
| na pipety | Różni dostawcy | ||
| EQUIPMENT | |||
| Wirówka | Eppendorf | 5810R | |
| Wirnik wirówki | Eppendorf | A-4-81 | Do mikropłytek/bloków |
| głębinowychCzytnik mikropłytek | BioTek | Synergy HT | Dostępne zamienniki |
| Fluorometr do mikropłytek | BioTek | FLx 800 | Dostępne alternatywnie |
| pipety | Różni dostawcy |
Bibliografia
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Woo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
