Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek

Podsumowanie

Procedury oparte na mikropłytkach są opisane dla kolorymetrycznej lub fluorometrycznej analizy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych. Procedury te pozwalają na szybkie oznaczenie takiej aktywności na dużej liczbie próbek środowiskowych w rozsądnych ramach czasowych.

Streszczenie

Znaczna część obiegu składników odżywczych i przetwarzania węgla w naturalnym środowisku odbywa się poprzez aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez mikroorganizmy. W ten sposób pomiar aktywności tych enzymów zewnątrzkomórkowych może dać wgląd w tempo procesów na poziomie ekosystemu, takich jak rozkład materii organicznej lub mineralizacja azotu i fosforu. Testy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w próbkach środowiskowych zazwyczaj obejmują wystawienie próbek na działanie sztucznych substratów kolorymetrycznych lub fluorometrycznych i śledzenie szybkości hydrolizy substratu. W tym miejscu opisujemy metody oparte na mikropłytkach dla tych procedur, które pozwalają na analizę dużej liczby próbek w krótkim czasie. Próbki mogą reagować ze sztucznymi podłożami w 96-dołkowych mikropłytkach lub blokach mikropłytek głębokich, a następnie określa się aktywność enzymu przez absorpcję lub fluorescencję otrzymanego produktu końcowego za pomocą typowego czytnika mikropłytek lub fluorometru. Tak wysokowydajne procedury nie tylko ułatwiają porównania między przestrzennie oddzielonymi miejscami lub ekosystemami, ale także znacznie obniżają koszty takich testów poprzez zmniejszenie całkowitej objętości odczynników potrzebnych na próbkę.

Wprowadzenie

Mikroorganizmy, takie jak bakterie i grzyby, pozyskują składniki odżywcze i węgiel ze złożonych związków organicznych poprzez produkcję enzymów zewnątrzkomórkowych. Enzymy te zazwyczaj hydrolizują polimery na mniejsze podjednostki, które mogą zostać wprowadzone do komórki. Dlatego na poziomie ekologicznym te mikrobiologiczne enzymy zewnątrzkomórkowe są odpowiedzialne za znaczną część mineralizacji składników odżywczych i rozkładu materii organicznej, które zachodzą w środowisku naturalnym. Enzymy, takie jak celobiohydrolaza (CBH) i β-glukozydaza, są ważne dla degradacji celulozy i działają zgodnie, katalizując hydrolizę celulozy do^{glukozy 1,2}, która zapewnia użyteczny substrat węglowy do wychwytu i asymilacji drobnoustrojów. Enzym fosfataza uwalnia rozpuszczalne nieorganiczne grupy fosforanowe z fosforanów organicznych, zasadniczo mineralizując fosforan i udostępniając go do wykorzystania przez większość organizmów³. Inne enzymy, takie jak N-acetyloglukozaminidaza (NAGaza), odgrywają ważną rolę w degradacji chityny i mogą udostępniać zarówno węgiel, jak i azot do pozyskiwania przez mikroorganizmy⁴.

Jedną z procedur badania aktywności mikrobiologicznej enzymów zewnątrzkomórkowych w naturalnym środowisku jest użycie sztucznych substratów połączonych z p-nitrofenylem (pNP), podejście, które pierwotnie zostało opracowane do wykrywania aktywności fosfatazy glebowej⁵. Podejście to opiera się na wykrywaniu kolorowego produktu końcowego, p-nitrofenolu, który jest uwalniany, gdy sztuczny substrat jest hydrolizowany przez odpowiedni enzym. P-nitrofenol można następnie określić ilościowo kolorymetrycznie, mierząc jego absorbancję przy około 400-410 nm. Od tego czasu metoda ta została zastosowana do wykrywania innych enzymów, takich jak NAGaza⁶, i była stosowana w różnych badaniach dotyczących aktywności mikrobiologicznych enzymów zewnątrzkomórkowych w glebach i osadach^7-9.

Alternatywne podejście, które pierwotnie zostało opracowane do oceny aktywności zewnątrzkomórkowej glukozydazy w środowisku wodnym^10,11 wykorzystuje substraty połączone z 4-metylolumbelliferonem (MUB). Uwolniony produkt końcowy (4-metyloumbelliloron) jest wysoce fluorescencyjny i można go wykryć za pomocą fluorometru z ustawieniem wzbudzenia/emisji około 360/460 nm. Dostępnych jest wiele rodzajów sztucznych substratów połączonych z MUB, co pozwala na fluorometryczny pomiar aktywności co najmniej tylu enzymów (np. β-glukozydazy, celulobiohydrolazy, NAGazy, fosfatazy), ile można oznaczyć za pomocą procedury kolorymetrycznej pNP-substrate. Inne mikrobiologiczne enzymy zewnątrzkomórkowe, takie jak rozkładająca białko aminopeptydaza leucynowa, można oznaczyć fluorometrycznie przy użyciu substratów połączonych z 7-amino-4-metylokoumaryną (COU). Zarówno substraty połączone z MUB, jak i COU wykorzystano do określenia aktywności enzymatycznej w różnych próbkach lądowych i wodnych^12,13.

Podczas gdy poprzednie badania opisywały metody mikropłytek fluorometrycznych lub kolorymetrycznych do określania aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych¹⁴; istnieje potrzeba jasnej prezentacji, jak przeprowadzać takie testy. W tym miejscu przedstawiono procedury przeprowadzania wysokoprzepustowych technik mikropłytek do analizy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebach i osadach przy użyciu podejścia kolorymetrycznego p-NP-linked substrates oraz w wodach naturalnych przy użyciu techniki fluorescencyjnych podłoży połączonych MUB. Koncentrujemy się na pomiarze aktywności β-glukozydazy, NAGazy i fosfatazy, ponieważ enzymy te mogą być powiązane odpowiednio z obiegiem węgla, azotu i fosforu. Jednak opisane tutaj procedury można zastosować do pomiaru innych enzymów zewnątrzkomórkowych przy użyciu różnych sztucznych substratów.

Protokół

Kolorymetryczna analiza aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebach i osadach

1. Przygotowanie substratów i roztworów buforowych do kolorymetrycznych analiz aktywności enzymów

1. Przygotować 50 mM bufor octanowy (pH 5,0-5,5), mieszając 50 ml 0,1 M kwasu octowego (2,87 ml lodowatego kwasu octowego w 500 ml wody), 150 ml 0,1 M octanu sodu i 200 ml destylowanego_H2O. W razie potrzeby dostosować pH do 5,0-5,5 z 0,1 M kwasem octowym.
2. Przygotować roztwór 1 M wodorotlenku sodu (NaOH) w destylowanym_H2O.
3. Przygotować roztwory substratów połączonych zp NP w buforze octanowym 50 mM. Do oznaczania fosfatazy przygotować 5 mM pNP-fosforanu w 50 mM buforze octanowym ; do oznaczania β-glukozydazy należy przygotować 5 mM pNP-β-glukopiranozyd; do oznaczania NAGazy należy przygotować 2 mM pNP-β-N-acetyloglukozaminid. Przygotować wszystkie roztwory substratów w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml lub 50 ml. Roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 tygodnie.

2. Wyznaczanie wzorca do przeliczania absorbancji na stężenie pNP

1. Przygotować wzorcowe roztwory p-nitrofenolu w buforze octanowym 50 mM. Stężenia powinny wynosić od 0,025-1 mM.
2. Przenieść trzy powtórzenia po 100 μl każdego stężenia na klarowną 96-dołkową mikropłytkę. Dodać 10 μl 1 M NaOH i 190 μl destylowanego H₂O do każdej studzienki.
3. Zapisać absorbancję przy długości fali 410 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
4. Pomnóż stężenia w krzywej wzorcowej przez 0,3, aby uzyskać μmole pNP na 300 μl objętości reakcji. Wykreślić krzywą absorbancji w funkcji μmol pNP. Nachylenie krzywej służy jako współczynnik konwersji (C), który będzie odnosił absorbancję do μmola pNP w każdej reakcji enzymatycznej.

3. Przeprowadzanie testu enzymatycznego

1. W przypadku gleby należy przygotować zawiesinę z każdej próbki, która ma być oznaczona w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w stężeniu około 1 g/^ml-1 przy użyciu 50 mM buforu octanowego. W przypadku osadów należy dodać wystarczającą ilość buforu octanowego, aby zawiesina mogła być łatwo pipetowana. Dokładna potrzebna objętość gnojowicy będzie się różnić w zależności od liczby badanych enzymów, ale zalecane jest co najmniej 5 ml. Wiruj każdą zawiesinę, aż wszystkie grudki gleby lub osadu rozproszą się i zanotuj ostateczną objętość.
2. Ponownie zwirować każdą zawiesinę i natychmiast odpipetować 150 μl do każdej z sześciu studzienek na 96-dołkowym bloku studni głębinowej (rysunek 1). Ważne jest, aby dokładnie i często wirować, aby utrzymać cząstki gleby w zawiesinie. Pozostaw co najmniej dwie studzienki na blok puste, aby służyły jako kontrola substratu. Uwaga: przed pipetowaniem przytnij końcówki pipet nożyczkami, ponieważ zawiesiny glebowe mają tendencję do zatykania końcówek. Przygotuj jeden 96-dołkowy blok dla każdego enzymu, który ma być oznaczony.
3. Wlać około 5 ml buforu octanowego do zbiornika pipety i za pomocą pipety 8-kanałowej dodać 150 μl buforu do dwóch ostatnich dołków każdej próbki (będą to kontrolne próbki) i dwóch studzienek kontrolnych substratu (rysunek 1)
4. Wlać około 10 ml odpowiedniego roztworu substratu pNP do zbiornika pipety i za pomocą pipety 8-kanałowej dodać 150 μl roztworu substratu do pierwszych czterech dołków każdej próbki i dwóch studzienek kontrolnych substratu (rysunek 1). Zwróć uwagę na czas, w którym reakcja rozpoczyna się od momentu dodania roztworu substratu.
5. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej (22 °C) przez 0,5-4 godziny. Dokładny czas inkubacji będzie się różnić w zależności od poziomu aktywności w próbkach i enzymu, który ma być oznaczony. W przypadku większości gleb i osadów fosfataza i β-glukozydaza wymagają czasu inkubacji 0,5-1,5 godziny, podczas gdy NAGaza i inne enzymy wymagają czasu inkubacji >2 godziny.
6. Podczas inkubacji testów przygotuj przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki do odczytu absorbancji. Przygotować jedną mikropłytkę dla każdego bloku studni głębinowej (tj. dla każdego badanego enzymu). Odpipetować 10 μl 1 M NaOH i 190 μl wody destylowanej do każdego dołka mikropłytki. Uwaga: NaOH spowalnia reakcję enzymatyczną i podnosi pH, co wzmacnia kolor pNP uwalnianego podczas reakcji.
7. Po inkubacji odwirować 96-dołkowe bloki o stężeniu 2,000-5,000 x g przez 5 minut, aby osadzać cząstki gleby.
8. Za pomocą pipety wielokanałowej pobrać 100 μl z każdej studzienki, uważając, aby uniknąć osadu, i przenieść go do odpowiedniego dołka na przygotowanej przezroczystej 96-dołkowej mikropłytce.
9. Włącz czytnik mikropłytek i zainstaluj niezbędne oprogramowanie. Rekordowa absorbancja przy 410 nm. Jeśli absorbancja danego dołka przekracza liniową granicę wykrywalności czytnika płytek, rozcieńczyć tę studzienkę w stosunku 1:1 wodą i ponownie zmierzyć. Jeżeli absorbancja jest nadal zbyt wysoka, test należy powtórzyć z krótszym czasem inkubacji.

4. Oznaczanie suchej masy próbek

1. Odpipetować 1 ml zawiesiny każdej próbki do wstępnie zważonej aluminiowej szalki.
2. Suszyć w suszarce w temperaturze 75 °C przez 48 godzin i zważyć. Od tej wartości należy odjąć masę garnka, aby uzyskać suchą masę gleby lub osadu w 1 ml gnojowicy. Pomnożyć przez współczynnik 0,15 w celu oznaczenia suchej masy próbki w 150 μl dodanej do każdego dołka w teście enzymatycznym.

5. Obliczanie aktywności enzymu na suchą masę gleby lub osadu

1. Obliczyć końcową absorbancję każdej próbki, odejmując absorbancję kontrolną próbki od absorbancji próbki testowej. Jeśli kontrole substratu mają wysoką absorbancję (około >0,060), należy je również odjąć.
2. Obliczyć aktywność enzymatyczną w μmolach ^hr-1 g suchej ^masy-1 z równania:

Aktywność enzymu = Końcowa absorbancja / (C x czas inkubacji x sucha masa próbki)

Analiza fluorescencyjna aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach naturalnych

1. Przygotowanie roztworów substratowych, wzorcowych i buforowych do analiz fluorometrycznych aktywności enzymów

1. Przygotować 200 μM roztwory substratów połączonych MUB (np. 4-MUB-β-glukopiranozyd, 4-MUB-fosforan, 4-MUB-N-acetylo-β-D-glukozaminid) przez rozpuszczenie odpowiedniego substratu w sterylnym (autoklawowanym) destylowanym_H2Ow sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml lub 50 ml. Zawiń probówki w folię aluminiową, aby wykluczyć światło i przechowuj w lodówce przed użyciem. Podłoża powinny być stabilne przez co najmniej 1 tydzień, jeśli są przechowywane w ten sposób.
2. Przygotować wzorzec MUB, sporządzając roztwór podstawowy 100 μM 4-metylolumbelliferonu w sterylnym destylowanym_H2O. Przechowywać w lodówce w butelce owiniętej w bursztyn lub folię. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy 100 μM w stosunku 1/10 do sterylnego_H2O, aby uzyskać roztwór roboczy 10 μM do oznaczania enzymów.
3. Przygotować roztwór podstawowy 100 mM buforu wodorowęglanowego, rozpuszczając 8,4 g_NaHCO3 w 1 L_H2O i sterylizując w autoklawie. Rozcieńczyć ten roztwór podstawowy w stosunku 1:20 do sterylnego_H2Ow razie potrzeby, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 5 mM do oznaczania enzymów.

2. Porządkowanie próbek wody na 96-dołkowej czarnej mikropłytce

1. Zorganizuj mikropłytkę dla każdego enzymu zgodnie z przykładem pokazanym na rysunku 2. Należy pamiętać, że pozwalając na odpowiednią replikację, standardy i kontrole, procedura ta może oznaczać aktywność pojedynczego enzymu dla maksymalnie dziewięciu próbek wody na jednej 96-dołkowej czarnej mikropłytce.
2. Wlać około 5 ml pierwszej próbki do zbiornika pipety i za pomocą pipety 8-kanałowej pipetować pipetami 200 μl do wszystkich studzienek w kolumnie 1 mikropłytki. Wyrzuć zużyte końcówki do pipet i powtórz w razie potrzeby dla każdej próbki wody, aby wypełnić kolumny 1-9.

3. Ustawianie kontroli próbki, standardu, hartowania i podłoża

1. Skonfiguruj kontrole, aby uwzględnić próbki, wzorce, podłoże i hartowanie na tej samej czarnej mikropłytce, co próbki (rysunek 2).
2. Próbki kontrolne zawierają próbkę wody i bufor wodorowęglanowy i nie są wykorzystywane w obliczeniach aktywności, ale będą wykazywać spójność odczytu przez cały czas trwania eksperymentu. Kontrole hartowania składają się z próbki wody i standardowej ilości znacznika fluorescencyjnego i służą do pomiaru dyfrakcji fluorescencji w próbce wody. Kontrole substratowe i standardowe składają się odpowiednio z połączonego z substratem lub standardowego znacznika fluorescencyjnego oraz buforu wodorowęglanowego.
3. Wlać około 5 ml 5 mM buforu wodorowęglanowego do czystego zbiornika na pipety. Odpipetować 50 μl buforu do dołków mikropłytki od 1 do 9 w rzędach D i E, aby utworzyć dwie duplikaty próbek kontrolnych na próbkę. Wymień końcówki pipet, a następnie przenieś 200 μl buforu wodorowęglanowego do studzienek od 10 do 12 w rzędach A i H.
4. Zmniejsz oświetlenie otoczenia, lub wyłączając światła, ponieważ standard fluorescencyjny jest wrażliwy na światło.
5. Wlać około 5 ml 10 μM 4-metylolumbelliferonu do czystego zbiornika na pipety. Odpipetować 50 μl do studzienek mikropłytki od 1 do 12 w rzędzie H, a do studzienek od 1 do 9 do rzędów G i F, aby utworzyć trzy powtórzenia kontroli hartowania na próbkę i ogólne kontrole standardowe. Umieść mikropłytkę w ciemności lub przykryj nieprzezroczystą pokrywką, aby zmniejszyć degradację MUB przez światło.
6. Włącz fluorometr i skonfiguruj niezbędne oprogramowanie, aby być gotowym do odczytu przed dodaniem substratu. Uwaga: niektóre żarówki fluorometryczne mogą wymagać czasu nagrzewania wynoszącego 3 minuty lub więcej.
7. Wlać około 5 ml odpowiedniego substratu połączonego z MUB (np. fosforanu 4-MUB) do czystego zbiornika na pipety. Za pomocą 12-kanałowego pipetora pipetować 50 μl do dołków mikropłytek od 1 do 12 w rzędzie A oraz do dołków od 1 do 9 w rzędach B i C, aby utworzyć trzy powtórzone testy dla każdej próbki i trzy kontrolne substraty. Natychmiast przejdź do kroku 4.1, rejestrując fluorescencję.

4. Rejestracja fluorescencji

1. Odczytać wstępną fluorescencję natychmiast po dodaniu substratu do mikropłytki. Po odczytaniu fluorescencji należy inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej (22 °C) w ciemności lub przykryć nieprzezroczystą pokrywką w celu zmniejszenia degradacji MUB przez światło.
2. Czas inkubacji wymagany do zmierzenia maksymalnej potencjalnej aktywności enzymu w próbce wody będzie zależał od stężenia enzymu w próbce. Ponieważ nie jest to znane przed zakończeniem testu, mikropłytka będzie musiała zostać odczytana w wielu krokach czasowych. Zazwyczaj odczyt w odstępach 10-15 minut w ciągu 1 godziny jest dopuszczalny dla wielu enzymów, chociaż próbki o bardzo wysokiej aktywności niektórych enzymów mogą osiągnąć szczyt przed 10 minutami.
3. Kontynuuj czytanie fluorescencji w mikropłytce w wyznaczonych odstępach czasu przez co najmniej 1 godzinę. Upewnij się, że mikropłytka jest zakryta lub w ciemności między odczytami.

5. Obliczanie aktywności enzymu na objętość wody

1. Dla każdej próbki w każdym przedziale czasowym obliczyć: średnią początkową fluorescencję próbki (studzienki D i E), średnią fluorescencję próbki końcowej (studzienki A-C), średnią fluorescencję wzorcową (studzienki H10-11) i średnią fluorescencję kontrolną tłumienia (studzienki F-G).
2. Dla każdego przedziału czasowego oblicz aktywność enzymu w nmolach ^{hr-1 ml-1} z równania:

Aktywność enzymu = (średnia fluorescencja próbki - średnia początkowa fluorescencja próbki) / ((średnia fluorescencja wzorcowa / 0,5 mola) x (średnia fluorescencja kontrolna tłumienia / średnia fluorescencja standardowa) x (0,2 ml) x (czas w godz.))

3. Sprawdź wartości aktywności obliczone dla każdego kroku czasowego. Określ ostateczną potencjalną aktywność na podstawie kroku czasowego z najwyższą aktywnością. Jeśli wartości aktywności będą nadal rosły, mogą być wymagane późniejsze kroki czasowe; Jeśli wartości aktywności spadną w trakcie biegu, uruchom ponownie z krótszymi krokami czasowymi. Końcowa aktywność jest w nmolach zużytego substratu ^{hr-1 ml-1}, ale może być skalowana w górę do ekspresji jako μmole ^{hr-1 L-1}.

Wyniki

Gleby i osady wodne zazwyczaj wykazują znaczną aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych w wyniku obecności przytwierdzonych społeczności mikrobowych (biofilmów) rozwijających się na powierzchni cząstek. Rysunek 3 pokazuje, jak aktywność ta zmienia się w zależności od wielkości cząstek pobranych z osadu powierzchniowego strumienia trzeciego rzędu w północnym Mississippi, USA. Wcześniejsze badanie wykazało, że społeczności bakteryjne na cząstkach osadu z tego strumienia można podzielić na trzy odrębne grupy n...

Dyskusja

Określenie aktywności różnych mikrobiologicznych enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie i osadach może dostarczyć użytecznych informacji na temat tempa mineralizacji składników odżywczych i przetwarzania materii organicznej¹⁷. Jednak gleby mogą różnić się poziomem wilgotności, dlatego ważne jest, aby ustandaryzować aktywność do suchej masy gleby. Wymaga to dodatkowego etapu suszenia (zwykle trwającego dwa dni) poza samym pomiarem aktywności enzymów. Tak więc, w przeciwieństwie do testów aktywności enzymów w prób...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODCZYNNIKI I MATERIAŁY
Glacial acetic acid			Różni dostawcy
Octan sodu	Różni dostawcy
		sodu	Różni dostawcy
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Dostępne zamienniki
p-nitrofenyl (pNP)-fosforan	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glukopiranozyd	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetyloglukozaminid	Sigma	N9376	p Podłoże NP
Przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki	Fisher	12-563-301	Dostępne zamienniki
96-dołkowe bloki głębinowe	Costar	3958	Dostępne zamienniki
Aluminiowe szalki			wagowe Różni dostawcy
Sterylne probówki			Różni dostawcy
Sterylne probówki			wirówkowe 50 mlRóżni dostawcy
4-metylombellitryron	Sigma	M1381
4-metylombliferyl (MUB)-fosforan	Sigma	M8883	MUB-substrat
4-MUB-glukopiranozyd	Sigma	M3633	MUB-substrat
4-MUB-N-acetyloglukozaminid	Sigma	M2133	MUB-substrat
Wodorowęglan			Różni dostawcy
96-dołkowa mikropłytka	Costar	3792
		na pipety	Różni dostawcy
EQUIPMENT
Wirówka	Eppendorf	5810R
Wirnik wirówki	Eppendorf	A-4-81	Do mikropłytek/bloków
głębinowychCzytnik mikropłytek	BioTek	Synergy HT	Dostępne zamienniki
Fluorometr do mikropłytek	BioTek	FLx 800	Dostępne alternatywnie
pipety			Różni dostawcy