Prosta i skuteczna metoda wykrywania aktywacji czynnika jądrowego w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej

Summary

Neutrofile to najliczniejsze leukocyty we krwi. Neutrofile pełnią funkcje regulowane transkrypcją, takie jak produkcja cytokin prozapalnych i hamowanie apoptozy. Funkcje te można badać za pomocą przedstawionej tutaj metody, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikację czynników jądrowych za pomocą cytometrii przepływowej w izolowanych jądrach

Abstract

Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami we krwi obwodowej. Komórki te jako pierwsze pojawiają się w miejscach zapalenia i infekcji, stając się w ten sposób pierwszą linią obrony przed inwazyjnymi mikroorganizmami. Neutrofile pełnią ważne funkcje przeciwdrobnoustrojowe, takie jak fagocytoza, uwalnianie enzymów litycznych i produkcja reaktywnych form tlenu. Oprócz tych ważnych funkcji obronnych, neutrofile wykonują inne zadania w odpowiedzi na infekcję, takie jak produkcja cytokin prozapalnych i hamowanie apoptozy. Cytokiny rekrutują inne leukocyty, które pomagają usunąć infekcję, a hamowanie apoptozy pozwala neutrofilom żyć dłużej w miejscu infekcji. Funkcje te są regulowane na poziomie transkrypcji. Ponieważ jednak neutrofile są komórkami krótkożywymi, badanie odpowiedzi regulowanych transkrypcją w tych komórkach nie może być przeprowadzone za pomocą konwencjonalnych metod genów reporterowych, ponieważ nie ma skutecznych technik transfekcji neutrofili. W tym artykule przedstawiamy prostą i skuteczną metodę, która pozwala na detekcję i kwantyfikację czynników jądrowych w izolowanych i znakowanych immunologicznie jądrach za pomocą cytometrii przepływowej. Opisujemy techniki izolowania czystych neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej, stymulowania tych komórek przeciwciałami antyreceptorowymi, izolowania i znakowania immunologicznego jąder oraz analizy jąder za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana do wykrywania czynników jądrowych NF-κB i Elk-1 w jądrach neutrofili i innych typów komórek. W związku z tym metoda ta stanowi opcję analizy aktywacji czynników transkrypcyjnych w izolowanych jądrach z różnych typów komórek.

Introduction

Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami we krwi obwodowej ¹. Podczas stanu zapalnego i infekcji neutrofile są pierwszymi komórkami, które pojawiają się w dotkniętym chorobą miejscu, gdzie działają jako pierwsza linia obrony ². Neutrofile posiadają kilka mechanizmów przeciwdrobnoustrojowych ³ w tym fagocytozę, wytwarzanie reaktywnych form tlenu, uwalnianie enzymów litycznych przez degranulację i wytwarzanie cytokin prozapalnych ^4,5. Neutrofile to krótkotrwałe komórki, które szybko ulegają aktywacji poprzez sygnalizację z różnych receptorów na powierzchni komórki. Chociaż neutrofile są uważane za komórki terminalne ze względu na ich krótkie życie i dlatego, że ulegają apoptozie, chyba że zostaną aktywowane podczas procesu zapalnego ⁶, obecnie jest jasne, że mogą również modyfikować swój fenotyp poprzez zmianę poziomu transkrypcji poszczególnych genów. Produkcja cytokin ⁵ i hamowanie apoptozy ^7,8 to dwie ważne, zależne od aktywacji funkcje komórkowe regulowane na poziomie transkrypcji w neutrofilach. Czynnik jądrowy κB (NF-κB) uczestniczy w transkrypcyjnej kontroli produkcji cytokin ⁴ oraz w regulacji przeżycia i apoptozy ^{komórek 9-11} w różnych typach komórek.

Szlaki sygnałowe, które prowadzą do aktywacji czynnika jądrowego, są zazwyczaj badane za pomocą testów genów reporterowych lub testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA). Ponieważ jednak neutrofile są komórkami krótkożywymi, badanie odpowiedzi regulowanych transkrypcją w tych komórkach nie może być przeprowadzone za pomocą testów genów reporterowych, ponieważ nie ma skutecznych technik transfekcji neutrofili. Testy EMSA zostały wykorzystane w neutrofilach do zbadania aktywacji czynników jądrowych ^12,13; Metodologia ta jest jednak skomplikowana i kosztowna, ponieważ wiąże się z wykorzystaniem materiału radioaktywnego. Nukleofekcja to kolejna technika, która jest z powodzeniem stosowana do transfekcji monocytów ¹⁴. Tak więc, przynajmniej w teorii, aktywacja czynnika jądrowego może być wykryta w neutrofilach przez transfekcję (pomimo niskiej wydajności). Technika ta byłaby jednak droższa, bardziej czasochłonna i prawdopodobnie mniej ilościowa. Analiza mikroskopowa komórek wybarwionych immunologicznie może być również wykorzystana do wykrycia czynników jądrowych w jądrze. Rzeczywiście, wykryliśmy w ten sposób translokację NF-κB do jądra ¹⁵. Niestety, technika ta jest również czasochłonna, mniej ilościowa i podatna na stronniczość obserwatora.

Tutaj prezentujemy prostą i efektywną metodę, która pozwala na wykrywanie i kwantyfikację czynników jądrowych w izolowanych i znakowanych immunologicznie jądrach za pomocą cytometrii przepływowej. Opisujemy techniki izolowania neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej, stymulowania tych komórek za pomocą integryn lub receptorów Fc z przeciwciałami antyreceptorowymi, izolowania jąder i immunoetykietowania oraz analizowania jąder za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 1). Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do wykrywania czynników jądrowych NF-κB ¹⁵ i ^{Elk-1 16} w jądrach neutrofili. Czułość tej metody pozwala na wykrycie niewielkich zmian w poziomach czynników jądrowych w jądrze. Metoda ta może być również stosowana do analizy poziomu czynników transkrypcyjnych w jądrach innych typów komórek.

Protocol

1. Izolacja neutrofili (PMN) z ludzkiej krwi

1. Należy użyć około 20 ml krwi ludzkiej z heparyną (10 j./ml) jako antykoagulantem. Krew pobrano od dorosłych, zdrowych ochotników metodą wenoppunktury. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Bioetycznej przy Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
2. Umieścić 2 ml 6% dekstranu T500 w PBS do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać 10 ml krwi. Wymieszaj, odwracając probówkę dwa lub trzy razy i pozostaw na 45 minut, aby umożliwić sedymentację erytrocytów.
3. Do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml wlej 5 ml Ficoll-Paque.
4. Weź osocze bogate w leukocyty, które utworzyło się nad osadzonymi erytrocytami, i ostrożnie pipetuj je na wierzchu Ficoll-Paque, tworząc drugą warstwę. Upewnij się, że są dwie fazy.
5. Wirować przy 516 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu, na styku osocza i Ficoll-Paque znajduje się warstwa komórek jednojądrzastych. Neutrofile znajdują się na dnie rurki.
6. Usunąć supernatant, rozbić osad komórkowy, stukając probówką o stojak, a następnie ponownie zawiesić komórki, dodając 10 ml zimnego (4 °C) PBS. nuta: Nie zaleca się ponownego zawieszania komórek poprzez pipetowanie w górę i w dół, ponieważ jest to zbyt szkodliwe dla komórek.
7. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 290 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
8. Rozbić osad komórkowy jak poprzednio i dodać 10 ml zimnego (4 °C) roztworu hipotonicznego (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) w celu lizy erytrocytów. Mieszaj, delikatnie obracając probówkę ręcznie przez dokładnie jedną minutę.
9. Dodać 10 ml zimnego (4 °C) roztworu hipertonicznego (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), wymieszać i policzyć komórki za pomocą hemocytometru (zwykle >95% to PMN).
   >nuta: Trzymaj probówkę z zawiesiną komórek na lodzie podczas liczenia komórek.
10. Odwirować jak poprzednio i ponownie zawiesić PMN w stężeniu 10⁷ komórek/ml w zimnym (4 °C) PBS. Przechowywać na lodzie.
    nuta: Neutrofile pozostają żywotne i funkcjonalne w temperaturze 4 °C przez około 6 do 8 godzin.

2. Aktywacja PMN

1. Umieścić 100 μl zawiesiny PMN (1 x 10⁷komórek/ml) w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
   nuta: Probówki z próbkami powinny być wykonane co najmniej w dwóch egzemplarzach. Zwykłe kontrole ujemne powinny obejmować tylko pierwsze przeciwciało i tylko przeciwciało drugorzędowe.
2. Dodać odpowiednie przeciwciało monoklonalne antyintegryny lub receptora anty-Fc (mAb) w stężeniu 10 μg/ml i inkubować na lodzie przez 15 minut.
3. Przemyć PMN, dodając 1 ml zimnego (4 °C) PBS, odwirowując przy 1,743 x g (4,500 obr./min) w mikrowirówce i odsysając supernatant.
4. Rozbij osad komórkowy, stukając dnem probówki o stojak, dodaj 1 ml zimnego PBS i umyj jeszcze dwa razy, jak w poprzednim kroku.
   nuta: Te płukania usuwają niezwiązane przeciwciała.
5. Zawiesić PMN w tej samej (początkowej) objętości ciepłego (37 °C) PBS zawierającego 60 μg/ml F(ab')2 koziego anty-mysiego IgG.
   nuta: Drugorzędowe przeciwciało anty-mysie IgG zwiąże się z pierwszym przeciwciałem antyreceptorowym i spowoduje sieciowanie receptora.
6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1–20 minut, w zależności od czynnika jądrowego będącego przedmiotem zainteresowania. Dla NF-κB zwykle 15 min, a dla Elk-1 zwykle 5 min.
   nuta: Inkubacja komórek w temperaturze 37 °C indukuje sieciowanie receptorów, które nie może mieć miejsca w temperaturze 4 °C.
7. Dodać 1 ml zimnego PBS i odwirować przez 3 minuty przy 1,743 x g w mikrowirówce.
8. Usunąć supernatant
9. Natychmiast zamrozić PMN w kąpieli z suchym lodem/etanolem i przechowywać tam przez 10 minut.

3. Izolacja i utrwalenie jąder

1. Zawiesić zamrożone granulki PMN w 100 μl zimnego (4 °C) buforu hipotonicznego (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ i 1 mM świeżo dodanego DL-ditiotreitolu [DTT]; pH = 7,9). Zaleca się wyjmowanie probówek z kąpieli z suchym lodem/etanolem jedna po drugiej i wytarcie dna probówki przed dodaniem buforu hipotonicznego.
2. Umieścić na lodzie i sprawdzić integralność jąder, barwiąc podwielokrotność zawiesiny jąder błękitem trypanowym. Jądra są okrągłe i niebieskie. Nienaruszony PMN nie ulega zabarwieniu, a szczątki komórkowe pojawiają się jako niebieskie cząstki o nieregularnym kształcie.
   nuta: Jeśli zawiesina jąder zawiera wiele nienaruszonych komórek lub szczątków, lepiej jest wyrzucić preparat i powtórzyć procedurę z inną próbką.
3. Odwirować jądra przy 775 x g (3 000 obr./min) w mikrowirówce przez 10 minut w chłodni. W tym momencie jądra są bardzo delikatne i należy zachować szczególną ostrożność, aby próbki były zimne i nie wirowały przy nadmiernych siłach.
4. Usunąć supernatant przez bardzo ostrożne pipetowanie.
5. Dodać 100 μl zimnego 4% paraformaldehydu do PBS, aby utrwalić jądra.
   nuta: Osad jest bardzo luźny i dodanie buforu wystarczy do ponownego zawieszenia jąder. Należy unikać pipetowania w górę i w dół.
6. Inkubować na lodzie przez 20 minut.
7. Jądra znakowane immunologicznie do cytometrii przepływowej lub przechowywać je do 24 godzin w temperaturze 4 °C.

4. Immunoznakowanie jąder do analizy cytometrii przepływowej

1. Odwirować jądra przy 1 743 x g (4 500 obr./min) w mikrowirówce przez 1 minutę i usunąć supernatant przez bardzo delikatne pipetowanie.
2. Dodać 100 μl zimnego (4 °C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldehydu w PBS do przepuszczalności jąder. Inkubować w lodzie przez 10 minut.
3. Odwirować permeabilizowane jądra w mikrowirówce o stężeniu 1,743 x g i ostrożnie usunąć supernatant. W tym momencie granulki jąder nie przyczepiają się dobrze na dnie rurki. Zaleca się ponowne odwirowanie, jeśli osad się poluzuje.
4. Zawiesić jądra w 500 μl zimnej 4% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania i inkubować na lodzie przez 20 minut. Odwirować jądra przy 1,743 x g przez 3 minuty w mikrowirówce i ostrożnie usunąć supernatant.
5. Zawiesić jądra w 100 μl zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 2,5 μg/ml mAb w stosunku do interesującego czynnika jądrowego. Inkubować na lodzie przez 20 min.
   nuta: Zwykłe kontrole ujemne powinny obejmować tylko przeciwciała przeciwko czynnikowi jądrowemu i tylko przeciwciała drugorzędowe znakowane FITC.
6. Przemyć dwukrotnie 500 μl zimnego PBS z 4% FBS i odwirować przy 1743 x g przez 3 min.
7. Bardzo ostrożnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić jądra w 100 μl zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 10 μg/ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego znakowanego FITC i inkubować na lodzie przez 20 minut.
8. Dwukrotnie przemyć jądra 500 μl zimnego PBS z 4% FBS, tak jak w poprzednim kroku.
9. Zawiesić jądra w 400 μl zimnego 4% paraformaldehydu w PBS.
   nuta: Jądra umieszcza się w paraformaldehydzie, aby umożliwić przechowywanie próbki przez kilka dni bez problemów z zanieczyszczeniem, które mogą wystąpić w obecności surowicy.
10. Natychmiast przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej lub przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do trzech dni.

5. Analiza cytometrii przepływowej

1. Analizuj jądra znakowane immunologicznie w cytometrze przepływowym, takim jak FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) lub podobne urządzenie.
2. Dostosuj ustawienia akwizycji do: FSC w skali logarytmicznej 10-1, SSC w skali logarytmicznej 196 i jąder bramki na wykresie kropkowym.
3. Pozyskaj dziesięć tysięcy jąder na próbkę.
4. Analiza fluorescencji jąder barwionych FITC przez kanał FL-1 (506 nm) ustawiony w skali logarytmicznej na 400.

Results

Opisana tutaj metoda oczyszczania zazwyczaj dostarcza niestymulowane neutrofile (PMN) o czystości większej niż 95% (Rysunek 1A). Wyizolowany PMN może być następnie stymulowany poprzez sieciowanie określonych receptorów za pomocą określonych przeciwciał monoklonalnych. Stymulowaliśmy PMN poprzez receptory Fc i integryny (ryc. 1B). Po stymulacji PMN ulega lizie, a jądra są izolowane z wysoką wydajnością. Jądra są następnie znakowane immunologicznie dla określonego czynnika jądrowego, taki...

Discussion

Opisana tutaj metoda oczyszczania pozwala na wyizolowanie w krótkim czasie niestymulowanych neutrofili (PMN) o czystości większej niż 95% (ocenianej na podstawie obserwacji mikroskopowej). Czasami neutrofile mogą być zanieczyszczone przez erytrocyty, jeśli te ostatnie nie są całkowicie zlizowane. Zwykle nie ma to wpływu na technikę, ponieważ erytrocyty i PMN można łatwo odróżnić jako odrębne populacje komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Wyizolowany PMN może być następnie stymulowany poprzez sieciowanie określonych...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ODCZYNNIKI
Heparyna	PiSA (Meksyk)
Dekstran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Dania)	T1-Dekstran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Chlorek sodu	Sigma	S7653
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma	S9638
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma	S9390
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A2153	Frakcja Cohna V
HEPES	Sigma	H3375
Chlorek magnezu bezwodny	Sigma	M8266
DL- ditiotreitol (DTT)	Sigma	D9163
Błękit trypanowy (0,4 % roztwór)	Sigma	T8154
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Surowica bydlęca płodu (FBS)	GIBCO	10437-028
Przeciwciało monoklonalne IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Przeciwciało monoklonalne anty-FcRII (CD32)
3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	anty-FcRIII (CD16)
specyficzne dla człowieka TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Podarowane przez dr Martina Hemlera	Anty-β specyficzne dla człowieka; 1 integryna (CD29)
Przeciwciało monoklonalne IB4	Uniwersytet Kalifornijski, San Francisco	Podarowane przez dr Erica J. Browna	Anty-β specyficzne dla człowieka; 2 integryna (CD18)
F(ab')2 kozia anty-mysia	kapsułka IgG (Aurora, OH)	55468
F(ab')2 kozia anty-mysia	kapsułka IgG (Aurora, OH)	55522
anty-królicza kapsułka IgG przeciw królikowi	Aurora, OH)	55665
anty-NF-κ B p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornia)	sc-114	Królicze przeciwciało poliklonalne
anty-NF-κ B p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Przeciwciało
EQUIPMENT
15-ml probówka wirówkowa	Corning	430791
50 ml	Wirówka 430291
Corning, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-metr	Corning	340
Pipeta Pipetman P-20	Pipeta Gilson	F123600
Pipetman P-200	Pipeta Gilson	F123601
Pipetman P-1000		Gilson
	Fisher Scientific	0267110 Mikroskop Nikon
		Eclipse E600
Mikroskop odwrócony		TMS
	Mikrowirówka Fisher Scientific	2IS-M
Mikrowirówka	Eppendorf	5414C
Eppendorf	5418
Cytometr przepływowy	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur