Artykuł metodologiczny

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

DOI:

10.3791/50425

⸱

14 listopada 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunohistochemistry (IHC) zapewnia wysoce specyficzną, wiarygodną i atrakcyjną wizualizację białek. Prawidłowe wykonanie i interpretacja wielokolorowego znakowania opartego na IHC jest wyzwaniem, zwłaszcza gdy jest wykorzystywane do oceny wzajemnych relacji między białkami docelowymi w tkance o wysokiej zawartości tłuszczu, takiej jak ośrodkowy układ nerwowy (OUN).

Nasz protokół stanowi udoskonalenie standardowej techniki znakowania immunologicznego, szczególnie dostosowanej do wykrywania zarówno strukturalnych, jak i rozpuszczalnych białek w OUN szczura i obwodowych węzłach chłonnych (LN) dotkniętych zapaleniem nerwów. Niemniej jednak, z dalszymi modyfikacjami lub bez, nasz protokół może być prawdopodobnie wykorzystany do wykrywania innych powiązanych celów białkowych, nawet w innych narządach i gatunkach niż przedstawione tutaj.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo wykorzystania zaawansowanych wysokoprzepustowych analiz wykonywanych na poziomie metylomu, transkryptomu czy nawet proteomu, barwienie immunologiczne pozostaje złotym standardem do wykrywania białek bezpośrednio w próbce tkanki, hodowli komórkowej lub rozmazie komórkowym. Ujawniając wzorzec lokalizacji/dystrybucji, immunohistochemia (IHC) może ocenić względne proporcje i wzajemne powiązania topograficzne docelowych białek, a nawet wskazać ich aktywność biologiczną. Dlatego IHC jest szeroko stosowany do celów klinicznych i badawczych, np. do diagnozy, oceny leczenia, badania mechanizmów chorobowych, zmian funkcjonalnych i fenotypowych w modelach zwierzęcych itp.

Zasadniczo obejmujący histologię, patologię, biochemię i immunologię, IHC znacznie się rozwinął od 1941 roku, kiedy to po raz pierwszy użyto fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał do identyfikacji antygenów pneumokokowych w zakażonej tkance 1. Wizualizacja produktów i komponentów komórkowych przez IHC opiera się na wiązaniu przeciwciał (Abs) z ich specyficznym antygenem (Ag). Oprócz stosowania przeciwciał znakowanych fluoroforem, reakcje immunologiczne można również uwidocznić za pomocą enzymów, takich jak peroksydaza 2,3 lub fosfataza alkaliczna 4. Ponadto przeciwciała koloidalne znakowane złotem5 są używane do wykrywania specyficznej interakcji antygen-przeciwciało zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej, podczas gdy znaczniki radioaktywne są wizualizowane za pomocą autoradiografii.

Reakcja immunologiczna Ag-Ab może być wykryta za pomocą metod bezpośrednich i pośrednich. Metoda bezpośrednia jest zasadniczo szybsza i prostsza, ponieważ wykorzystuje bezpośrednio oznaczone pierwotne Abs 6. Jednak ze względu na znaczny brak wrażliwości preferowane są metody pośrednie w stosunku do bezpośrednich. Dwuetapowe procedury wykrywania pośredniego wymagają nieoznakowanych pierwotnych Abs, jako pierwszego, i oznakowanego wtórnego Abs, skierowanego przeciwko pierwotnemu Abs, jako drugiej warstwy 7. Wzmocnienie sygnału można osiągnąć poprzez zastosowanie dalszego, sprzężonego z enzymem trzeciorzędowego Ab (trzyetapowa metoda pośrednia), który wiąże się z wtórnym Ab. Powszechnie stosowanymi metodami wykrywania pośredniego są awidyna-biotyna i peroksydaza-antyperoksydaza (PAP). Alternatywnie zamiast metody PAP można zastosować kompleks fosfatazy alkalicznej i fosfatazy antyalkalicznej (APAAP). Warto zauważyć, że metody fosfatazy alkalicznej (AP) wydają się być jeszcze bardziej czułe niż metody immunoperoksydazy 4. Metoda kompleksu awidyna-biotyna (ABC) wykorzystuje biotynylowany drugorzędowy Ab w połączeniu ze znakowanym kompleksem awidyna-biotyna (LAB) lub znakowanym kompleksem streptawidyna-biotyna (SLAB). Czułość wykrywania można dodatkowo zwiększyć poprzez zastosowanie awidyny znakowanej peroksydazą lub fosfatazą alkaliczną 8. Inne stosowane metody wykrywania to znakowanie polimerowe, amplifikacja tyraminy i koło immunowalcowania 9. Warto zauważyć, że różne metody wykrywania można łączyć w celu wielokrotnego wykrywania Ag w tej samej próbce tkanki, co po raz pierwszy opisano w 1978 r. 4. Przedstawione tutaj równoczesne podwójne barwienie immunologiczne przeprowadzono w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanki szczura przy użyciu odpowiednio przeciwciał drugorzędowych związanych z peroksydazą i sprzężonych z AP. Sygnały wizualizowano odpowiednio za pomocą chromogenu 3,3'-diaminoobcydyny (DAB) i kompleksu APAAP Fast Blue (FB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne
Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Szwedzkiej Krajowej Rady ds. Zwierząt Laboratoryjnych oraz Dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej (86/609/EWG) na podstawie zezwoleń etycznych N338/09, N15/10 i N65/10, które zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Zwierząt w Północnym Sztokholmie.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Perfuzja i utrwalenie
    1. Znieczulić zwierzę izofluranem w celu przeprowadzenia perfuzji przezsercowej przez lewą komorę. Rozpocząć płukanie naczyń krwionośnych solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia składników krwi, a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (PFA).
    2. Utrwal wypreparowane mózgi, rdzeń kręgowy i obwodową tkankę LN, zanurzając się w PFA. Po 24 godzinach w temperaturze 4 °C przenieść tkankę z PFA do PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania. Alternatywnie do komercyjnego PBS, rozpuścić 9 g NaCl w 250 ml buforu Sörensena i dodać 750 ml wody dejonizowanej (dH2O); przygotować 0,2 M bufor Sörensena (pH 7,4) rozpuścić 13,8 g NaH2PO4 x 1H2O i 71,2 g Na2HPO4 x 2H2O w 2,5 L dH2O.
  2. Odwodnienie i osadzanie
    1. Pokrój tkankę na porcje o grubości około 5 mm za pomocą żyletki.
    2. Rozpocznij proces utwardzania tkanek (odwodnienia) za pomocą procesora do infiltracji próżniowej Tissue-TekV.I.P (STANDARDOWA PROCEDURA POLEGAJĄCA NA ZANURZENIU W ROSNĄCYCH STĘŻENIACH ETANOLU, NASTĘPNIE KSYLENU I WRESZCIE PARAFINY (tabela 1).
    3. Umieść chusteczkę w formie i wlej płynną parafinę wokół próbki, aby utworzyć "blok parafiny". Długotrwałe przechowywanie wymaga temperatury pokojowej (RT). Jednak przed cięciem zaleca się schłodzenie bloków, np. przez noc (o/n) w temperaturze 4 °C.

2. Podział na sekcje

  1. Umieść blok parafiny w stałym uchwycie mikrotomu sań, który może poruszać się do tyłu i do przodu po nożu. Dostosuj optymalny kąt między blokiem a nożem mikrotomowym (zależy to od geometrii noża, ale także od prędkości i techniki cięcia).
  2. Wyciąć przekroje o grubości 3 - 5 μm z bloku parafinowego.
  3. Przenieś właśnie wycięty fragment do pojemnika na wodę, a następnie zamontuj go z wody na szklanym szkiełku.
  4. Ostrożnie dociśnij zamontowaną sekcję do ręcznika papierowego, aby usunąć resztki wody i potencjalne pęcherzyki powietrza. Zalecane są komercyjnie wstępnie powlekane szkiełka samoprzylepne.
  5. Suche zjeżdżalnie zamontowane przez kilka godzin w piecu w temperaturze 50 - 60 °C.

3. Deparafinowanie (nawodnienie i blokowanie endogennej peroksydazy)

  1. Zanurz szkiełka 2x w ksylenie (alternatywnie substytut ksylenu XEM-200), za każdym razem 15 - 20'.
  2. Spłucz w 99% etanolu.
  3. Aby zablokować endogenną aktywność peroksydazy, inkubuj skrawki przez 30' w roztworze metanolu zawierającym 0,25% nadtlenku wodoru.
  4. Kontynuuj nawadnianie, stosując etanol o zwiększonej zawartości wody (99%, 70%, kończąc w wodzie destylowanej.
  5. Od tego momentu, aż do momentu montażu szkiełek nakrywkowych, sekcje muszą być wilgotne.

4. Pobieranie antygenu

  1. Do gotowania szkiełek należy używać parowaru w roztworze do pobierania antygenu (w tym przypadku buforze EDTA pH 8,5) przez 60' (podstawowy roztwór buforowy EDTA zawiera 1,21 g Tris i 0,37 g EDTA rozpuszczonych w 50 ml dH2O; w celu przygotowania roztworu roboczego rozcieńczyć 2,5 ml roztworu podstawowego EDTA w 47,5 ml dH2O).
  2. Schłodzić szkiełka na RT przez ok. 1 godzinę, a następnie spłukać 3 - 5x buforowaną solą fizjologiczną Tris (TBS, stosować alternatywnie PBS) składającą się z 0,05 M Tris i 0,15 M NaCl; pH 7,5 skorygowane HCl. Alternatywnie użyj komercyjnego TBS.

5. Blokowanie nieokreślonych stron wiążących

  1. Aby uniknąć niespecyficznych reakcji tła, należy inkubować skrawki na RT przez 30' w roztworze blokującym zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 90% buforu DAKO.

6. Podwójne znakowanie immunologiczne: jednoczesna inkubacja z pierwotnym abs

  1. Rozcieńczyć wymaganą ilość przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze blokującym i inkubować o/n w temperaturze 4 °C. W celu podwójnego barwienia immunologicznego należy połączyć α-eotaksynę (Ccl11; 1:300) z α-Cd68 (Ed1; 1:1,000) lub α-Iba1 (Aif1, 1:1,000) lub α-Cd8α (Ox-8; 1:200).
  2. Przepłukać szkiełka 3-5x buforem TBS (użyć alternatywnie 10x rozcieńczonego buforu DAKO).
  3. Rozcieńczyć wymaganą ilość przeciwciał drugorzędowych (biotynylowane przeciwciała antykozie i anty-myszy sprzężone z AP, oba w stosunku 1:200) w roztworze blokującym i inkubować przez 1 godzinę na RT.
  4. Przepłukać szkiełka 3 - 5x buforem TBS (użyć alternatywnie 10x rozcieńczonego buforu DAKO).
  5. Inkubować szkiełka z kompleksem peroksydazy awidynowo-chrzanowej (HRP) rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Przepłukać szkiełka 3 - 5x buforem TBS (użyć alternatywnie 10x rozcieńczonego buforu DAKO).

7. Wizualizacja

  1. Wizualizacja związanego przeciwciała drugorzędowego znakowanego AP
    1. Przygotować 0,1 M bufor Tris-HCl, rozpuszczając 12,1 g Tris w 1 L dH2O i dostosować pH do za pomocą HCl. Użyj tego samego buforu Tris-HCl do przygotowania 1 M roztworu lewamizolu. Przygotować świeżo 4% roztwórNaNO2 w dH2O.
    2. Aby otrzymać 50 ml substratu Fast Blue (FB) (objętość wymagana dla jednej standardowej szklanej kuwety), rozpuścić 6,25 mg fosforanu naftol-AS-MX w 312,5 μl DMF w szklanej probówce i wymieszać z 50 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) buforu Tris-HCl. Aby rozpuścić 12,5 mg soli FB RR w 312,5 μl 2 N HCl, dodaj 312,5 μl wcześniej przygotowanego 4% roztworuNaNO2 i wymieszaj mieszaninę z tymi samymi 50 ml wstępnie podgrzanego buforu Tris-HCl. Lekko wstrząsać, aż żółty płyn stanie się klarowny, a na koniec dodać 77 μl wcześniej przygotowanego 1 M roztworu lewamizolu. Przefiltrować otrzymaną mieszaninę i wylać na szkiełka umieszczone w szklanej kuwecie.
    3. Rozpocząć inkubację w temperaturze 37 °C i kontrolować proces wywoływania pod mikroskopem świetlnym co ok. 15 - 30 minut. Jeśli stanie się rozmyty, zastąp roztwór FB świeżą mieszanką.
    4. Przepłukać szkiełka 3 - 5 razy buforem TBS, a następnie przenieść do bufora PBS.
  2. Wizualizacja związanego biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego
    1. Przygotować roztwór rozwijający DAB/H2O2 przez rozcieńczenie 1 ml roztworu podstawowego DAB (25 mg DAB na 1 ml PBS) w 49 ml PBS. Dodać 16,5 μlH2O2i przefiltrować przed wylaniem na sekcje.
    2. Konwersja chromogenu DAB w wytrącający się brązowy pigment może być natychmiastowa. Kontroluj proces wywoływania pod mikroskopem świetlnym (nawet kilka sekund dłuższej inkubacji może podnieść wysokie tło i zamaskować określony sygnał).
    3. Intensywność osadu brązowego pigmentu można alternatywnie zwiększyć przez inkubację w roztworze składającym się z 2% siarczanu miedzi i 0,9% NaCl przez 5'.
    4. Przepłukać szkiełka 3 - 5x PBS i na koniec dH2O, użyć alternatywnie wody z kranu.
    5. Szkiełka z szkiełkami nakrywkowymi należy montować bezpośrednio z wody za pomocą wodnego medium montażowego GelTol. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    6. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia medium montażowego, np. o/n w temperaturze 4 °C. Wysuszone szkiełka należy przechowywać na RT.
Rozdział 1.% Etanol20'40 °C
cyfra arabska.% Etanol60'40 °C
Rozdział 3.% Etanol90'40 °C
Rozdział 4.% Etanol60'40 °C
Rozdział 5.% Etanol90'40 °C
Lokal mieszkalny% Etanol60'40 °C
Rozdział 7.% Etanol90'40 °C
Rozdział 8.% Etanol120'40 °C
Rozdział 9.Ksylol30'40 °C
Rozdział 10.Ksylol60'40 °C
Rozdział 11.parafina60'60 °C
Rozdział 12.parafina60'60 °C
Rozdział 13.parafina60'60 °C
Rozdział 14.parafina120'60 °C

Tabela 1. Przetwarzanie tkanek przez procesor infiltracji próżniowej Tissue-TekV.I.P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podwójne barwienia immunologiczne (współbarwienia) przeprowadzono w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach OUN i LN szczurów. Plastry tkanek o grubości 3-5 μm zostały wycięte za pomocą mikrotomu sań, a następnie zamontowane na wstępnie pokrytych szkiełkach samoprzylepnych i potraktowane zgodnie z wcześniejszym opisem 10,11,12. Krótko, po deparafinowaniu, uwodnieniu tkanek i inaktywacji endogennej peroksydazy, skrawki poddano procesowi pobierania antygenu, a na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standardowe procedury IHC często wymagają określonych korekt w celu uzyskania optymalnego wyniku, co zwykle wiąże się z dużym doświadczeniem, ale także podejściem "prób i błędów". Od przygotowania tkanki do wizualizacji celu, prawie każdy krok w protokole może być poddany indywidualnie zaprojektowanym modyfikacjom w celu poprawy końcowego wyniku. Przedstawiony tutaj protokół podwójnego barwienia jest przykładem celowania w białka oparte na IHC, szczególnie dostosowane do oceny wzajemnych relacji między białkami docelowym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Hansowi Lassmannowi i Janowi Bauerowi za ich wskazówki i wsparcie. Dziękujemy również Katalin Benedek za doskonałą pomoc techniczną oraz Caroline Westerlund za krytyczną i językową ocenę.

To badanie było wspierane przez granty od Biogen Idec, Fundacji Wenner-Gren, Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych, Szwedzkiego Stowarzyszenia Osób z Niepełnosprawnościami Neurologicznymi, Szwedzkiej Fundacji Mózgu, EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) i Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (eter difluormetylowy) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O)Baxter1001936060Napromienianie oczu. Prawdopodobnie wpływa na płodność i uszkadza dziecko w macicy. Podawać tylko w odpowiednio wyposażonym środowisku anestezjologicznym.
Chlorek sodu (NaCl)Merck1.0604
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS), tabletkaSigma-AldrichP4417
Paraformaldehyd (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% w 1x PBSApl pharma34 24 28Zagrożenie dla zdrowia. . Łatwopalny. Ostra toksyczność.
Alkohol etylowy ≥ 99,5%, bezwzględny (CH3CH2OH)Sigma-Aldrich459844-1LŁatwopalny.
Ksylen (Ksyleny, stopień histologiczny; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056Łatwopalny. Ostra toksyczność.
Histo-Comp Wosk parafinowyTissue-TekV0-5-1001
Adhezyjne szkiełka mikroskopoweStarfrostMIC-1040-W
Substytut ksylolu XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200Działanie uczulające na drogi oddechowe. Rakotwórczość.
α-CD8 (Ox-8) mysi antyszczur, pierwszorzędowe przeciwciałoAbD SerotecMCA48G
α-Iba1 (AIF1) mysie przeciwciało przeciw szczurom, pierwszorzędowe przeciwciałoMilliporeMABN92
α-CD68 (ED1) mysie przeciwciało przeciwszczurze, pierwszorzędowe przeciwciałoAbD SerotecMCA341R
&alfa;-eotaksyna C-19 (CCL11) kozie przeciwciało przeciw szczurom, pierwszorzędowe przeciwciałoSanta Cruz BTSC-6181
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fosfatazą alkaliczną (AP)Dakopatts, DaniaD0314
Biotynylowane przeciwciało drugorzędoweAmersham BiotechRPN1025
Avidin-kompleks peroksydazy chrzanowej (HRP) Sigma-AldrichA3151
Fosforan naftolu AS-MX (C19H18NO5P)Sigma-AldrichN4875-1GOstra toksyczność.
Szybka niebieska sól RR, azoiczny diazo nr 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)Sigma-AldrichFBS25
Chlorowodorek lewamizolu (C11H13ClN2S)Sigma-Aldrich31742Ostra toksyczność.
Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB Chromogen)DAKOS3000Wysoce łatwopalny. Toksyczny.
Siarczan miedzi (CuSO4)Merck1.02791Toksyczność ostra. Środowiskowe zamieszanie.
GelTol Wodne medium montażoweThermo Electron Corporation230100
Nadtlenek wodoru, 30% (H2O2)Merck107210Ostra toksyczność.
Metanol (CH3OH)Fluka65543Toksyczność ostra. Uczulenie na drogi oddechowe. Rakotwórczość. Łatwopalny.
Tris (hydroksymetylo)aminometan, zasada TRIS (C4H11NO3 )AppliChemA1379Działanie drażniące na skórę i oczy.
Tris Sól fizjologiczna buforowana (TBS), tabletkaSigma-AldrichT5030
Di-Wodorofosforan sodu dwuwodny (Na2HPO4 x 2H2O)Merck1.0658
Diwodorofosforan sodu jednowodny (NaH2PO4 x 1H2O) Merck1.06346
Surowica cielęca płodu (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO bufor do płukania cytomacji 10x DAKOS3006Należy przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C w celu zahamowania rozwoju bakterii. Unikaj pienienia.
N,N-dimetyloformamid; DMF (C3H7NO)Fluka40250Łatwopalny. Ostra toksyczność.
Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 36 mm Menzel-Glä serBB024036A1
Kwas solny, stężenie (HCl)Sigma-Aldrich30721, drażniące, przenikające. Substancja uczulająca na płuca (w postaci kwaśnej mgły). Toksyczny.
Roztwór kwasu solnego objętościowy, 2 M HCl (2 N)Fluka71826, drażniący, przenikający. Substancja uczulająca na płuca (w postaci kwaśnej mgły). Toksyczny.
Azotyn sodu, ReagentPlus, ≥ 99,0% (NaNO2)Utleniacz Sigma-AldrichS2252. Toksyczny. Niebezpieczny dla środowiska.
Kwas etylenodinitrotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454Narażenie doustne może powodować skutki reprodukcyjne i rozwojowe.
Sprzęt
Tissue-TekV.I.P Procesor infiltracji próżniowejSakura5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Sanki bazowe Hacker-Bright serii 8000 Mikrotom Instrumenty
Domowy parowar BraunMultiGourmet FS 20
Mikroskop świetlny Leica Polyvar 2
hakerskie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794(2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
  26. Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunohistochemiaprzygotowanie tkanekods anianie antygen wmikroskopia wietlnazatapianie w parafinieobwodowe w z y ch onneprzeciwcia a pierwszorz doweprzeciwcia a drugorz doweawidyna peroksydaza chrzanowa

Powiązane artykuły